Micro et nanotechnologies appliquées à la médecine régénérative: conception d'une neuro-prothèse active. INSERM U825 Isabelle LOUBINOUX LAAS-CNRS Christophe VIEU Services de Neurologie Hôpital Purpan 31059 TOULOUSE
Contexte du projet AVC = 1ère cause de handicap acquis chez l adulte Patient ayant subi un AVC Cerveau lésé localement Plasticité Cérébrale Récupération fonctionnelle? 1. Réorganisation 2. Rétablissement Appel à d autres réseaux compensatoires. Reconstitution du réseau autour de la lésion, à partir de cellules souches endogènes Phénomènes naturellement faibles et insuffisants Stratégie thérapeutique : 1. Amplification, 2. Reconstruire dans la lésion Mise au point d un système implantable afin de régénérer localement le cerveau lésé
Localisation de l implant lésion Relier les cellules implantées au faisceau cortico-spinal Régénérer des neurones Vue d artiste, cerveau, capsule interne et moelle épinière Schéma anatomique, vue en coupe du cerveau et du haut de la moelle épinière
Innov-in-Stroke: thérapeutique innovante Cellules souches nanotechnologies Régénérer un faisceau corticospinal (neurones) Longue distance Cellules souches Neurones humains + astrocytes immatures GFAP Greffe dans M1 Tuj-1 Greffe dans la lésion et en périphérie Gaillard et al., Nature Neurosciences 2007 Corticospinal tract (red) CNRS-LAAS Nano-matériaux: Prothèse Polymère: PLGA Polycarboprolactone Silicone: PDMS
Innov-in-Stroke Matériel : cellules souches neurales adultes humaines Prélèvement: Région sous-épendymaire de la corne temporale des ventricules latéraux. Origine: Chirurgie pour épilepsie résistante aux traitements médicamenteux Neurochirurgien: JC Sol prélèvement Cellules souches Cellules + astrocytes prolifératrices Neurones humains immatures hippocampus Lateral ventricule GFAP Post-doctorante: L Vaysse Nestin Tuj-1 1 semaine post-différentiation Nestin+ Alexia 568 B3-tubulin + Alexia 488
Innov-in-Stroke Matériel : cellules souches neurales adultes humaines. EFS-PM (Etablissement Français du Sang- Pyrénées Méditerranée : plateforme GMP (Good Medical Practices) en vue d un essai clinique CIC de Biothérapie : mettre au point les conditions de culture aussi proches que possible des GMP; définir les Procédures Opératoires Standard développer des étapes de culture cellulaire pour l expansion des cellules souches adultes dans un cadre BPL valider le procédé de culture de grade clinique, élaboration des critères de libération des produits à greffer et transfert de ces activités au service d ingénierie cellulaire de l EFS-PM Qualité Sécurité
Ce qui se passe naturellement Nombre de cellules souches dans le cerveau limité Notre Action Propositions de solutions Augmenter le nombre de cellules souches Transplantation chirurgicale Cellules contribuant peu à la reconstruction nécessaire Relier la zone lésionnelle au faisceau cortico-spinal Introduction d un support créant un lien physique entre les deux zones Direction de croissance des axones Diriger la croissance axonale aléatoire Microstructurer la surface de la prothèse Stimuler la différenciation des cellules souches et leur croissance 1. Agents pharmacologiques 2. Utiliser les propriétés des nanotubes de carbone Concevoir et réaliser une prothèse
Innov-in-Stroke Croissance dirigée Elongation Rétraction
Prothèse: cahier des charges
Prothèse: fabrication 1. La microstructuration est réalisée par moulage Salle blanche: Bonnes Pratiques de Fabrication Moule en Si Réseaux de microsillons de 5, 10,15 et 20µm de largeur Timbre en PDMS
Prothèse: fabrication 2. La microstructuration est adaptée à la culture de cellules 2.5cm 4 réseaux de lignes (5, 10, 15 et 20µm de largeur). 4.5cm Lame de verre Puits de culture amovibles Lame de verre Support de PDMS microstructuré Puits de culture amovibles Support de PDMS microstructuré
Prothèse: fabrication 3. La microstructuration est adaptée à la mise en forme de l implant Dimensions de l implant pour le rat Diamètre de 0.4mm Longueur de 5 mm Bon alignement Rotation manuelle Capillaire de verre Conception et réalisation d un outil simple permettant une mise en forme de l implant
Différentiation neuronale et croissance en étoile Neurosphères Contrôle Neurosphère: Neurones immatures Support : PDMS sans microstructures 2ème jour post-différentiation Noyaux (DAPI bleu) béta-3 tubuline (rouge) Actine (vert)
Différentiation neuronale et croissance dirigée sur implant Neurosphères, cellules isolées PDMS microstructuré : bosses et sillons de 10µm de largeur Neurones immatures 2ème jour post-différentiation 10 µm 10 µm Support microstructuré en PDMS (silicone) Noyaux (bleu) béta-3 tubuline (rouge) Doctorante LAAS-ITAV: Amélie Béduer Post-doctorante INSERM: Laurence Vaysse
Différentiation neuronale et croissance dirigée sur implant Cellules isolées (Sanofi-Aventis) PDMS microstructuré Neurones 2ème jour post-différentiation immatures PDMS sans microstructures 5 µm 5 µm béta-3 tubuline (rouge) Noyaux (bleu) Actine
10µm 40µm L10_S40 µm 20µm 20µm LS20µm Rôle important de l arrête? 10µm 10µm LS10µm LAAS: 5µm 5µm LS5µm Christophe Vieu Childerick Severac Amélie Béduer Christelle Martin
Observation de neurones au Microscope électronique à balayage 10 µm
Observation de neurones au Microscope électronique à balayage 20 µm Observation de neurones au Microscope confocal (plateforme d imagerie cellulaire RIO Toulouse)
Pourquoi des nanotubes de carbone sur notre implant? Selon la littérature : -Améliore l adhérence des cellules -Améliore l activité synaptique -Favoriserait la différenciation - Marquage IRM de l implant Adhérence de cellules neuronales à des nanotubes de carbone Les substrats comportant les NTC augmentent spontanément l activité synaptique des neurones Lovat et Al. Nanoletters, Vol 5. pp 1107-1110, 2005. Carbon nanotubes substrates boost neuronal electrical signaling.
Différentiation neuronale et croissance dirigée sur implant Nanotubes de carbone Dimensions compatibles avec les dendrites/axones interactions Conducteurs du courant électrique «pont» électrique entre les neurones Nanotubes de carbone Neurones immatures Support microstructuré en PDMS (silicone) Université-CIRIMAT E. Flahaut Noyaux (bleu) Phalloïdine de l Actine (vert)
S. Benderbous, M2R T. Dubois Nanotubes de carbone MEB Gadolinium Gadonanotubes SE T2 TR/TE = 3s/30ms Agent paramagnétique
Innov-in-Stroke: thérapeutique innovante Nanotechnologies, Cellules souches humaines, Neuroimagerie Comportement Imagerie IRM Culture Cellulaire Tuj-1 Modèle animal/lésion Injection de la toxine dans M1: malonate (inhibiteur d enzyme mitochondrial) Bregma +0.5 mm Electrophysiologie Histologie B3-tubulin + Alexia 488 Nanotechnologies
Innov-in-Stroke Fonctionnalité in vivo Tests comportementaux Electrophysiologie IRM fonctionnelle aimant 7T TMS: Stimulation magnétique transcrânienne Activation Lésion PEM Recrutement d aires cérébrales qui prennent en charge la motricité après la lésion I. Loubinoux M. Simonetta-Moreau
Innov-in-Stroke Fonctionnalité in vivo Tests comportementaux Performance Semaine 1 57% Déficit sur la force n=5 lésés / n=2 sham 7 16 17
Innov-in-Stroke Fonctionnalité in vivo TMS: Stimulation magnétique transcrânienne PEM M. Simonetta-Moreau I. Loubinoux PEM Faisceau Réticulospinal + Corticospinal + autres PEM Réponse diminuée du côté affecté par rapport au côté sain
Innov-in-Stroke Suivi IRM non-invasif chez le rat, primate et homme Tracer le faisceau corticospinal, IRM de Diffusion les aires recrutées, les cellules greffées IRM fonctionnelle DTI Rat: 7T Biospec, Bruker Laboratoire de RMN Biologique Ph Méric, Gif-sur-Yvette Agent de contraste IRM: Aires qui prennent en charge la fonction motrice après AVC Human: 3T, Philips, inserm U825 Loubinoux, Cerebral cortex 2007 GRID: Gadolinium-Rhodamine dextran S. Benderbous
Innov-in-Stroke: thérapeutique innovante Cellules souches humaines, nanotechnologies, neuroimagerie
Nanomatériaux CNRS-LAAS/ITAV: C. Vieu; C. Severac; C. Martin; A. Béduer Université-CIRIMAT: E. Flahaut; F. Seichepine; C. Talmaciu Etablissement Français du sang: P. Bourin, S Fleury, M Gadelorge CIC-BT: L. Buscail, F. Gross Extension des Locaux sur Purpan: Equipe 1: F. Cassot S. Benderbous (PU) I. Berry (PU-PH) F. Gimbert (Doc) C. Cielas (TC) Equipe 2: F. Roux (PUPH) Hôpital: contrat d interface I. Loubinoux Innov-in-stroke Cellules souches et Nanotechnologies JC. SOL (PU/PH) L. VAYSSE (Post-doc) M. SIMONETTA (MCU/PH) F. ARNAUDUC (TC) F. CONCHOU (AERC ENVT) S. Marques (M2R) Animalerie primates CNRSCERCO 2010: Pavillon Baudot IFR 96 IRM 3T homme/primate 2011: IRM 7T petit animal 2012: Animalerie rongeurs 2012: Laboratoire de culture cellulaire CNRS-Laboratoire de RMN Biologique Gif-sur-Yvette P. Méric Animalerie rongeurs M. Daussion Sanofi-Aventis
Animalerie rongeurs Culture cellulaire Prélèvements Nanomatériaux IRM 3T 7T Animalerie primates EFS CIRIMAT Purpan ITAV SanofiAventis Rangueil Prélèvements Culture Cellulaire CIC-BT CERCO Animalerie primates LAAS
Conclusion U825: - NeuroImagerie fonctionnelle - Essais cliniques - Ouverture vers la biologie cellulaire - Ouverture vers l expérimentation animale (rongeurs, singes) Projet innovant, ambitieux, risqué Partenaires, compétences, infrastructures Perspectives: patient post-avc.