Réplication de l ADN

Réplication de l ADN

Réplication de l ADN: expériences historiques

I] Expérience de Meselson et Stahl

Replication de l ADN est semie-conservative Expérience de Meselson et Stahl :1958 -Cultive E.Coli sur milieu contenant uniquement de l isotope lourd N15, pendant plusieurs générations. -Bactéries sont lavées et mises à cultiver sur milieu contenant uniquement N14 pendant une génération. Parental N15/N15 1 ière génération N15/N14

II] Mise en évidence des ADN polymérases et du mécanisme de la réplication: in vitro

IIa] Synthèse in vitro Arthur Kornberg (père) a réalisé la première synthèse d ADN in vitro: -ADN -dntp marqué au P32 pour montrer l incorporation de la radioactivité dans la chaine néoformée. L idée étant de ne pas utiliser des dnmp pourtant constituant de La chaine d ADN. -DNApol de E.coli à partir d extrait grossier -Précipitation des macromolécules par ajout d un acide organique (sépare l ADN ayant incorporé de la radioactivité des dntp P32. Cette expérience prouve que qu une synthèse in vitro d ADN peut être effectuée mais ne démontre pas le mécanisme semi-conservatif et que l ADN néo synthétisé est «actif». Il s est avéré que Kornberg a utilisé la DNApol I

IIb] Synthèse in vitro d un ADN biologiquement actif par un mécanisme semi-conservatif -actif? Capacité d infection d un ADN de bactériophage FX174. ADN SB circulaire de 5000 nucléotides (brin+). -But recréer in vitro le cycle du bactériophage. -1 problème: comment lier le brin- après synthèse. Ligase. -2 problème : comment séparer brin+ et brin- 5-bromodésoxy-uridine. -3 problème: le brin- n étant pas infectieux, il faut resynthétisé un brin+ à partir de ce brin-. Après purification seul le brin+ néoformé est infectieux.

III] Notion de fourche de réplication Expérience de Cairns

Réplication de l ADN

I] ADN polymérases Ia] E. Coli -ADN pol I -ADN pol II -ADN pol III: réplicase

Activitées -Activité 5-3 polymérase -Activité 3-5 exonucléase -Activité 5-3 exonucléase

Ib] Phages

Ic] ADN polymérases eucaryotes supérieurs -DNApol b: réparation de l ADN, pas d activité exonucléase. Levure ADN pol II -DNApol e: synthèse du brin continu. réparation -DNApol g: ADN mitochondrial. -DNApol a-primase: complexe qui synthétise des amorces d ARN-ADN pour le brin avancé (précoce), synthétise les fragments d Okazaki du brin retardé (tardif). Pas d activité exonucléase. Primase Levure ADN pol I -DNApol d: principale, brin retardé, possède une activité 3 5 exonucléase. (Pol III ). Intervient également dans la réparation. Levure ADN pol III

Domaines catalytiques des ADN pol

Id] Amorces Différent types d amorces utilisées par les ADN pol

Synthèse discontinue et synthèse continue

I] Synthèses

II] ligase Ligation des fragments d Okazaki

III] Autres protéines

IV] Procaryotes ADN pol III

Replication

V] Eucaryotes

VI] Terminaison -Procaryotes

-Eucaryotes?

VII] Origine de la fourche de réplication: procaryotes Ori C

VII] Origine de la fourche de réplication: eucaryotes

Transcription

I] Mécanisme général

II] Synthèse des ARNs

III] Différentes étapes de la transcription

ARN polymerase et transcription: procaryote (E. Coli)

I] ARN polymérase

II] promoteur et facteur s Régions d ADN reconnues par l ARN pol Régions de s interagissant avec l ADN

Facteurs s et exemple d infection par le phage SPO1

III] Autres enzymes

-Intrinséque IV] Terminaison

-Rho dépendante

-Facteur antiterminaison

ARN polymerase et transcription: eucaryote

ARN polymérases eucaryotes Enzyme Position Produit Activité relative ARN polymérase I Nucléole ARN ribosomal 50-70% ARN polymérase II Nucléoplasme ARN hétérogéne nucléaire 20-40% ARN polymérase III Nucléoplasme ARNt, petits ARN ~10%

Facteurs auxiliaires -Facteurs généraux: nécessaires à l initiation de la synthèse des ARNm au niveau de Tous les promoteurs. Facteurs généraux + ARNpol: appareil de transcription élémentaire -Facteurs en amont: reconnaissent de courtes séquences d ADN. Activité non régulée. -Facteurs inductibles: reconnaissent de courtes séquences d ADN appelées éléments de réponse.

Facteurs de transcription

I] ARN polymérase II

II] Transcription par l ARN pol II: reconnaissanceinitiation

II] Transcription par l ARN pol II: initiation-élongation

III] Méthodes d études des promoteurs

III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples

Principe du gène rapporteur Transfection transitoire Gène rapporteur Analyse de l expression du gène rapporteur Promoteur

III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples

Chloramphénicol Acétyl Transférase Gamme étalon

III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo 2) Exemples

Luciférine Luciférase

III] Méthodes d étude d un promoteur 1) Utilisation d un gène rapporteur a) Principe b) CAT: Chloramphénicol Acétyl Transférase c) Luciférase d) Béta-Galactosidase et GFP: étude in vivo e) Exemple d étude: promoteur de la b-globine 2) Technique de Footprinting 3) Technique de retard sur gel

Gènes rapporteurs: b-galactosidase et GFP

2) Etudes de promoteurs:exemples

Méthodes d étude des facteurs de transcription 1) Technique de Footprinting 2) Technique de retard sur gel

Footprinting

SP1 Exemple de Footprinting: site SP1 SP1 Promoteur: WT Muté

Méthodes d étude des facteurs de transcription 1) Technique de Footprinting 2) Technique de retard sur gel

Technique du retard sur gel Dépots Piste A: fragment d ADN* sans extrait nucléaire Piste B: mélange de l ADN* et des protéines nucléaires

Technique du gel super retard Dépots ADN*+ Protéines+ Anticorps ADN*+ Protéines ADN*

Exemple de l élément en cis: Mu

IV] Facteurs de transcription et inhibitions

V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Mécanisme général

V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Exemple de la protéine TAT

V] Mécanisme d action des facteurs de transcription -Notion de co-activateur

L Enhancer est situé souvent à plusieurs kpb du promoteur, la question est donc de savoir:comment un Enhancer peut-il stimuler l initiation de la transcription?

Rôle d un Enhancer

VI] Mécanisme de terminaison de la transcription

Gènes morcelés

Exemple du gène de la globine

Epissage alternatif

Epissage alternatif

Coiffe

Site consensus d épissage nucléaire chez les eucaryotes supérieurs Boite de branchement (A/C)AGGU(A/G)AGU UAUAAC YnN(C/U)AGG(G/U)

Principe général

UAUAAC Mécanisme: in vitro UAUAAC UAUAAC UAUAAC

Réactions chimiques: estérifications

Le spliceosome -RNP (ribonucléoprotéines) contenant les ARNsn (small nucleus) -50-60 RNPsn/spliceosome -RNPsn directement impliquées dans l épissage: U1, 2, 4, 5 et 6 -RNPsn: les ARNsn lie au moins 1 protéine appartenant à la famille des Pt Sm sauf ceux de U6 (Lsn) -Autres protéines non Sm: facteurs d épissage.

Exemple : RNPsn U1

Mécanisme: in vivo Exon1-Exon2 Intron

Autres types d épissage eucaryotes

Exemple de mécanisme de l épissage alternatif Si ASF/SF2 Si SF5

Notion d épissage en Trans

Epissage des ARNt

Mécanisme d épissage des ARNt

Mécanisme de terminaison des ARNm polya+

Mécanisme de terminaison des ARNm polya-