ETUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTEINE INTEGRASE DES RETROVIRUS ET APPLICATION EN TRANSGENESE

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté Par Julie CHARMETANT Pour l obtention du diplôme de l Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTEINE INTEGRASE DES RETROVIRUS ET APPLICATION EN TRANSGENESE Soutenu le, 16 décembre 2005 devant le jury suivant Dr Thierry DUPRESSOIR Dr Geneviève CORDIER Pr Gérard VERDIER Dr Corinne RONFORT Président du jury Responsable EPHE Examinateur Directeur Scientifique Laboratoire EPHE Interactions cellulaires, rétrovirus et cancer Dr Geneviève CORDIER UMR 754 INRA-ENVL-UCBL, Lyon Genevieve.cordier@univ-lyon1.fr Laboratoire Rétrovirus et pathologies comparée UMR 754 INRA-ENVL-UCBL, Lyon Equipe : Rétrovirus et intégration rétrovirale Corinne.ronfort@univ-lyon1.fr Pr Jean François MORNEX Dr Corinne RONFORT ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES EPHE Banque de Monographies SVT 1

SCIENCES DE LA VIE ET DELA TERRE ETUDE FONCTIONNELLE ET STRUCTURALE DE LA PROTEINE INTEGRASE DES RETROVIRUS ET APPLICATION EN TRANSGENESE Julie CHARMETANT Résumé Les rétrovirus sont des virus à ARN dont le génome est converti en un ADN double brin. Et insérer dans le génome de la cellule cible. L étape d intégration met en jeu deux éléments majeurs : l intégrase et les séquences situées aux extrémités du génome viral appelés séquences att (attachement). La protéine intégrase réalise l insertion des deux extrémités virales en un même site de l ADN de la cellule selon un processus appelé intégration concertée. Notre étude vise à une meilleure compréhension du processus d intégration et une caractérisation plus précise de la protéine intégrase. Les travaux présentés ont été réalisé in vitro sur deux modèles d intégrase : l intégrase du virus RAV-1 (Rous Associated Virus type 1) appartenant à la famille des ALSV (Avian Leukemia and Sarcoma Viruses), et l intégrase d un lentivirus, le virus HIV-1 (Human ImmunoDeficiency Virus type1). L analyse de la structure et des fonctions des mutants ponctuels L19A, V79A, S85T et I146A de l intégrase du virus RAV-1 dans les différents tests (activité catalytique, liaison à l ADN et oligomérie) à permis de mieux comprendre le rôle de ces résidus et de l enzyme dans le processus d intégration (L19A) et dans la multimérisation et la liaison à l ADN (V79A et S85T) de la protéine. De plus, l importance de chacune des extrémités virales a été analysée dans ce système. On a ainsi pu mettre en évidence que la présence d une seule extrémité virale est suffisante pour réaliser un processus d intégration concertée mais avec une efficacité et une qualité réduite et ceci plus fortement en absence des deux extrémités. En ce qui concerne la protéine intégrase du virus HIV-1, le travail à permis la mise en place d un système d étude in vitro de l intégration concertée similaire à celui développé pour l intégrase de RAV-1 mais qui doit encore être amélioré. Pour l utilisation des propriétés intégratives de l intégrase en transgènése le travail présente des résultats préliminaires qui nécessitent d être validé en les appliquant dans des transgènéses proprement dites. Mots clés: Rétrovirus Intégrase RAV-1 HIV-1 Intégration Concertée. Sommaire Liste des abréviations Introduction... Préambule... Chapitre 1 : Présentation des rétrovirus... 4 1. Les différents genres de rétrovirus... 4 2. Structure et génome des rétrovirus... 5 3. Le cycle de réplication des EPHE Banque de Monographies SVT 2

rétrovirus... 7 Chapitre II : L étape d intégration rétrovirale... 8 1. Transport du complexe de préintégration dans le noyau... 8 2. L étape d intégration... 9 3. Les méthodes d étude de l intégration... 10 4. Rôle de la séquence att dans l étape d intégration... 12 Chapitre III : La protéine intégrase... 13 1. Structure et fonction des différents domaines de l intégrase... 13 2. Structure oligomérique de l intégrase... 1 3. Le développement d inhibiteurs de l intégrase... 18 Chapitre IV : Application en transgénèse... 21 Objectifs de l étude... Bibliographie... 2 Liste des abréviations ADN Acide Desoxyribonucléique RT Reverse transcriptase ALSV Avian Leukemia and Sarcoma RTC Reverse Transcriptase Viruses Complexe ALV Avian Leukemia Virus SFV Simian Foamy Virus AMV Avain Myeloblastosis Virus SIDA Syndrome ARN Acide Ribonucléique d'immunodéficience ASV Avian Sarcoma Virus Acquise Att attachement supf gène suppresseur de BAF Barrier Autointegration Factor mutation amb BLV Bovine leukemia virus TM Transmembranaire CA Capside Zn Zinc DMSO DiMethylSulfOxide DKA Diketo Acids FIV GFP HIV HMG HPLC HTLV IN IPTG kda LTR MA MLV Mg Feline Immunodeficiency Virus Green Fluorescent Protein Human Immunodeficiency Virus High Mobility Group Chromatographie Liquide à Haute Pression Human T Leukemia Virus Intégrase Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside Kilo Dalton Long Terminal Repeat Matrice Murine Leukemia Virus Magnésium EPHE Banque de Monographies SVT 3

Mn Mo-MLV NC NLS pb pbs PCR PEG PIC PI ppt PR RAV RMN RSV Manganèse Moloney Murine Leukemia Virus Nucléoprotéine Nuclear Localisation Signal paire de base primer binding site Polymerase Chain Reaction PolyEthylene Glycol Complexe de pré-intégration Proteases Inhibitor Polypurine tract Protease Rous Associated Virus Résonnance Magnétique Nucléaire Rous Sarcoma Virus Chapitre 1 : Présentation des rétrovirus Les virus sont des particules infectieuses présentes chez les animaux comme chez les végétaux. Leur classification se fait par rapport à la morphologie de la particule virale, la nature de l acide nucléique et leur stratégie de réplication. Les Retroviridae ou rétrovirus sont des virus à ARN enveloppés. Leur réplication se caractérise par une étape de transcription inverse (passage d ARN simple brin en ADN double brin) et par une étape d intégration du génome viral au sein de l ADN de la cellule infectée. Ils représentent une famille large et diversifiée et sont la cause de pathologies animales et humaines diverses. 1. Les différents genres de rétrovirus. La famille des Rétroviridae se compose de 7 genres selon le huitième Comité International de Taxonomie des Virus (d après l ICTV, 2005): les Alpharétrovirus, les Betarétrovirus, les Gammarétrovirus, les Epsilonrétrovirus, les Deltarétrovirus, les Spumavirus et les Lentivirus. Les 5 premiers genres sont des virus à potentiel oncogénique pouvant induire des tumeurs variées. Certains virus peuvent porter un oncogène et être responsables de tumeurs aigues avec une période de latence très courte, c est le cas des virus ASV (Avian Sarcoma Viruses). Ceux ci sont délétés d une partie de leur génome empêchant leur réplication lors de l intégration dans le génome cellulaire. Pour se répliquer, ils ont besoin d un autre virus, apportant en trans les fonctions nécessaires à leur réplication. D autres oncovirus ne portent pas d oncogènes mais sont activateurs d oncogènes cellulaires, c est le cas des virus ALV (Avian Leukemia Virus). Ces deux types viraux ASV et ALV sont regroupés au sein d une même espèce : les virus ALSV. Les spumavirus présentent certaines différences avec les autres rétrovirus au niveau de leur réplication. Ils sont caractérisés par des infections persistantes sans signe clinique. Ils comprennent des virus tels que le SFV (Simian Foamy Virus) (Lecellier and Saib, 2000). Les lentivirus sont des rétrovirus non oncogènes isolés chez les primates et d autres mammifères. Ils sont responsables de maladies chroniques à évolution lente dont les signes cliniques EPHE Banque de Monographies SVT 4

ne se manifestent qu après des mois voire des années. Le représentant le plus connu est le HIV, l agent causal du SIDA. 2. Structure et génome des rétrovirus 2.1. Structure de la particule virale. La taille du génome des rétrovirus varie de 7 à 12 kb. Ce génome est composé de deux molécules d ARN linéaire, simple brin et de polarité positif. Ces ARN associés à des protéines sont logés dans la capside. Celle-ci est entourée d une enveloppe phospholipidique contenant les glycoprotéines de l enveloppe : la protéine transmembranaire (TM) et la protéine de surface (SU) qui interviennent au niveau de la fixation du virus à la cellule. La protéine de matrice (MA), tapisse la face interne de l enveloppe virale, et permet l association de celle-ci. 2.2. Génome des rétrovirus Selon la composition du génome, on distingue les rétrovirus avec un génome simple des rétrovirus avec un génome complexe. Les rétrovirus complexes comprennent les spumavirus, les lentivirus et le virus HTLV-BLV du genre Deltarétrovirus (Human T-cell Leukemia Virus-Bovine leukemia virus). Les autres rétrovirus possèdent des génomes simples. Le génome des rétrovirus simples comme les ALV, est composé de trois gènes. Le gène gag (pour group-specific antigen), le gène pol (pour polymerase) et le gène env (pour enveloppe glycoprotéin) codant pour des protéines de structure et des enzymes. A l extrémité du génome se trouvent les séquences terminales non codantes, les LTRs (Long Terminal Repeat) renfermant le promoteur (LTR 5 ) et le site de polyadenylation (LTR 3 ) Le gène gag code un précurseur polypeptidique (Pr gag) dont le clivage enzymatique produit trois protéines majeures : la CA, la MA, présente sur la face interne de l enveloppe virale, et la nucléoprotéine (NC) qui interagit avec l ARN génomique. Ces protéines jouent un rôle dans la structure et l assemblage du virion. Les protéines issues du gène pol proviennent d un précurseur polypeptidique codé à partir des séquences gag et pol. Le gène pol code des enzymes virales obtenues après clivage du précurseur polypeptidique (Pr gag-pol). Il code essentiellement la transcriptase inverse (RT) et l integrase (IN). L enzyme protéase (PR) peut être codée soit par le gène gag, soit par le gène pol selon le type de virus. La RT est une ADN polymérase ARN dépendante qui permet la transcription inverse de l ARN viral en ADN double brin complémentaire. La PR permet de cliver les précurseurs polypeptidiques Pr gag et Pr gag-pol conduisant à l obtention de particules virales matures. L IN a pour rôle majeur d intégrer l ADN double brin nouvellement formé dans le génome cellulaire. Le gène env code un précurseur polypeptidique qui, après glycosylation, est clivé pour donner les glycoprotéines de l enveloppe virale : la TM et la SU. La protéine SU constitue le ligand pour le récepteur primaire permettant la fixation du virus à la surface de la cellule hôte. La protéine TM, qui est ancrée dans la membrane cellulaire, est responsable, avec ses domaines hydrophobes, de la fusion de l enveloppe virale et de la membrane cellulaire. Ces trois gènes sont présents chez l ensemble des rétrovirus réplicatifs. Certains virus au potentiel oncogénique ont inséré un oncogène dans leur génome entraînant la perte d une partie de EPHE Banque de Monographies SVT 5

celui-ci. Ces virus sont alors défectifs pour leur réplication et nécessitent la présence d un virus assistant ou «helper» pour pouvoir se répliquer. C est le cas par exemple de MC29 qui contient l oncogène myc et nécessite un virus ALV pour se répliquer (Colby et al., 1983). Les rétrovirus complexes possèdent des gènes supplémentaires codant des protéines régulatrices et accessoires. Par exemple le génome d HIV-1 comprend deux gènes codant des protéines régulatrices, Tat et Rev. Tat jouerait un rôle lors de la transcription du génome viral, la prolifération et la différentiation des cellules infectées (Pugliese et al., 2005). Rev interviendrait dans le transport de l ARN viral du noyau vers le cytoplasme. De plus, son génome contient des séquences codantes pour des protéines accessoires telles que Nef, Vpr, Vpu et Vif (Freed, 2001; Steffens and Hope, 2001). La protéine Nef serait indispensable pour maintenir une forte charge virale dans les cellules infectées. De nombreuses fonctions de la protéine Vpr ont été décrites pour la réplication du virus (arrêt du cycle cellulaire en phase G2, transport du complexe de préintégration et modulation de l apoptose)(le Rouzic and Benichou, 2005). La protéine Vpu serait un régulateur de l expression des récepteurs CD4 et interviendrait dans la libération des particules virales nouvellement formées. La protéine Vif est indispensable pour la réplication du virus dans certaines cellules comme les lymphocytes du sang périphérique, les macrophages et certaines lignées cellulaires. Un rôle important de cette protéine réside dans son action inhibitrice sur le facteur APOBEC3G. Ce facteur a été décrit comme un inhibiteur naturel de la réplication de HIV-1, il agit en désaminant l ARN viral, produisant des virus défectifs. Ainsi, Vif, en neutralisant APOBEC3G, permet une réplication correcte du virus (Revue dans Navarro and Landau, 2004). 3. Le cycle de réplication des rétrovirus Le cycle de réplication des rétrovirus se déroule en 8 étapes allant de la pénétration de la particule virale dans la cellule hôte jusqu à la production de nouvelles particules infectieuses. 1. La pénétration de la particule virale dans la cellule cible se fait par interaction entre la SU et un récepteur spécifique présent à la surface cellulaire. Pour HIV, le récepteur CD4 est le premier récepteur cellulaire identifié (Bour et al., 1995). Mais l interaction avec le récepteur CD4 n est pas suffisante pour permettre l internalisation du virus, deux corécepteurs ont été identifiés: le corécepteur α- chemokine CXCR4 et le corécepteur α- chemokine CCR5 (Freed, 2001). L interaction entraîne un changement de conformation des protéines de l enveloppe et une fusion entre l enveloppe virale et la membrane cellulaire, libérant la nucléocapside dans le cytoplasme. Pour certains des rétrovirus, la fusion des membranes à lieu directement après la fixation de celui-ci sur le récepteur cellulaire alors que pour d autres le virus est internalisé par endocytose (fusion de l enveloppe virale avec un endosome) (Buchschacher, 2001). 2. Après pénétration de la particule virale, celle-ci est partiellement dégradée entraînant la libération de son contenu. L étape de transcription inverse est réalisée au sein d un complexe multiprotéique RTC (Reverse Transcriptase Complexe). Elle permet la synthèse d une molécule d ADN double brin à partir de la matrice d ARN et fait intervenir la RT. Cette étape nécessite deux séquences du génome viral : la séquence PBS (Primers Binding Site) et la séquence PPT (Polypurine tract). 3 et 4. Les deux étapes suivantes : l importation nucléaire du complexe de préintégration (PIC) EPHE Banque de Monographies SVT 6

et l intégration du génome viral au sein du génome de la cellule cible seront détaillées dans le chapitre suivant. 5. Le génome intégré sera transcrit en utilisant la machinerie cellulaire de la cellule infectée. 6. Certains ARN viraux sont traduits, permettant la formation de nouvelles protéines indispensables aux particules virales. 7. Une fois synthétisées les nouvelles protéines virales seront assemblées autour de deux molécules d ARN. Cette étape se fait grâce à la séquence d encapsidation située à l extrémité 5 du génome rétroviral. 8. La dernière étape est la maturation et la libération par bourgeonnement des particules infectieuses nouvellement formées. Chapitre II : L étape d intégration rétrovirale L intégration est une étape importante dans le cycle de réplication des rétrovirus : sans elle le cycle s arrête. Cette étape nécessite l introduction de la particule virale dans le noyau. 1. Transport du complexe de préintégration dans le noyau Une fois l ADN viral formé après l étape de transcription inverse dans le cytoplasme, le complexe RTC se réorganise en un autre complexe multiprotéique, le complexe de préintégration (PIC). Le PIC est composé de l IN et de l ADN viral. Il a été montré, après isolement de ce complexe dans des cellules infectées par HIV-1, la présence d autres protéines virales dont le rôle n est pas toujours bien défini. Ces autres protéines sont, pour HIV, la protéine MA, la RT, la NC et la protéine Vpr. De plus, des protéines cellulaires ont été identifiées. Les plus étudiées sont HMG I(Y) (High Mobility Group) et BAF (Barrier to Autointegration Factor) (Mansharamani et al., 2003; Harris and Engelman, 2000; Miller et al., 1997). BAF est incorporé dans le PIC au niveau du cytoplasme (Mansharamani et al., 2003) et empêcherait l auto intégration de l ADN viral. Il intéragit également avec une autre protéine cellulaire, la Lamina-associated polypeptide 2α (LAP2α) au sein du complexe d intégration. BAF interviendrait aussi dans la formation du PIC. Ce rôle a été démontré au sein du PIC de Mo-MLV (Moloney Murin Leukemia Virus)(Suzuki et al., 2004) et d HIV-1 (Lin and Engelman, 2003; Harris and Engelman, 2000; Chen and Engelman, 1998). Le rôle des protéines de la famille des HMG a été décrit pour HIV-1 (Hindmarsh et al., 1999) et pour ASV (Aiyar, 1996) dans des réactions d intégration in vitro. La protéine HMG-I(Y) pourrait être impliquée dans l interaction avec l ADN viral (Hindmarsh et al., 1999). D autres protéines cellulaires ont été identifiées comme interagissant avec la protéine intégrase d HIV, par exemple la protéine Integrase Interactor 1 (INI1) qui est présente dans le noyau et aurait pour rôle d orienter le PIC dans celui-ci (Boese et al., 2004; Turelli et al., 2001). Pour les oncorétrovirus, la pénétration du PIC dans le noyau se fait lors de la division cellulaire. En effet, il a été montré pour Mo-MLV que l entrée du PIC dans le noyau a lieu pendant la mitose lorsque l enveloppe nucléaire est déstructurée (Roe et al., 1993). Cependant après identification de séquences NLS (Nuclear Localization Sequence) sur l IN des virus ASV, l import de EPHE Banque de Monographies SVT 7

l ADN a été testé sur des cellules bloquées au niveau du cycle cellulaire. Les résultats montrent que cet oncorétrovirus peut pénétrer dans le noyau de certaines cellules ne se divisant pas (neurones et cellules bloqués au niveau du cycle cellulaire) (Katz et al., 2002). Par contre, les rétrovirus du genre lentivirus sont capables d infecter des cellules qui ne sont pas en division, le PIC pénètre donc dans le noyau sans rupture de la membrane nucléaire. Des signaux de type NLS ont été identifiés sur les protéines MA et IN d HIV, et deux séquences de fixation aux pores nucléaires ont été trouvées au niveau de Vpr (Vodicka, 2001). Par ailleurs, la présence d une séquence DNA flap central au niveau de l ADN viral semble importante pour le transport nucléaire du PIC d HIV-1. En effet, un ADN viral sans la séquence DNA flap se retrouve accumulé au voisinage de la membrane nucléaire (Zennou et al., 2000). Le PIC pourrait donc passer par des pores nucléaires appelés nucléosporines via un transport actif du complexe. Cependant le mécanisme exact de transport dans le noyau n est pas défini (Sherman and Greene, 2002). 2. L étape d intégration L ADN viral se présente avec des extrémités franches correspondant aux séquences LTRs. Il a été montré que ces extrémités s organisent au sein d un complexe protéique appelé «intasome» (Vora et al., 2004; Wei et al., 1997). Les deux extrémités de l ADN viral forment, après rapprochement au moment de l intégration, la séquence att (pour attachement) : c est cette séquence qui sera reconnue par l intégrase. Elle contient à chaque extrémité une séquence CANN sur le brin 3 dont le doublet CA est très conservé entre les différents rétrovirus. Au cours du processus les deux nucléotides terminaux seront éliminés. Au niveau de l ADN cellulaire, l intégration du génome viral entraîne une duplication de quelques paires de bases de chaque coté de l ADN viral. La taille de cette duplication est spécifique de chaque virus, 6 pb pour les virus ALSV et 5 pb pour HIV-1 (Asante-Appiah and Skalka, 1997). 2.1. Partenaires de l intégration Ce mécanisme met en jeu l ADN viral, l ADN de la cellule infectée, la protéine intégrase, et fait intervenir des protéines cellulaires. La protéine intégrase intervient sous forme multimérique et son action sera décrite plus précisément dans le chapitre 3. Les protéines cellulaires qui pourraient jouer un rôle au sein de la réaction d intégration sont les protéines ayant été identifiées dans le PIC (BAF, HMG-I(Y)) et d autres protéines interagissant avec l intégrase comme LEGDF/p75 qui est un co-activateur transcriptionnel intervenant au niveau de l étape d intégration (Emiliani et al., 2005). 2.2. Mécanismes mis en jeu La première étape de l intégration est le clivage des deux nucléotides terminaux aux deux extrémités 3 de l ADN viral (Miller et al., 1997; Roth et al., 1989; Hughes et al., 1981). Ce clivage entraîne la libération de deux extrémités CA-3 -OH et nécessite la présence de molécules d eau. L analyse de l ADN viral isolé dans des cellules infectées montre que cette première étape de l intégration a lieu dans le cytoplasme des cellules infectées directement après l étape de rétrotranscription (Asante-Appiah and Skalka, 1997). La deuxième étape est la ligation des extrémités EPHE Banque de Monographies SVT 8

3 OH avec les deux brins de l ADN de la cellule cible. Le groupe hydroxyle libéré en 3 réalise une attaque nucléophile au niveau de l ADN cellulaire par un mécanisme de transestérification qui entraîne la ligation de l extrémité 3 virale avec l'extrémité 5' de l'adn cellulaire (Engelman et al., 1991). La coupure de l'adn cellulaire a lieu à quelques paires de bases de distance. Après intégration, il en résulte donc une brèche de chaque coté de l ADN viral, La dernière étape consiste donc à une réparation et un remplissage, elle est effectuée par des enzymes cellulaires. Ceci explique les duplications observées sur le génome de la cellule cible. 2.3. Sites d intégration Le site d intégration de l ADN viral au sein du génome de la cellule hôte semble aléatoire, cependant des études montrent que pour ASLV l intégration a lieu préférentiellement hors des régions de transcription. Par contre, pour HIV, l intégration se fait préférentiellement au niveau de gènes actif dans la cellule et pour MLV, l intégration se fait préférentiellement au niveau de site d initiation de transcription (Barr et al., 2005). Ces résultats confirment que si l intégration n as pas lieu sur un site précis du génome de la cellule cible, on observe des sites préférentiels spécifiques à chaque virus (Mitchell et al., 2004). 3. Les méthodes d étude de l intégration Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu dans le processus d intégration, différents tests in vitro ont été développés: des tests d activité de l IN permettant d étudier chaque étape du mécanisme séparément (tests des constantes catalytiques) et un test portant sur le mécanisme global d intégration (test d intégration concertée). 3.1 Mesure des constantes catalytiques de la protéine intégrase. La mesure des activités catalytiques se fait par trois tests différents reproduisant les deux premières étapes de l'intégration. Ces mesures sont réalisées avec la protéine intégrase purifiée à partir de vecteur bactériens, de virus, ou encore à partir de cellules juste après infection. Ces tests utilisent des oligonucléotides de synthèse mimant la séquence att des extrémités du génome viral (Moreau et al., 2003; Hindmarsh and Leis, 1999). Les deux premiers tests mesurent l activité catalytique de l IN pour les deux premières étapes du mécanisme d intégration. Le dernier test met en place une réaction inverse de la réaction de ligation : la réaction de désintégration. Cette réaction inverse a été observée uniquement in vitro et son existence in vivo est peu probable (Chow et al., 1992). Cette activité dépend uniquement du site catalytique de l enzyme, son intérêt est donc de déterminer si le site catalytique de la protéine est fonctionnel. Ces mesures des constantes catalytiques de la protéine intégrase sont importantes et ont permis de mieux comprendre le mécanisme d intégration et la fonctionnalité de la protéine intégrase. Dans un premier temps, elles ont permis de montrer que l intégrase était capable à elle seule de réaliser la réaction de clivage et la réaction de ligation (Bushman et al., 1990). Puis elles ont permis de déterminer le rôle des différents domaines de le protéine ou encore le rôle d acides aminés particuliers de cette protéine (Moreau et al., 2002; Balakrishnan and Jonsson, 1997; Engelman et al., 1993; Katz et al., 1992). EPHE Banque de Monographies SVT 9

3.2. L intégration concertée in vitro On parle d intégration concertée car in vivo l insertion des extrémités virales a lieu simultanément sur un même site de l ADN cellulaire. Le test d'intégration développé in vitro pour reproduire cette intégration concertée a été réalisé afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et le rôle des protéines cellulaires et virales. Cette reconstitution de l'intégration in vitro nécessite plusieurs éléments (Moreau et al., 2002; Sinha et al., 2002; Hindmarsh and Leis, 1999; Vora et al., 1994) : - Un plasmide receveur qui représente l'adn cible qui peut être sous forme super-enroulé ou circulaire, - La protéine IN purifiée à partir de bactéries (production par un vecteur d'expression) ou à partir de virions, - L'ADN donneur, qui varie selon le virus étudié. Il est de petite taille (environ 300 pb) et se compose d un gène de sélection et selon les virus, ces 10 à 20 nucléotides terminaux des séquences LTRs. Dans certaines expériences des protéines cellulaires ou virales ont été ajoutées afin d améliorer l efficacité du test. L ajout de la protéine HMG-I (Y) pour favoriser in vitro la formation du complexe ADN donneur / IN, ou encore de la protéine BAF (Harris and Engelman, 2000). Enfin, la protéine NC (Viral Nucleocapsid protein) peut être ajoutée car, avec son domaine en doigt de zinc, elle favoriserait l intégration (Carteau et al., 1999). Le test d intégration concertée in vitro sera utilisé dans cette étude et décrit plus en détail dans la partie résultats. L intérêt de ce test est qu il mime l intégration existant in vivo. En effet, in vitro on observe bien la délétion des deux nucléotides terminaux de l extrémité de l ADN viral et une duplication de quelques paires de base au niveau de la jonction entre ADN donneur et plasmide receveur de taille identique à celle observée in vivo. 4. Rôle de la séquence att dans l étape d intégration. L utilisation du système d intégration concertée in vitro a servi à évaluer l importance de cette séquence att et plus particulièrement du doublet CA, très fortement conservé, (Aiyar et al., 1996), et des nucléotides en positions adjacentes à ce doublet : les nucléotides en positions 3-7 des extrémités des virus ALSV et du virus HIV-1 (Brin and Leis, 2002a; Hindmarsh et al., 2001; Aiyar et al., 1996). Les mutations des séquences situées à proximité du doublet CA provoquent une baisse d intégration aussi importante que la substitution du doublet lui-même dans le cas d HIV. La mutation du doublet CA a plusieurs conséquences comme la baisse de l'efficacité d'intégration globale et des variations de la taille de duplication à la jonction entre ADN donneur et plasmide receveur : 6-7 au lieu de 5 pour HIV (Brin and Leis, 2002a). Par ailleurs, ces auteurs ont montré que les positions 17-20 des séquences du génome viral reconnues par l intégrase d HIV-1 étaient nécessaires pour une bonne efficacité d intégration concertée. D autres études ont cherché à définir les relations entre les séquences U3 et U5 reconnues EPHE Banque de Monographies SVT 10

par l intégrase au cours du processus d intégration, en étudiant l effet d un ADN donneur ne contenant que l une ou l autre des séquences. Ces études ont été réalisées pour l intégrase des ALSV (Aiyar et al., 1996) et pour l intégrase de HIV-1 (Brin and Leis, 2002a). La perte d une séquence du génome viral de l ADN donneur que ce soit U3 ou U5, affecte le processus d intégration. Pour HIV- 1, les résultats montrent une baisse de 89% d intégration quand l extrémité U5 n est pas présente et une baisse de seulement 10 % lorsque c est l extrémité U3. La séquence U5 est donc plus importante pour le processus d intégration que la séquence U3 (Brin and Leis, 2002b). Au contraire, la réduction du processus est plus forte lorsque c est la séquence U3 qui n est pas présente avec l intégrase d ASV. Il semble donc que pour ASV, ce soit la séquence U3 la plus importante pour le processus d intégration (Hindmarsh et al., 2001; Aiyar et al., 1996). Ces résultats montrent un rôle différent des deux séquences du génome viral U3 et U5 et leur importance pour catalyser la réaction d intégration (Brin and Leis, 2002b). Chapitre III : La protéine intégrase Comme il a été souligné précédemment, la protéine IN est indispensable au processus intégratif des rétrovirus. 1. Structure et fonction des différents domaines de l intégrase L alignement de la séquence primaire de différentes IN de rétrovirus (Johnson et al., 1986) et des réactions de protéolyse ménagée (Engelman and Craigie, 1992) ont permis d identifier trois domaines structuraux comportant des résidus conservés. Ces domaines sont le domaine N terminal, le domaine central comportant le site catalytique et le domaine C terminal, moins conservé. 1.1. Le domaine N-terminal 1.1.1. Structure La structure du domaine N terminal en solution a été déterminée par spectroscopie à résonance magnétique nucléaire (RMN) (Cai et al., 1997; Eijkelenboom et al., 1997) et par cristallographie sur l IN d HIV (Wang et al., 2001). Le domaine N terminal a été cristallisé sous forme dimérique, chaque monomère comprend 4 hélices α et quatre résidus très conservés entre les différentes intégrases des rétrovirus constituant le motif HHCC. Il s agit des histidines en position 9 et 13 pour ALSV et 12 et 16 pour HIV-1, et des cystéines en position 37 et 40 pour ALSV et 40 et 43 pour HIV-1. Des domaines HHCC similaires retrouvé sur d autres protéines ont été proposés pour former une structure en «doigt de zinc» (Burke et al., 1992). En testant la capacité de l IN à fixer des ions Zn 2+, Bushman et al. (Bushman et al.,1993) ont montré que des mutations au niveau du motif HHCC entraînaient une baisse significative de la fixation du zinc (Bushman et al., 1993). Ce motif interagit donc avec un ion Zn 2+ mais diffère des structures en doigt de zinc classique. L analyse de la structure du domaine N terminal en solution par RMN montre que le zinc permet la stabilisation de la configuration des hélices α de ce domaine (Eijkelenboom et al., 1997). On observe aussi que la présence de zinc favorise la tétramérisation de l intégrase d HIV (Lee et al., 1997; Zheng et al., 1996) EPHE Banque de Monographies SVT 11

et la dimérisation du domaine N terminal de l IN du virus Mo-MuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (Yang et al., 1999). 1.1.2. Rôle dans le mécanisme d intégration La délétion du domaine HHCC (Khan et al., 1991), ou la mutation des deux cystéines de ce domaine (Bushman and Wang, 1994) réduit l activité catalytique de l enzyme pour la réaction de clivage. De plus, des protéines mutantes ayant échangées leur domaine HHCC, sont toujours capables de reconnaître les séquences virales qui leur sont associées. Par exemple, une protéine constituée du domaine N terminal et C terminal de HIV-1 et du domaine central de l IN du Visna Virus reconnaît aussi bien un substrat ayant les extrémités U3 et U5 du virus Visna que l IN du virus Visna. Le domaine N terminal semble donc ne pas intervenir dans la reconnaissance des extrémité virales lors de l étape d intégration (Katzman and Sudol, 1998). Au contraire, des mutations dans le domaine HHCC altèrent la spécificité de reconnaissance de l IN avec le substrat (Khan et al., 1991). Ainsi, il n y a pas d évidence directe du rôle de ce domaine dans la reconnaissance spécifique des extrémités de l ADN viral. Le rôle majeur proposé de ce domaine est son implication dans la multimérisation de la protéine. 1.2. Le domaine central Le domaine central est le domaine le plus conservé entre les différentes protéines intégrase, il possède notamment un motif hautement conservé : le motif D, D (35) E constituant le site catalytique de la protéine. Ces résidus sont situés en positions 64, 121 et 157 pour ALSV et 64, 116 et 152 pour HIV. Le dernier résidu asparagine et le résidu glutamine sont séparés par 35 acides aminés. 1.2.1. Structure La structure de ce domaine a été obtenue dans un premier temps par cristallisation du seul domaine central de l intégrase de RSV (Bujacz et al., 1995). Plus récemment, les cristallisations de l IN en deux domaines ont permis de mieux appréhender cette structure. Les domaines cristallisés sont : le domaine central et le domaine C terminal de l intégrase d HIV-1 (Chen et al., 2000a), de RSV (Yang et al., 2000) et de SIV (Chen et al., 2000b), et le domaine N terminal et le domaine central d HIV-1 (Wang et al., 2001). Le domaine central est constitué de 5 feuillets bêta et de 5 hélices alpha pour l IN de ASV et de 5 feuillets bêta et 6 hélices alpha pour l IN d HIV-1. La cristallisation de l IN d HIV n a pu être observé qu en réalisant des mutants de la protéine permettant de la rendre plus soluble. La structure de ce domaine révèle que l IN fait partie de la famille large des nucléases et des polynucléotidyltransferase comme la RNase H et la RuvC resolvase d E.Coli. Le domaine se présente sous forme dimérique, l interface de dimère est formée par des liaisons hydrophobes entre l hélice α 1 et l hélice α 5 pour HIV (Maignan et al., 1998) et entre les hélices α1 et α 5 et le feuillet β3 pour ASV (Bujacz et al., 1995). Le domaine central interagit avec un ion Mg 2+ (Goldgur et al., 1998). Le site de fixation de cet ion est défini par 19 résidus du domaine central pour l IN d HIV et par 25 résidus pour l IN d ASV (Maignan et al., 1998). L analyse de la structure du domaine catalytique par rayon X, a mis en évidence la présence d une boucle flexible entre les résidus 141 et 148 de l IN d HIV qui se situerait, après repliement de la protéine, à proximité du site catalytique (Chen et al., 2000a). EPHE Banque de Monographies SVT 12

1.2.2. Rôle du domaine central dans le mécanisme d intégration Le motif D, D (35) E est très conservé chez les intégrases des rétrovirus et des rétrotransposons aussi bien que dans certaines transposases bactérienne. La mutation d un seul de ces résidus inhibe les réactions de clivage, de ligation et de désintégration in vitro (Engelman and Craigie, 1992; van Gent et al., 1992). Ce motif est donc le siège du site catalytique de la protéine. Une autre fonction décrite de ce domaine est la reconnaissance et la fixation de l ADN viral et cellulaire. En testant l activité catalytique de protéines chimères de différentes intégrases, on observe que seules les protéines chimères possédant le domaine central du virus, dont sont issus les séquences att de l ADN viral, sont capables de réaliser la réaction de clivage (Katzman and Sudol, 1998; Goulaouic and Chow, 1996; Pahl and Flugel, 1995). Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant des intégrases tronquées d un ou plusieurs domaines (Kulkosky et al., 1995). Ce rôle dans la reconnaissance de l ADN viral ne semble pas être porté exclusivement par le domaine central. Il semble que la reconnaissance de l ADN viral comme de l ADN cible ne puisse avoir lieu sans les domaines N et C terminaux (Lee et al., 2005). La boucle flexible décrite au niveau de l IN d HIV-1 semble importante aussi pour l activité de la protéine. Des mutations dans cette boucle pour la rendre moins flexible entraînent une perte d activité pour la réaction de désintégration in vitro, sans affecter la capacité de fixation à l ADN. Ces résultats montrent l importance de la flexibilité de cette boucle devant le site catalytique (Lee et al., 2005; Greenwald et al., 1999). 1.3. Le domaine C terminal 1.3.1. Structure. La résolution de la structure de l IN a été déterminée par RMN au niveau du domaine C terminal de l IN d HIV-1 (Lodi et al., 1995) et par cristallisation du domaine central et du domaine C terminal d HIV-1 (Chen et al., 2000a), de RSV (Yang et al., 2000) et de SIV (Chen et al., 2000b). Ce domaine est formé de 5 feuillets β, ce qui est caractéristique des domaines SH3 reconnu pour fixer des molécules d ADN. La cristallisation de deux domaines de l IN de RSV (Domaine central et domaine C terminal) montre une dimérisation du domaine C terminal asymétrique (Yang et al., 2000) alors que la cristallisation des mêmes domaines de l IN de HIV-1 présente une structure symétrique (Chen et al., 2000a). De plus, la localisation des domaines C terminaux des intégrases de SIV, d HIV- 1 et de RSV par rapport au domaine central montre une connexion entre les deux domaines qui diffère entre les trois structures. Les différences observées suggèrent une flexibilité de la liaison entre les deux domaines. 1.3.2. Rôle du domaine dans le mécanisme d intégration Le domaine C terminal, par son domaine SH3, est impliqué dans la fixation à l ADN (Esposito and Craigie, 1999). La structure de ce domaine en dimère présente un sillon, composé de nombreux résidus chargés, qui par sa taille pourrait fixer une hélice d ADN double brin. Des tests d activité in vitro avec des mutations dans le domaine C terminal montrent que ce domaine intervient dans les réactions de clivage et de ligation (Engelman et al., 1993). De plus la mutation de résidus de ce domaine sur IN d ASV entraîne une réduction du mécanisme d intégration concertée (Moreau et al., 2003). EPHE Banque de Monographies SVT 13

Le domaine C terminal est aussi impliqué dans la multimérisation de l intégrase. En effet, la suppression de ce domaine réduit fortement la capacité de formation de structures oligomériques de la protéine (Jenkins et al., 1996). 2. Structure oligomérique de l intégrase L analyse des formes multimériques de la protéine IN d ASV par ultracentrifugation analytique montre la présence de monomères, de dimères et de tétramères en solution (Coleman et al., 1999). De nombreux facteurs peuvent influencer la structure de la protéine en solution comme la concentration en sel, en protéine ou en glycérol (Villanueva et al., 2003; Coleman et al., 1999). Cependant, on sait aujourd hui que l intégrase est active sous forme oligomérique, c'est-à-dire que plusieurs molécules d IN doivent être liées afin de permettre une réaction d intégration concertée. Ceci a été montré par différentes expériences développées ci-dessous. 2.1. Tests de complémentation in vitro Les tests de complémentation entre deux protéines intégrase présentant différents domaines de celle-ci ont permis de montrer une structure active de l intégrase sous forme dimèrique. Ces études ont porté sur l IN d HIV-1 (Engelman et al., 1993) et d HIV-2 (van Gent et al., 1993). Des mutants de la protéine intégrase d HIV-1 possédant un ou plusieurs domaines de la protéine ont été mélangés et testés en mesurant leurs activités catalytiques (Engelman et al., 1993). Le mutant de l IN comportant seulement le domaine N terminal est inactif pour les réactions de clivage et de ligation comme le mutant de l IN ne comportant pas le domaine C terminal. Par contre, si les deux mutants sont présents dans le milieu réactionnel, il y a réaction de clivage et de ligation. Les auteurs ont aussi pu déterminer que la protéine était active sous forme au minimum de dimère et que, au sein du dimère, la présence d un seul domaine N terminal et d un seul domaine C terminal était suffisant pour les réactions de clivage et de ligation. Par ailleurs, d autres expériences utilisant des mutants ponctuels au niveau du site actif de la protéine ont mis en évidence que la complémentation du domaine N terminal par rapport au site actif n avait lieu que si les deux domaines étaient présents sur deux sous unités différentes au niveau du dimère. On parle d activité en trans. Par contre, la complémentation du domaine C terminal peut se faire soit en trans soit en cis, c est à dire que les deux domaines peuvent être, soit portés par la même sous unité, soit par deux sous unités différentes (Engelman et al., 1993). Les mêmes expériences de complémentation réalisées sur l IN d HIV-2, montrent que la complémentation est plus efficace lorsque les domaines N et C terminaux sont présents sur la même sous unité (van Gent et al., 1993). Dans ces tests, l activité de la protéine n a été testée que sur une seule extrémité virale, l action de la protéine sur les deux extrémités virales de manière simultanée pourrait être réalisée théoriquement par une forme oligomérique supérieure comme un tétramère. 2.2. Hypothèse d une forme multimérique supérieure par analyse structurale D un point de vue structural, les cristallisations du domaine central ou de deux parties de l intégrase contenant le domaine central et le domaine N terminal (Wang et al., 2001) ou le domaine C terminal (Chen et al., 2000a), présentent les domaines sous forme de dimères. Néanmoins, la structure du dimère obtenu pour le domaine central et le domaine N terminal de l IN de RSV (Rous EPHE Banque de Monographies SVT 14

Sarcoma Virus) montre que les deux sites actifs de chaque sous unité de la structure sont séparés de plus de 50 Å. Or, si on fait l hypothèse que chaque site actif du dimère agit sur une extrémité virale, ceux-ci devraient être plus proches dans l espace pour permettre l insertion des deux extrémités de l ADN viral dans l ADN cellulaire avec seulement 6 paires de bases de décalage (Yang et al., 2000). Pour résoudre ce problème, il faut considérer que la protéine fonctionne au minimum sous forme d un tétramère. 2.3. Influence de l ADN sur la structure du complexe actif Certains auteurs ont cherché à déterminer la structure du complexe actif en mettant en solution l ADN viral et la protéine IN. Ainsi, en figeant la structure par formation de pont disulfure entre l ADN viral et l intégrase, Gao et al (Gao et al., 2001) ont pu révéler des contacts spécifiques entre l ADN et les protéines. Ces contacts ont permis de développer un modèle de tétramérisation (Gao et al., 2001). Les auteurs montrent également que la conformation du complexe se modifie une fois l ADN viral clivé. D autres auteurs ont montré l influence de la fixation de l ADN sur le complexe actif. Une étude montre que lorsque l ADN se fixe au niveau du complexe les formes tétramériques présentes dans le milieu sont converties en forme dimérique et monomérique à 37 C (Deprez et al., 2001). A l inverse, une autre étude montre que lorsque la protéine intégrase est en interaction avec un ADN, elle se présente majoritairement sous forme de tétramère (Vercammen et al., 2002). Cependant les deux études sont réalisées dans des tampons différents et utilisent des intégrases purifiées différemment. On peut donc dire que la fixation à l ADN influence bien la formation du complexe oligomérique mais on ne sait pas de quelle manière. Un dernier point en faveur de la forme active multimérique est l analyse in vitro des différentes formes oligomériques en test d activité d intégration concertée (Faure et al., 2005). Après fixation des différentes formes oligomériques par un agent chimique, celles-ci ont été testées en intégration concertée in vitro : c est la forme tétramérique qui semble la plus active. Enfin, certains auteurs suggèrent que le complexe serait actif sous forme oligomérique encore plus importante, pouvant aller jusqu à un octamère (8 molécules d intégrase) (Cherepanov et al., 2003; Deprez et al., 2000; Lee et al., 1997). Malgré ces différents résultats, la structure de la protéine intégrase entière n ayant pas été résolue, la résolution de celle-ci pourrait permettre de mieux comprendre son fonctionnement. 3. Le développement d inhibiteurs de l intégrase 3.1 Les traitements anti-rétroviraux Actuellement les traitements anti-rétroviraux utilisés contre le VIH consistent à la prise quotidienne d un cocktail de médicaments composé de trois catégories de molécules : les NRTIs (Nucleoside reverse transcriptase inhibitors) les NNRTIs (non nucléoside reverse transcriptase inhibitors) et les PIs (Proteases inhibitors). Ces molécules visent deux étapes du cycle de réplication : la transcription inverse et l étape d assemblage et de libération des particules virales nouvellement formées, les NRTIs et les NNRTIs étant dirigés contre la transcriptase inverse et les PIs contre la protéase. Plus récemment des nouveaux inhibiteurs FIs (Fusion inhibitors) ont été développés contre l étape de fusion entre l enveloppe de la particule virale et la membrane plasmique de la cellule. Le EPHE Banque de Monographies SVT 15

premier utilisé en clinique est l enfuvirtide qui se fixe sur une glycoprotéine : la gp41 (Magden et al., 2005; De Clercq, 2004). Mais l efficacité des traitements actuels est compromise par le développement de souches résistantes aux médicaments. Les souches résistantes sont générées par la faible fidélité de la transcriptase inverse qui a pour conséquence des mutations du génome viral. Ces mutations sélectionnées pour la survie du virus affectent, la trancriptase inverse, la protéase et la glycoprotéine d enveloppe pg41, entraînent une résistance aux NRTIs, aux NNRTIs, aux PIs et aux FIs (Daar and Richman, 2005). De plus, les traitements actuels présentent une toxicité importante. Il est donc nécessaire de rechercher de nouveaux médicaments, plus actifs et moins toxiques agissant à la fois contre les souches sauvages et contre les souches résistantes, et bloquant d autres étapes du cycle de réplication des rétrovirus. De ce point de vue, l IN constitue une cible intéressante. 3.2. Le développement d inhibiteurs de l intégrase. L intégrase est attractive car elle intervient dans une étape clé du cycle de réplication. De plus, on ne connaît pas d homologue cellulaire de cette protéine: des inhibiteurs contre IN pourraient s avérer moins toxique que les inhibiteurs de la transcriptase inverse et de la protéase. Depuis dix ans, les connaissances de la structure de la protéine et des mécanismes mis en jeu dans le processus d intégration ont aidé au développement d inhibiteurs dirigés contre cette protéine et de nombreuses molécules sont décrites comme bloquant le fonctionnement de cette enzyme. On compte aujourd hui plusieurs classes d inhibiteurs : des dérivés d acides bétadicétonique ou DKAs dont deux d entre eux sont en essai clinique : le S1360 et le L-870,810, des peptides, des anticorps et des inhibiteurs oligonucléotidiques. Les DKAs sont les premiers inhibiteurs de l intégrase présentant une forte affinitée à haut débit pour l intégrase et une activité antivirale. La découverte des DKAs s est faite par analyse de plus de 250 000 molécules en test d activité (Hazuda et al., 2000). Pour caractériser le mécanisme intracellulaire des DKAs, des tests cellulaires ont été réalisés en utilisant différents dérivés des DKAs substitués ou non des fonctions diketo acides. Sur cellule les DKAs entraînent une inhibition de l infection des cellules et présentent une faible toxicité (Svarovskaia et al., 2004). La première molécule en phase clinique est le S1360, actuellement en Phase II. Cette molécule développée par Shionogi & Co est dérivée de la molécule chimique : 5CITEP et interagit avec trois acides aminés proches du site actif de l intégrase. La cristallisation de 5CITEP avec le domaine central de l intégrase a permis de mieux comprendre son mécanisme d action. Cette molécule interagit par des liaisons hydrogènes avec plusieurs acides aminés qui sont des sites potentiels de fixation pour l ADN. La deuxième molécule en essai clinique (phase I) est le L-870,810 développé par les laboratoires Merck. Celui ci provient d une nouvelle classe d inhibiteurs dérivant des DKAs, les napthyridines carboxamides. L inhibition par ce composé nécessite la formation du complexe de préintégration et la fixation des extrémités virales pour être actif. Ces composés ayant un site de fixation sur l intégrase identique à celui de l ADN cellulaire, ils agissent par compétition au niveau de ce site. (Pommier et al., 2005; Espeseth et al., 2000). Une autre méthode ayant permis l avancée des recherches est l utilisation de courtes EPHE Banque de Monographies SVT 16

séquences peptidiques mimant une partie de la molécule et qui, en interagissant avec celle-ci, bloque son activité. Ces peptides ont pu être développés grâce aux récents progrès fait sur la structure active de la protéine. Par exemple, le peptide INH5 est un dérivé de l hélice α 5 du domaine centrale de la protéine. Ce composé par sa structure identique à l hélice α 5 intervient au niveau de l interface de dimère. Il se fixe au niveau du domaine central de l intégrase et induit alors une dissociation de la forme oligomérique de l IN. Un autre avantage de ce peptide est son action à de faibles concentrations (Johnson et al., 2004; Maroun et al., 2001). De même d autres peptides ont été développés qui interagissent avec la structure de l intégrase (Desjobert et al., 2004; de Soultrait et al., 2002). Malgré une dizaine d années de recherche et de nombreux inhibiteurs développés contre l intégrase, il est nécessaire d optimiser les composés déjà connus et de rechercher d autres inhibiteurs. Pour cela, il est important de mieux caractériser l étape d intégration, en déterminant le rôle et le fonctionnement précis de chaque protagoniste. Chapitre IV : Application en transgénèse. La transgénèse est l introduction dans un organisme vivant d un gène qui lui est étranger afin de lui conférer une nouvelle propriété qu il transmettra à sa descendance. On s intéresse ici en particulier à la transgénèse chez les animaux. D une manière générale, la manipulation génétique des animaux recouvre différents secteurs d activités, comme la manipulation à des fins médicales (production d organes, de tissus, de cellules, de substances thérapeutiques) ou à des fins agroalimentaires (amélioration de la productivité agricole, amélioration de l état de santé des élevages). Ces manipulations sont aussi utiles pour la recherche fondamentale (étude de gènes) que pour la production industrielle ou agronomique. La transgénèse animale a été réalisée, pour la première fois chez la souris, il y a environ une vingtaine d années (Houdebine, 2002). La principale méthode utilisée pour la transgénèse est la micro-injection d ADN dans le noyau d un ovule fraîchement fécondé au stade pré blastodermique. Après la modification génétique, les cellules de l embryon poursuivent leur développement jusqu'à la formation complète de l animal transgénique. Un problème important de cette technique est sa faible efficacité. Par exemple, lors de la première transgénèse effectuée chez le ver à soie, 2498 œufs ont été micro injectés et seulement 12 animaux exprimaient la GFP (Green Fluorescent protein) après croisement. (Tamura et al., 2000). Pour palier à cela d autres méthodes ont été développées tels que l utilisation de cellules ES ou de vecteurs rétroviraux. On s intéresse ici particulièrement à la transgénèse chez le ver à soie, ou Bombix mori, élevé depuis plus de quatre mille six cents ans pour sa capacité à synthétiser la protéine de la soie, qui entre dans la composition de son cocon. L avantage est que la production de cette protéine est réalisée par la glande séricigène des chenilles du Bombix mori. Cette glande est capable de secréter les protéines en dehors de l organisme. Le ver à soie peut donc être utilisé comme bio réacteur pour produire toutes sortes de protéines en facilitant l étape d extraction en dehors de l animal. De plus, sa capacité de production est très importante : plus de 1 kilomètre de fibre à la vitesse de 15 centimètres à EPHE Banque de Monographies SVT 17

l heure. Du point de vue de la transgénèse, l avantage de cette espèce est que le risque de prolifération non contrôlée des animaux transgéniques est nul car sa chenille est incapable de survivre dans la nature. La première transgénèse du ver à soie a été réalisée en 2000 (Tamura et al., 2000). La méthode consiste à transformer les cellules germinales de l animal par microinjection d un élément transposable, le plasmide PiggyBac, contenant un gène marqueur codant pour la GFP. Cette protéine, découverte dans la méduse Aequorea victoria (Tsien, 1998) entraîne une coloration verte par fluorescence. Le gène marqueur est mis sous contrôle d un promoteur qui permet l expression du gène de la GFP dans l ensemble des tissus mais qui ne permet pas de repérer les animaux transgéniques avant l apparition des larves de la première génération. La découverte d un nouveau système de sélection pour l identification des insectes transgéniques (Berghammer et al., 1999) a permis d améliorer le système. Celui-ci utilise toujours le gène de la GFP mais sous contrôle d un autre promoteur, le promoteur 3xP3. Ce promoteur permet l expression du gène de la GFP dans les yeux des larves et des adultes mais surtout au stade embryonnaire. Il permet donc de visualiser, dès la génération Go, les embryons ayant introduit le gène marqueur. Ainsi ce marqueur a été utilisé pour la transgénèse du ver à soie et a permis de faciliter le repérage des animaux transgéniques à un stade plus précoce du développement. (Thomas et al., 2002). Cependant l efficacité de transgénèse reste toujours très faible. Bibliographies Aiyar, A., Hindmarsh, P., Skalka, A.M. and Leis, J. (1996) Concerted integration of linear retroviral DNA by the avian sarcoma virus integrase in vitro: dependence on both long terminal repeat termini. J Virol. 70: 3571-3580. Andrake, M.D. and Skalka, A.M. (1995) Multimerization determinants reside in both the catalytic core and C terminus of avian sarcoma virus integrase. J Biol Chem. 270: 29299-29306. Asante-Appiah, E. and Skalka, A.M. (1997) Molecular mechanisms in retrovirus DNA integration. Antiviral Res. 36: 139-156. Balakrishnan, M. and Jonsson, C.B. (1997) Functional identification of nucleotides conferring substrate specificity to retroviral integrase reactions. J Virol. 71: 1025-1035. Barr, S.D., Leipzig, J., Shinn, P., Ecker, J.R. and Bushman, F.D. (2005) Integration targeting by avian sarcoma-leukosis virus and human immunodeficiency virus in the chicken genome. J Virol. 79: 12035-12044. Berghammer, A.J., Klingler, M. and Wimmer, E.A. (1999) A universal marker for transgenic insects. Nature. 402: 370-371. EPHE Banque de Monographies SVT 18

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