INTRODUCTION. Mots-Clés: thyroglobuline, anticorps anti-thyroglobuline

Comparaison entre les tests de surcharge et le dosage Radio-immunologique des anticorps anti-thyroglobuline pour la validation des dosages de la thyroglobuline M. Labroquere, C. Corone, F. Le Thai et M.-F. Pichon Laboratoire d Oncobiologie, service de Médecine Nucléaire, Centre René-Huguenin de Lutte Contre le Cancer, Saint- Cloud RÉSUMÉ Nous avons mesuré la concentration d anticorps anti-thyroglobuline par 3 méthodes immunoradiométriques différentes (TGAB IRMA Pasteur, THYRAK Assay Behring et Anti-Tgn DYNOtest Brahms) dans 724 sérums provenant de 301 patients sous surveillance clinique et biologique après traitement initial d un cancer thyroïdien folliculo-papillaire. La thyroglobuline a été mesurée par une technique immunoradiométrique utilisant 5 anticorps monoclonaux (Thyroglobuline IRMA Pasteur). Des test de récupération ont été faits en parallèle avec les dosages d anticorps anti-thyroglobuline et leurs résultats comparés aux concentrations d anticorps anti-thyroglobuline. Aucune corrélation significative n a pu être mise en évidence entre les pourcentages de récupération de la thyroglobuline et les concentrations d anticorps anti-thyroglobuline, quelle que soit la méthode employée. Mots-Clés: thyroglobuline, anticorps anti-thyroglobuline RIASSUNTO Confronto tra il test di recupero ed il dosaggio radioimmunologico degli anticorpi antitireoglobulina per la validazione dei dosaggi di tireoglobulina. Obiettivo del lavoro è stato la valutazione della correlazione tra i risultati del dosaggio degli anticorpi antitireoglobulina con diverse tecniche ed il test di recupero. Abbiamo misurato la concentrazione degli anticorpi antitireoglobulina con tre diverse metodiche immunochimiche (TGAB IRMA Pasteur, Thyrak assay Behring e Anti-Tgn DYNOtest Brahms) in 724 campioni di siero provenienti da 301 pazienti in monitoraggio clinico, strumentale (diagnostica per immagini) e biochimico dopo trattamento chirurgico iniziale per tumori follicolari e papillari della tiroide. La tireoglobulina è stata misurata con dosaggio immunoradiometrico (Tireoglobulina IRMA Pasteur) che impiega 5 anticorpi monoclonali. I test di recupero sono stati eseguiti in parallelo al dosaggio degli anticorpi antitireoglobulina ed i loro risultati confrontati con la concentrazione degli anticorpi antitireoglobulina. Il nosro lavoro dimostra la mancanza di relazione tra le due metodiche e identifica la probabilità di interferenza nel dosaggio della tireoglobulina. I risultati ottenuti confermano le precedenti osservazioni e sono in accordo con la considerazione che non si tratta di un problema legato ad una particolare tecnica di dosaggio degli anticorpi antitireoglobulina. Conclusioni. Non è stata dimostrata alcuna correlazione statisticamente significativa tra la percentuale di recupero della tireoglobulina e la concentrazione degli anticorpi antitireoglobulina, con qualsiasi metodo dosati. Parole chiave: Tireoglobulina, Anticorpi anti-tireoglobulina ABSTRACT Comparison between recovery test and thyroglobulin autoantibodies radioimmunoassays for the validation of thyroglobulin results. We have measured anti-thyroglobulin antibodies by 3 different immunoassay methods (TGAB IRMA Pasteur, THYRAK Assay Behring and Anti-Tgn DYNOtest Brahms) in 724 serum samples from 301 patients under clinical, morphological and biological follow-up after primary treatment for papillo-follicular thyroid cancers. Thyroglobulin was measured by an immunoradiometric assay (Thyroglobulin IRMA Pasteur) using 5 monoclonal antibodies. Anti-thyroglobulin auto-antibodies concentrations were compared with percent thyroglobulin recovery performed in the same samples. No statistically significant relationships could be demonstrated between the concentration of thyroglobulin auto-antibodies, whatever the assay used, and percent recoveries. Key words: thyroglobulin, thyroglobulin auto-antibodies INTRODUCTION La thyroglobuline humaine est une glycoprotéine iodée de très grande taille (poids moléculaire 660 kda). Son gène, situé sur le chromosome 8, a été cloné, il comprend plus de 42 exons [1], 8 307 nucléotides codant 2 748 amino-acides [23]. La thyroglobuline est le précurseur des hormones thyroïdiennes, elle est exclusivement synthétisée dans les cellules folliculaires, où elle représente 75 % des protéines totales [24]. La thyroglobuline mature com- Riprodotto da Immunoanal Biol Spéc 2006; 246-251 con l autorizzazione del coordinatore di CORATA, Prof. B. Poggi LigandAssay 12 (1) 2007 55

porte deux sous-unités identiques de 330 kda, associées par des liaisons non covalentes uniquement. Ces dernières peuvent s'associer en tétramères ou hexamères par des liaisons covalentes (ponts disulfures et dityrosines) sous l'effet d'espèces réactives de l'oxygène et aboutir à la formation d' agrégats retrouvés dans la colloïde [4]. La thyroglobuline comporte 115 résidus de tyrosine, sites potentiels d iodation, dont 4 sont des sites majeurs (tyrosyls 5, 1290, 2553, 2746) [5,8]. Le degré d iodation de la thyroglobuline est variable et dépend de la teneur alimentaire en iode (0,2 à 1 % chez les sujets sains), la stabilité de la thyroglobuline augmente avec le degré d iodation. Les sites préférentiels d iodation sont connus [25,26]. Cette glycoprotéine renferme 8 à 10 % d oses (galactose, mannose, fucose, N-acetylglucosamine et des résidus d' acide sialique) [5, 14, 25). La thyroglobuline est très immunogène, les oses jouent un rôle très important dans l antigénicité de la molécule. Chez le sujet sain, il existe plusieurs isoformes de thyroglobuline de taille différente en raison d'un épissage alternatif de son ARN messager, 4 transcrits différents ont ainsi été décrits dans la région centrale de la molécule [1]. Les degrés d iodation et de glycosylation variant chez les sujets normaux, cette hétérogénéité peut conduire à masquer ou au contraire à exposer différents épitopes. Dans les cancers thyroïdiens différenciés, la thyroglobuline est homogène sous sa forme dimérique [6], contrairement aux autres pathologies thyroïdiennes [21]. Elle est peu ou pas iodée et présente également des altérations de glycosylation [17]. Une méthode basée sur ces différences de glycosylation se traduisant par des affinités différentes vis-à-vis de plusieurs lectines a été proposée pour différencier la thyroglobuline provenant de tissus normaux, d adénomes ou de cancers [15]. Étant données la complexité de la structure de la thyroglobuline et la fréquence d auto-immunisation contre cette glycoprotéine, de nombreux travaux ont étudié sa cartographie épitopique, avec des résultats très contrastés jusqu'à présent. L absence de consensus au niveau de l inventaire des épitopes de la thyroglobuline se retrouve également au sujet de la spécificité ou de la non spécificité des anticorps retrouvés dans chaque grande catégorie de pathologies thyroïdiennes. Des anticorps polyclonaux anti-thyroglobuline sont fréquemment retrouvés (4 à 27 %, maximum observé de la série de 140 sujets d Ericsson) chez les sujets indemnes de pathologie thyroïdienne, si l on utilise des techniques d immunoanalyse quantitative et non des tests d hémagglutination beaucoup moins sensibles [9, 18]. Ces anticorps sont essentiellement des IgG1 et IgG4. La question de savoir si les épitopes reconnus par les anticorps antithyroglobuline des sujets normaux sont différents de ceux reconnus dans chaque type de pathologie thyroïdienne y compris les cancers n est pas tranchée. Saboori a montré qu un même épitope peut appartenir à des fragments différents de la molécule de thyroglobuline, et qu il peut s agir d épitopes conformationnels liés à la structure secondaire de la molécule [19]. D autres groupes n ont pas mis en évidence d épitopes spécifiques d une pathologie. Pour Caturegli [3] les auto-anticorps retrouvés dans les cancers thyroïdiens reconnaissent les régions II, III et VI de la thyroglobuline, certaines d entre elles étant aussi reconnues à des degrés divers dans les thyroïdites auto-immunes. Pour Ruf [18] et Haapala, [12] la différence se situe essentiellement au niveau de l avidité et des titres en anticorps, significativement plus élevés en cas de cancer thyroïdien. Dans les cancers thyroïdiens la fréquence avec laquelle sont retrouvés des anticorps anti-thyroglobuline est variable d une série à l autre ( 9-30 %), principalement à cause des différences entre les méthodes de dosage des anticorps anti-thyroglobuline. Cependant les fréquences et les concentrations moyennes en anticorps sont nettement plus élevées que chez les sujets normaux, trois fois plus selon Spencer [10,13,17,18,22]. En fait, les comparaisons entre les séries cliniques sont difficiles en raison de l absence de standardisation des dosages (le calibrateur MRC 65/93 n est pas d utilisation générale et la composition des calibrateurs secondaires est hétérogène), et de la grande variabilité antigénique de la thyroglobuline [11]. L interférence des auto-anticorps anti-thyroglobuline reste un problème majeur dans le dosage de la thyroglobuline. Le dosage des anticorps anti-thyroglobuline permet d évaluer la présence de ces anticorps mais ne renseigne pas sur leur interférence éventuelle dans le dosage de la thyroglobuline. D autres équipes proposent la mise en évidence indirecte des interférences dues à des auto-anticorps anti-thyroglobuline par le test de récupération. Ce test consiste à doser la thyroglobuline dans un échantillon de sérum puis à surcharger le sérum avec une concentration connue de thyroglobuline dans une autre incubation et dans les mêmes conditions analytiques. Le pourcentage de récupération généralement admis comme acceptable et permettant de considérer que le dosage de la thyroglobuline n est pas perturbé, fluctue entre 60% et 120% de la quantité ajoutée. PATIENTS ET MÉTHODES PATIENTS Notre étude a porté sur 301 patients dont le seul critère de sélection était l existence de cancers thyroïdiens folliculo-papillaires traités au minimum par chirurgie et soumis à une surveillance à long terme et une suspicion de présence d auto-anticorps anti-thyroïdiens. L étude a porté sur 724 prélèvements différents obtenus entre 1992 et 2001. Pour chaque prélèvement ont été réalisés le dosage de la thyroglobuline et des auto-anticorps anti-thyroglobuline et un test de récupération de la thyroglobuline ajoutée. MÉTHODES Dosage de la thyroglobuline. Nous avons utilisé la trousse thyroglobuline IRMA Pasteur qui comporte, comme anticorps de capture, un mélange de quatre anticorps monoclonaux anti-thyroglobuline humaine, sélectionnés selon des critères bien précis de spécificité, d avidité et de complémentarité. Un anticorps monoclonal, marqué à l iode 125 et reconnaissant un épitope différent de ceux reconnus par les anticorps fixés sur les tubes, est utilisé comme traceur. Les anticorps monoclonaux de cette trousse sont en principe dirigés contre des zones épitopi- 56 LigandAssay 12 (1) 2007

ques non reconnues par les auto-anticorps anti-thyroglobuline rencontrés chez les patients porteurs de cancers thyroïdiens différenciés. Les dosages ont été réalisés en double, avec deux sérums de concentration connue ajoutés pour le contrôle de qualité. Avec cette technique la norme de la thyroglobuline chez les sujets sains est < 50 ng/ml et le seuil de sensibilité analytique est de 0,20 ng/ml. Le test de surcharge a été réalisé en ajoutant 20 µl du standard à 500 ng/ml à la prise d essai de 100 µl de sérum selon les indications du fabricant. Un tube témoin est réalisé par ajout de 20 µl de solution tampon à la prise d essai. Nous avons considéré les valeurs < 70% comme des pourcentages de récupérations anormaux [2]. Dosage des auto-anticorps anti-thyroglobuline humaine. Trois techniques différentes de dosage des anticorps anti-thyroglobuline ont été successivement utilisées : la trousse TGAB IRMA Pasteur, la trousse THYRAK Assay Behring puis la trousse Anti-Tgn DYNOtest Brahms. Les trousses TGAB IRMA Pasteur et THYRAK Assay Behring utilisent des techniques en phase solide avec des tubes revêtus de thyroglobuline, dont l origine humaine est précisée pour la trousse TGAB IRMA Pasteur. La fixation d anticorps anti-thyroglobuline sur la phase solide est révélée par la protéine A marquée à l iode 125. Dans les deux techniques, les standards sont calibrés sur la préparation internationale de référence MRC 65/93. Les valeurs-seuil proposées pour la technique TGAB IRMA Pasteur sont de 50 UI/ml, avec une zone considérée comme douteuse entre 50 et 150 UI/ml. Avec la technique THYRAK Assay Behring les concentrations inférieures à 100 U/ml correspondent à une absence d anticorps, le seuil de positivité est de 200 U/ml avec une zone grise comprise entre 100 et 200 U/ml. Dans ce travail nous avons utilisé les seuils de 150 UI/ml (technique Pasteur) et 200 U/ml (technique Behring) pour affirmer la présence d anticorps anti-thyroglobuline. La trousse Anti-Tgn DYNOtest Brahms est une technique radioimmunologique par compétition qui utilise des auto-anticorps humains anti-thyroglobuline polyclonaux sur la phase solide, obtenus par chromatographie d affinité à partir d un pool de sérum provenant de différents patients présentant une thyroïdite autoimmune, afin de garantir la reconnaissance de tous les auto-anticorps dirigés contre la thyroglobuline. Toutes les classes et sous classes d anticorps sont en principe reconnues. Les autoanticorps humains polyclonaux anti-thyroglobuline éventuellement présents dans le sérum des patients entrent en compétition vis à vis des mêmes épitopes de la thyroglobuline radio-marquée à l iode 125. Les auto-anticorps du sérum à tester complexés avec le traceur ne se lient pas à la phase solide et seront éliminés par lavage. Les standards sont calibrés sur la préparation internationale de référence MRC 65/93 et les concentrations inférieures à 60 U/ml correspondent à une absence d anticorps. STATISTIQUES L analyse statistique de cette étude a été réalisée sur le logiciel MedCalc (version 7.6). Des tests sur les distributions des concentrations de thyroglobuline et d anticorps anti-thyroglobuline ayant montré le caractère non gaussien de celles-ci, nous avons utilisé des statistiques non paramétriques avec un seuil de significativité à P < 0,05. RÉSULTATS Notre série comportait 301 patients, avec ou sans métastases, pour lesquels un ou plusieurs prélèvements sériés au cours de leur surveillance ont été effectués. La population sélectionnée comportait 79,7% de femmes et 20,3% d hommes. L âge moyen des patients était de 48,3 + 15,2 ans. CONCENTRATIONS DE THYROGLOBULINE ET TESTS DE RÉCUPÉRATION La concentration médiane de thyroglobuline était de 2,00 ng/ml (interquartile 12,1 ng/ml) avec une étendue de 0 à 531 000 ng/ml (n=724). Deux cent quarante huit échantillons (34.2%) étaient inférieurs à 0,2 ng/ml (limite de détection). La valeur médiane des pourcentages de récupération était de 101,0 %, (interquartile 14,0%) avec une étendue de 24,0 à 151,0%). Dans notre série, 701 échantillons (96,82%) ont montré des pourcentages de récupération > 70%. Vingt trois cas (3,18%) étaient à considérer comme anormaux. Ils se répartissaient entre 1 homme et 22 femmes. Dans 14 de ces sérums (60,9 % des cas) la thyroglobuline était à des concentrations mesurables. Nous n avons pas trouvé de différence significative entre les concentrations de thyroglobuline dichotomisées en deux groupes, détectable ou non détectable, en fonction des résultats, normaux ou anormaux, des tests de récupération. Classés selon la présence ou l absence d anticorps anti-thyroglobuline toutes techniques confondues, 6/23 sérums seulement (26,1 % des cas) montraient une double anormalité. En fonction des techniques de dosages d anticorps anti-thyroglobuline, les test de récupération anormaux étaient répartis comme suit : TGAB IRMA Pasteur 0/17 sérums, THYRAK Assay Behring 20/666 sérums (3,0 % des cas), Anti Tgn DYNOtest Brahms 3/41 sérums (7,3 % des cas). DISTRIBUTION DES CONCENTRATIONS D AUTO-ANTICORPS ANTI-THYROGLOBULINE Le tableau 1 résume les résultats obtenus avec les différentes techniques. Les échantillons de sérum ayant été sélectionnés, les résultats ne correspondent pas à la distribution d une population standard de cancers thyroïdiens différenciés. La disparité des concentrations médianes d anticorps entre trousses, significative au seuil de P<0,0001, peut s expliquer par la sélection des sérums, une grande hétérogénéité des effectifs, des normes et des unités de mesure, mais surtout par des différences de spécificités de reconnaissance antigénique de chaque LigandAssay 12 (1) 2007 57

Tableau 1 Résultats des dosage d auto-anticorps anti-thyroglobuline et des tests de récupération. Anticorps anti-thyroglobuline n Valeur-seuil (U/ml ou UI/ml) Concentration médiane, (interquartile) > valeur-seuil < valeur-seuil TGAB IRMA Pasteur 17 <150 10,0 (24,75) 1 (5,88%) 16 (94,12%) THYRAK Assay Behring 666 <200 1,00 (47,11) 94 (14,11%) 572 (85,89%) Anti-Tgn DYNOtest Brahms 41 <60 160,00 (290,00) 40 (97,56%) 1 (2,44%) Total 724 135 ( 18,65%) 589 (81,35%) Test de récupération 724 <70% 701 (96,82%) 23 (3,18%) Tableau 2 Concordance entre le test de récupération et les anticorps anti-thyroglobuline (n=724) Pourcentage de récupération < 70% > 70% Anticorps anti- thyroglobuline absence (n=589) 17 (2,89%) 572 (97,11%) présence (n=135) 6 (4,44%) 129 (95,56%) χ² = 0,867, P= 0,35, coefficient de contingence = 0,035. trousse. Les concentrations médianes de thyroglobuline sont également statistiquement différentes entre les sousgroupes délimités par la technique de dosage des anticorps, en raison du fait que le groupe THYRAK Assay Behring comprenait un sérum ayant une concentration de thyroglobuline de 531 000 ng/ml. CONCORDANCE ENTRE LES RÉSULTATS DES CONCENTRATIONS D ANTICORPS ET LES TESTS DE RÉCUPÉRATION Le tableau II résume les données des comparaisons entre les résultats de dosages d anticorps et les tests de récupération. Dans la majorité des cas, l absence d anticorps anti-thyroglobuline est associée à un test de récupération normal. Cependant 17/589 (2,89 %) des sérums sans anticorps anti- thyroglobuline ont montré des tests de récupération anormaux, pouvant évoquer la présence d anticorps non mis en évidence par la technique de dosage utilisée. A l inverse, dans 129/135 (95,56%) des sérums positifs en anticorps, les tests de récupération étaient normaux, suggérant que les anticorps détectés n interfèrent pas dans le dosage de la thyroglobuline. Le coefficient de contingence est égal à 0,035, ce qui correspond à un coefficient très faible (variations maximales entre 0 et 1), qui confirme que les résultats de dosage des anticorps anti-thyroglobuline et des tests de récupération ne sont pas liés entre eux. La même analyse de concordance effectuée séparément selon la technique de dosage d anticorps utilisée montre également des coefficients de contingence non calculables (TGAB IRMA Pasteur) ou compris entre 0,030 (THYRAK Assay Behring) et 0,490 (Anti- Tgn DYNOtest Brahms). Les figures 1 à 3 montrent l évolution des concentrations d anticorps anti-thyroglobuline chez différents patients ayant des pourcentages de récupération de la thyroglobuline normaux, en rémission clinique et morphologique complète après traitement initial. DISCUSSION Le but de ce travail était d évaluer les corrélations entre les résultats des dosages d anticorps anti-thyroglobuline par différentes techniques et les tests de récupération. Quelle que soit la technique de dosage des anticorps anti-thyroglobuline utilisée, nos résultats montrent une absence de relation entre les deux méthodes visant à identifier la probabilité d interférences dans le dosage de la thyroglobuline. Nos résultats confirment ceux antérieurement obtenus [16,27], et sont en accord avec le fait qu il ne s agit pas d un problème lié une technique particulière de dosage des anticorps anti-thyroglobuline. On peut faire diverses critiques méthodologiques importantes sur la réalisation des tests de récupération proposée en routine [7]. Pour des raisons évidentes, la thyroglobuline utilisée pour surcharger chaque sérum ne peut être celle du patient lui-même, la reconnaissance épitopique de la thyroglobuline ajoutée peut donc se faire sur des sites différents de ceux du patient. Par ailleurs, la quantité de thyroglobuline utilisée pour les tests de récupération n est ni définie ni standardisée, les durées d incubations avec et sans surcharge en thyroglobuline sont celles de la technique standard et sont beaucoup trop courtes pour atteindre l équilibre de liaison entre la thyroglobuline ajoutée et les auto-anticorps du sérum [7 ]. Sur la base de la qualité des outils méthodologiques disponibles, la moins mauvaise approche consiste à doser les anticorps anti-thyroglobuline. Cependant, considérer qu un dosage de thyroglobuline n est pas fiable en présence d anticorps décelable, reviend à priver environ 20 % des patients de la surveillance de leur cancer thyroïdien par un marqueur qui a fait la preuve de son efficacité clinique, alors qu il est clair qu aucune technique de dosage 58 LigandAssay 12 (1) 2007

Figure 1 Surveillance d une patiente en rémission complète clinique et morphologique après thyroïdectomie totale, curage ganglionnaire et irathérapie pour carcinome papillaire de forme vésiculaire pt1 N0. = anticorps anti-thyroglobuline, % de récupération de la thyroglobuline. Figure 2 Surveillance d une patiente traitée par lobectomie et hormonothérapie pour micro carcinome papillaire unifocal pt1, Nx occulte dans un contexte de thyroïdite chronique. Totalisation chirurgicale 5 ans (1500 jours) après le traitement initial pour nodule controlatéral d histologie bénigne. Rémission clinique et morphologique. = anticorps anti-thyroglobuline, % de récupération de la thyroglobuline Figure 3 Surveillance d une patiente en rémission clinique et morphologique après thyroïdectomie totale et ira thérapie pour micro carcinome papillaire plurifocal pt1m, Nx. = anticorps anti-thyroglobuline, % de récupération de la thyroglobuline d anticorps ne peut renseigner valablement sur le niveau exact d interférence que peuvent avoir ces auto-anticorps anti-thyroglobuline dans le dosage de la thyroglobuline chez un patient donné [18-20]. Une étude récente d Okosieme montre que l interférence due aux auto-anticorps anti-thyroglobuline serait plus liée au nombre total d épitopes différents reconnus qu aux caractéristiques de ces épitopes [16]. L étude multicentrique récente rapportée par Spencer [27] suggère que les anciennes méthodes radio immunologiques de dosages de la thyroglobuline utilisant des anticorps polyclonaux semblent être celles qui sont le moins sensibles aux interférences liées à la présence d'anticorps antithyroglobuline. CONCLUSION Les méthodes de dosage de la thyroglobuline ont été améliorées pour minimiser le plus possible les interférences dues aux auto-anticorps anti-thyroglobuline, mais aucune méthode actuelle n est totalement à l abri de ces interférences. Ce problème connu de longue date a relativement peu évolué durant cette dernière décennie et des évolutions méthodologiques sont encore nécessaires. RÉFÉRENCES 1. Bertaux F, Noel M, Lasmoles F, et al. Identification of LigandAssay 12 (1) 2007 59

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