Travail de diplôme Evaluation d une nouvelle méthode pour le dosage des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr Ecole Supérieure de la Santé TAB 51 Département d immunologie Accompagnants : Mercedes Cipolli et Jean-Michel Druon Novembre 2011 - Avril 2012
Table des matières 1 Résumé...3 2 Introduction...4 2.1 Description du laboratoire...4 2.2 Généralités...5 2.2.1 Le cycle de multiplication du virus...5 2.2.2 Transmission...6 2.2.3 Pathogénicité...6 2.2.4 Diagnostic... 7 2.2.5 Traitement...9 2.3 Caractéristiques des deux méthodes... 10 3 But...11 4 Développement...12 4.1 Matériel...12 4.2 Méthode...14 4.3 Résultats...16 4.3.1 Répétabilité... 20 4.3.2 Reproductibilité...22 4.3.3 Exactitude...24 4.3.4 Contamination entre échantillons...24 4.3.5 Sensibilité et spécificité...25 4.4 Discussion des résultats...28 4.4.1 Enzygnost Anti-EBV/IgM II...28 4.4.2 Enzygnost Anti-EBV/IgG...29 4.4.3 Enzygnost Anti-EBV/IgM II/conjugué IgA... 30 5 Conclusion...31 6 Remerciements...32 7 Bibliographie...33 8 Lexique...35 9 Annexe...36 9.1 Annexe 1 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur le Bep 2000...36 9.2 Annexe 2 : Résultats des reproductibilités pour les IgM, IgG et IgA... 70 9.3 Annexe 3 : Résultats de la répétabilité des IgM, IgG et IgA...101 9.4 Annexe 4 : Résultats des IgM, IgG et IgA testés sur des sérums avec des Early Antigen positifs...107 Les mots surlignés en bleu dans le texte se trouvent dans le lexique à la page 36. 2/113
1 Résumé Ce travail de diplôme repose sur une comparaison de méthodes entre Virotech (méthode de référence) et Siemens (méthode à tester). Les tests réalisés avec ces deux méthodes sont des tests immunoenzymatiques appelés ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). Cette comparaison de méthodes est effectuée pour le dosage des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr. Ce dernier appartient à la famille des Herpesviridae et est retrouvé chez 95% de la population mondiale. Ce virus intervient dans la mononucléose infectieuse, est associé au lymphome de Burkitt et se retrouve également dans le syndrome lymphoprolifératif post-transplantation. Pour diagnostiquer une infection à EBV, des tests sérologiques sont effectués (recherche d anticorps dirigés contre les protéines VCA, EBNA et EA). Pour réaliser cette comparaison, j ai utilisé 73 échantillons de sérum sur lesquels les EBV IgM, IgG et IgA ont été testés. Les résultats ont ensuite été comparés avec ceux de la méthode de référence. Pour déterminer si la nouvelle méthode peut être utilisée en routine, plusieurs critères ont été vérifiés comme la sensibilité, la spécificité, la reproductibilité et la répétabilité. Suite aux résultats obtenus, nous pourrons décider si cette méthode peut être ou non introduite en routine. 1 Summary This diploma work is based on the comparison of two methods : Virotech (reference method) and Siemens (method to be tested). The tests employing these two methods are enzyme immunoassay conscript ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). This comparison of methods is carried out to measure out the antibodies directed against the Epstein-Barr virus which belongs to the Herpesviridae family and affects 95 % of the world population. This virus intervenes in the infectious mononucleosis, is associated with the lymphoma of Burkitt and is also found in the post-transplant lymphoproliferative syndrome. In order to diagnose an EBV infection,serological tests are made (search for antibodies directed against proteins VCA, EBNA and EA). To realize this comparison, I used 73 samples of serum on which the EBV IgM, IgG and IgA were tested. The results were then compared with those of the reference method. To determine if the new method can be used routinely, several criteria were verified, such as sensitivity, specificity, reproducibility and repeatability. According to the obtained results, we can decide if this method can be introduced routinely or not. 3/113
2 Introduction 2.1 Description du laboratoire Le laboratoire Synlab BBR-LTC à Lausanne fait partie de la Société AMS SA du groupe international de laboratoires Synlab. Ces différents laboratoires sont implantés dans plusieurs villes de Suisse. A Lausanne, le laboratoire est divisé en plusieurs secteurs : immunologie-sérologie, chimie clinique, hématologie-hémostase, biologie moléculaire, bactériologie et génétique. Les prélèvements reçus dans ce laboratoire proviennent d hôpitaux, de cliniques, de cabinets médicaux et des centres de prélèvements. C est dans le département d immunologie-sérologie que j ai effectué mon stage ainsi que ce travail de diplôme. Figure 1 : Répartition des laboratoires Synlab en Suisse 4/113
2.2 Généralités Le virus Epstein-Barr (EBV) est un virus retrouvé chez la majorité de la population mondiale. La plupart du temps, chez l enfant, ce virus ne produit aucun symptôme alors que chez l adolescent et le jeune adulte, il se traduit par un état de fatigue intense, une forte fièvre, des adénopathies le plus souvent constantes ainsi qu une angine tenace. Ces signes cliniques sont regroupés sous le nom de mononucléose infectieuse. Le virus Epstein-Barr fait partie de la famille des Herpesviridae. La particule virale est composée d une capside icosaédrique entourée d une enveloppe dans laquelle sont insérées des glycoprotéines virales qui permettent l attachement du virus à sa cellule hôte. C est un virus à ADN bicaténaire qui peut coder 100-150 gènes. Grâce à des séquences répétitives à l extrémité de chaque brin, le génome est capable de se circulariser. La circularisation du génome est la première étape du processus réplicatif. Dans le virion, le génome est toujours sous forme linéaire. [1 ; 2] Figure 2 : Structure et organisation du virus Epstein-Barr 2.2.1 Le cycle de multiplication du virus Le cycle lytique Le début du cycle commence par l attachement du virus à la surface de sa cellule hôte par interaction entre la glycoprotéine gp350/220 de son enveloppe et le récepteur CD21 du lymphocyte B mature. Ensuite la particule virale est internalisée, puis elle migre vers le noyau de la cellule infectée. Durant ce trajet, la capside migre vers les pores nucléaires en se désintégrant progressivement pour ne laisser entrer que la molécule d ADN virale. Les gènes «très précoces» du génome viral sont transcrits, ce qui amène à l activation de l expression des gènes précoces. Les produits de ces gènes, comme l ADN-polymérase virale ainsi que d autres enzymes, répliquent l ADN. C est grâce à ces nouvelles molécules linéaires du génome EBV que les gènes tardifs sont transcrits. Les protéines de la capside et des glycoprotéines de l enveloppe sont produites. L'encapsidation de l'adn viral a lieu dans le noyau de la cellule. Les virions nouvellement produits sont transportés à la surface de la cellule. Durant ce transport ils acquièrent une enveloppe et des glycoprotéines qui leur serviront à s attacher à une cellule hôte. Ils sont ensuite libérés dans le milieu extracellulaire et la cellule est lysée. [1] 5/113
La latence Le virus a la capacité d établir une infection latente (arrêt de la réplication) des lymphocytes B, les rendant ainsi immortels. Toutes les personnes EBV-séropositives ont du génome EBV dans quelques lymphocytes B tissulaires ou sanguins. [1] 2.2.2 Transmission Le virus Epstein-Barr, à l origine de la mononucléose infectieuse, se transmet par contact direct avec la salive (d où le nom de «maladie du baiser») ou par contact avec des objets contaminés par de la salive infectée tels que des verres et des ustensiles. Exceptionnellement, il peut aussi se transmettre par transfusion sanguine ou lors d une transplantation d organe. Une personne infectée par cette maladie peut transmettre le virus durant plusieurs mois après sa guérison. [1 ; 3] 2.2.3 Pathogénicité Plus de 95% de la population mondiale a été infectée par le virus Epstein-Barr. La mononucléose infectieuse Selon une étude française 1 effectuée auprès de plusieurs médecins généralistes entre 1990-1991, l incidence de la mononucléose en France se situe entre 29 000-114'000 cas/an, dont 87% apparaissent avant l âge de 25 ans. La primo-infection à EBV, chez l adulte, donne dans 50 % des cas une mononucléose infectieuse. Mais la plupart des primo-infections à EBV se font très tôt dans l enfance et passent inaperçues. Après une incubation de 4-8 semaines, les symptômes qui apparaissent se traduisent sous forme de fatigue intense, forte fièvre, angine et adénopathie. Dans plus de 50% des cas, une splénomégalie est observée. La maladie se guérit entre 2-4 semaines, en laissant néanmoins persister une fatigue plus ou moins intense. Parfois, la mononucléose peut évoluer en infection chronique. La sérologie est utilisée pour le diagnostic et le traitement est symptomatique. [1] Infection chronique à EBV C est une infection chronique ou une mononucléose infectieuse récurrente grave dont les symptômes durent plus d un an. Ce cas est rare et survient chez des personnes immunocompétentes. Si elle est grave, cette infection est associée à une forte mortalité (43%). Elle peut également évoluer vers un lymphome. [1] Infection persistante normale Après la primo-infection à EBV, le virus demeure toute la vie dans l organisme. Le plus souvent il persiste à l état latent dans les lymphocytes B, le patient n a donc aucun symptôme. Mais parfois, le virus peut se réactiver. [1] 1 M.G.G., D. Abramowitch, J. M. Mosnier & A. Cohen. 1992 Incidence de la mononucléose infectieuse diagnostiquée en médecine générale en France. (http://www.bioforma.net/cahiers/cahier36.pdf) 6/113
Réactivation Après la primo-infection, l EBV persiste à vie dans quelques lymphocytes B chez le sujet immunocompétent. Lors d une immunodéficience, une minorité de lymphocytes B infectés de façon latente entrent en infection lytique, c est la réactivation du virus. Le sujet excrète alors le virus dans sa salive. Tumeurs malignes L EBV est associé au lymphome de Burkitt, au carcinome rhinopharyngé et à la maladie de Hodgkin. Les mécanismes qui entrent en jeu dans ces maladies sont très complexes. Syndrome lymphoprolifératif post-transplantation Lorsqu un patient séronégatif pour EBV reçoit une greffe, il présente un grand risque de syndrome lymphoprolifératif post-transplantation. Ce risque est dû à une immunité cellulaire anti-ebv déficiente à cause du traitement immunosuppresseur administré lorsqu une greffe est effectuée. [1] 2.2.4 Diagnostic Le diagnostic de l infection par le virus Epstein-Barr est réalisé dans la plupart des cas par la recherche d anticorps spécifiques et l analyse du profil sérologique. Un frottis sanguin peut également être effectué. Parfois, chez les patients immunodéprimés, la détection du génome viral (PCR) est nécessaire. 2.2.4.1 Hématologie En cas de mononucléose infectieuse, le diagnostic repose sur l examen clinique et la mise en évidence, par un frottis sanguin, de l augmentation du nombre de lymphocytes et de monocytes et la présence de lymphocytes stimulés (lymphocytes hyperbasophiles). Ces derniers se caractérisent par leur grande taille et un cytoplasme étendu fixant les colorants basiques. 2.2.4.2 Sérologie Pour diagnostiquer une infection à EBV, il est nécessaire d effectuer des tests sérologiques (recherche d anticorps dirigés contre les protéines VCA, EBNA et EA). La cinétique des différents anticorps luttant contre ce virus permet de dater l infection. Anticorps hétérophiles : ce sont des anticorps non spécifiques de l EBV qui surviennent au cours de la mononucléose infectieuse. Ce sont des IgM qui ont la capacité d agglutiner des globules rouges animaux (mouton, cheval, bœuf) ou des particules de latex recouvertes d antigènes érythrocytaires. C est un bon test pour identifier cette maladie. Néanmoins, ces anticorps ne sont détectables au début de la mononucléose infectieuse que pour 60 à 80% des patients. 7/113
VCA (Virus Capsid Antigen) : les IgM anti-vca, très précoces, apparaissent dès les premiers symptômes et disparaissent en 2 à 3 mois après le début de ceux-ci. Les IgG anti- VCA apparaissent 2 à 3 semaines après les premiers symptômes et persistent toute la vie. Lorsque le virus se réactive, une augmentation du titre des anticorps anti-vca peut être observée. EA (Early Antigen) : les anticorps anti-ea apparaissent dès le début de la maladie et disparaissent en 2 à 3 mois. Ils peuvent réapparaître chez des patients immunodéficients et traduisent alors une réactivation virale. EBNA (Epstein-Barr Nuclear Antigen) : les anticorps IgG anti-ebna apparaissent environ 3 mois après la primo-infection. Ils restent présents dans le sang durant toute la vie mais peuvent diminuer, et parfois disparaître, s il y a une baisse de l immunité cellulaire T. [1] Figure 3 : Cinétique des anticorps lors d une infection à EBV 8/113
L interprétation du profil sérologique est représentée dans le tableau ci-dessous : VCA IgG VCA IgM VCA IgA EA IgG EBNA Sujet séronégatif - - - - - MNI aiguë - ou + + - ou + ++ ou - - Infection ancienne + ou ++ - - - + ou ++ Réactivation +++ - + ou - ++ + Lymphome de Burkitt associé à l EBV Carcinome indifférencié du nasopharynx +++ - - +++ + ou - +++ - Tableau 1 : Profil sérologique EBV +++ ou ++ +++ ++ ou +++ 2.2.5 Traitement Le traitement est essentiellement symptomatique. Cependant, dans certaines situations, des corticoïdes et des anti-viraux peuvent être recommandés. Parfois, des antipyrétiques et des analgésiques sont également prescrits. 9/113
2.3 Caractéristiques des deux méthodes Méthode Référence Nouvelle Fournisseur Diasorin Siemens Appareil ETIMAX 3000 BEP 2000 Advance Technique ELISA indirect (Virotech) ELISA indirect (Siemens) Antigènes VCA EBNA VCA, EA, EBNA Anticorps dosés IgM IgG IgG IgM IgG IgA Unité Index Absorbance (IgM, IgA) U/ml (IgG) Figure 5 : Kit Enzygnost Anti-EBV/ IgM II de Siemens Figure 4 : Kit Virotech EBNA-IgG 10/113
3 But Evaluation d une nouvelle méthode (Enzygnost de Siemens) utilisée en routine pour le dosage des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr par la technique ELISA, sur l appareil Bep2000 Advance de Siemens. BEP2000 Advance Tiroir d accès à l unité de lavage Pipeteur Tiroir pour les embouts jetables et plaques de pré dilution Echantillon et réactifs Station de rinçage pipeteur Ejection des embouts Chargement des plaques Figure 6 : Description du Bep2000 Advance BEP2000 Advance Transport des microplaques Photomètre Incubateurs (x4) Laveur Eau distillée Flacons déchets liquides Solutions lavage (x3) + 1 eau distillée Figure 7 : Description du tiroir des solutions de lavage du Bep2000 Advance 11/113
4 Développement 4.1 Matériel Automate : Bep 2000 Advance de Siemens Bep 1 n de série : 9163000641 Bep 2 n de série : 9163000565 Réactifs communs pour EBV IgM, IgG et IgA : Diluant Lot : 426726/426727 Date d expiration : 20.10.2012/29.12.2012 Substrat Lot : 450758/450763 Date d expiration : 11.01.2013/09.08.2013 Chromogène Lot : 450657/450662 Date d expiration : 16.12.2012/13.07.2013 Solution Stop Lot : 450406 A/450492 A Date d expiration : 31.07.2013/06.04.2015 Solution Wash Lot : 450182/450163 Date d expiration : 18.01.2013/19.06.2014 Réactif à ajouter pour le kit IgM et IgA : RF-absorbant Lot : 441737 Date d expiration : 04.08.2012 Conjugué IgM Lot : 441237 Date d expiration : 14.08.2012 Conjugué IgA Lot : 441617 Date d expiration : 19.09.2012 12/113
Contrôles pour le kit IgM et IgA : Contrôle positif Lot : 441437 Date d expiration : 14.08.2012 Contrôle négatif Lot : 441337 Date d expiration : 14.08.2012 Réactif à ajouter pour le kit IgG : Conjugué IgG Lot : 423985/423986 Date d expiration : 27.08.2012/24.05.2014 Contrôle pour le kit IgG : Contrôle P/N Lot : 426688/426689 Date d expiration : 04.07.2012/14.09.2012 82 échantillons de sérum frais ou congelés Matériel standard de laboratoire 13/113
4.2 Méthode Les dosages immunoenzymatiques sont apparus relativement récemment. Les premiers ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) sont effectués en 1971. C est une technique biochimique permettant de détecter la présence d un antigène ou d un anticorps se trouvant dans un échantillon (sérum). Différentes étapes sont effectuées lors de la réalisation de la technique ELISA pour le virus Epstein-Barr sur le Bep2000 Advance : 1. Fixation de l antigène sur la plaque : pour l appareil mentionné ci-dessus, une plaque de microtitration commerciale est utilisée où l antigène est déjà fixé au fond des puits. L antigène est obtenu sur des cellules lymphoblastoïdes infestées par l EBV. Dans chaque puits se trouvent des antigènes de la capside virale (Ag VCA), des antigènes présents sur le noyau cellulaire de l EBV (Ag EBNA) et des antigènes dits «précoces» (Ag EA). 2. Dépôt du sérum du patient à tester puis incubation : les anticorps de l EBV présents dans l échantillon se fixent spécifiquement sur l antigène. 3. Lavage de la plaque qui permet aux anticorps qui ne se sont pas liés à l antigène d être éliminés. Après le lavage, il ne reste que des complexes antigène-anticorps fixés au fond du puits. 4. Ajout des anticorps anti-immunoglobulines humaines marqués par une enzyme (conjugué) : ils vont se lier aux complexes antigène-anticorps. 5. Lavage de la plaque qui permet d éliminer les anticorps en excès qui ne se sont pas liés aux complexes antigène-anticorps. 6. Ajout du substrat incolore (chromogène) : si la réaction est positive (l échantillon contient des anticorps dirigés contre le virus Epstein-Barr), le substrat est dégradé et une coloration bleue apparaît. Cette réaction est stoppée grâce à l ajout d une solution d arrêt POD qui colore la solution en jaune. 7. Quantification du résultat par une mesure spectrophotométrique de la réaction colorée à 450 nm et 650 nm comme référence. L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration de l anticorps recherché dans l échantillon. [4 ; 5] Figure 8 : Technique ELISA 14/113
Pour la recherche d IgM et d IgA, afin d éviter qu il y ait de faux positifs dus à la présence de facteurs rhumatoïdes dans l échantillon, un traitement est effectué à l aide d un réactif absorbant ces facteurs. Le RF-absorbant se fixe aux IgG de l échantillon à tester afin d éviter des faux positifs (facteurs rhumatoïdes) et des faux négatifs par compétition de site. Ce traitement permet d augmenter la sensibilité du test. [5] Selon Siemens, le dosage des IgA anti-ebv spécifiques est parfois utile au diagnostic. Les échantillons sur lesquels ce test doit être réalisé sont ceux dont le test Enzygnost Anti-EBV/IgG a démontré une activité > 650 U/ml et pour lesquels il est important de savoir si c est une réactivation de l EBV ou une infection chronique et persistante. En général, les enfants n ont pas de valeur > 650 U/ml, ce dosage n est donc pas utilisé pour eux. [5] Statut de l échantillon Anti-EBV/IgM Anti-EBV/IgG Anti-EBV/IgA Négatif négatif négatif - Primo-infection positif positif ou négatif - Infection ancienne négatif positif - Réactivation - > 650 U/ml positif Tableau 2 : Résultats sérologiques combinés de l exploration de l EBV et leurs interprétations : SIEMENS 15/113
4.3 Résultats Pour réaliser une évaluation de méthode, il faut analyser au minimum 20 échantillons. Ces derniers doivent couvrir l intégralité du domaine physiologique. Pour ce faire, il faut des valeurs basses, moyennes et hautes. Les tests sont effectués avec la méthode de référence (Virotech) et la nouvelle méthode (Enzygnost de Siemens). Les valeurs de Virotech sont celles obtenues en routine. [6] Pour cette évaluation de méthode, 73 échantillons ont été testés. Neuf échantillons early antigen positifs ont également été testés. Les résultats se trouvent dans les tableaux ci-dessous : N éch Enzygnost Virotech IFI Virotech IgM (absorb.) IgG (U/ml) IgA (absorb.) Monotest (pos/neg) VCA-IgM (index) VCA-IgM (titre) VCA-IgG (index) EBNA-IgG (index) 1201140005 0.457 <25 0.604 pos 6.6 >40 4.9 2.2 1112010270 0.033 126 0.706 neg 0.1 <10 7.7 2.3 1111250345 0.028 52 0.165 neg 0.3 <10 5.0 3.2 1111250255 0.025 55 0.015 neg 0.2 <10 5.7 3.8 1111240330 0.035 82 0.022 neg 0.3 <10 7.8 7.2 1112020198 0.043 117 0.013 neg 0.6 <10 4.8 4.1 1112025248 0.035 184 0.142 neg 0.6 <10 7.1 1.7 1111250290 0.331 <25 0.152 pos 8.6 >40 1.1 0.2 1111255417 0.386 56 0.248 pos 8.1 >40 4.1 0.2 1201190104 0.036 58 0.015 neg 0.4 <10 5.0 2.6 1201195060 0.028 154 0.050 neg 0.1 <10 5.3 3.2 1201190371 0.048 29 0.587 neg 0.5 <10 4.1 1.0 1201170356 0.061 141 0.018 neg 0.6 <10 4.9 1.6 1201182053 0.048 132 0.049 neg 0.3 <10 7.0 6.5 1201180179 0.039 88 0.061 neg 0.2 <10 5.4 6.5 1201175476 0.041 90 0.130 neg 0.2 <10 4.9 6.2 1201120114 0.031 25 0.019 neg 0.2 <10 4.0 5.1 1201125230 0.025 <25 0.006 neg 0.1 <10 0.2 0.0 1201170296 0.032 <25 0.008 neg 0.6 <10 0.6 0.1 1201122027 0.019 43 0.003 neg 0.0 <10 4.4 3.7 1201130068 0.025 158 0.076 neg 0.2 <10 6.6 4.3 1201130213 0.026 48 0.066 neg 0.1 <10 3.5 1.5 1201210009 0.037 257 0.037 neg 0.3 <10 8.4 0.8 1201200341 0.050 414 0.050 neg 0.1 <10 8.5 1.9 1201230370 0.045 164 0.045 neg 0.4 <10 7.2 0.5 1201200235 0.036 137 0.036 neg 0.3 <10 8.8 3.2 1201200266 0.029 32 0.029 neg 0.1 <10 4.5 5.5 1201230305 0.014 <25 0.006 neg 0.3 <10 0.4 0.5 1201260208 0.040 234 0.546 neg 0.3 <10 7.1 8.1 1201252085 0.014 268 0.033 neg 0.2 <10 5.4 4.6 1201255209 0.026 83 0.119 neg 0.5 <10 1.9 4.0 1201252131 0.021 1612 0.148 neg 0.2 <10 9.0 8.1 1201275001 0.019 348 0.004 neg 0.4 <10 6.7 8.1 1201260319 0.011 <25 0.001 neg 0.0 <10 0.2 0.1 1201285040 0.026 95 0.036 neg 0.1 <10 7.7 7.2 1201270018 0.027 <25 0.001 neg 0.1 <10 0.2 0.1 1201270280 0.016 292 0.074 neg 0.1 <10 7.3 6.6 1109265219 0.039 <25 0.000 neg 0.6 <10 0.1 0.0 16/113
N éch Enzygnost Virotech IFI Virotech IgM (absorb.) IgG (U/ml) IgA (absorb.) Monotest (pos/neg) VCA-IgM (index) VCA-IgM (titre) VCA-IgG (index) EBNA-IgG (index) 1110185474 0.021 <25 0.000 neg 0.1 <10 0.2 0.1 1111045382 0.020 <25 0.000 neg 0.1 <10 0.3 0.0 1111095333 0.013 38 0.013 neg 0.2 <10 6.0 3.6 1112075464 0.019 <25 0.003 neg 1.0 <10 0.3 0.1 1112075274 0.051 <25 0.003 pos 0.3 <10 0.3 0.1 1112125327 0.012 <25 0.005 neg 0.0 <10 0.1 0.2 1112195097 0.018 <25 0.004 neg 0.2 <10 0.0 0.1 1112225226 0.011 <25 0.003 neg 0.0 <10 0.0 0.0 1112225110 0.013 <25 0.001 neg 0.1 <10 0.6 0.2 1112215427 0.019 <25 0.003 neg 0.8 <10 0.2 0.1 1111145258 0.028 80 0.144 pos 0.4 <10 6.8 2.5 1111155071 0.322 <25 0.071 pos 4.8 >40 3.7 0.1 1201305418 0.056 81 0.068 neg 0.9 <10 7.1 4.0 1202025177 0.026 79 0.067 neg 0.0 <10 8.2 4.8 1202025176 0.026 39 0.008 pos 0.0 <10 4.1 2.3 1202025175 0.068 47 0.058 pos 4.3 >40 7.4 0.0 1202035175 0.034 247 0.305 neg 0.7 <10 7.2 8.0 1202065404 0.062 55 0.065 neg 0.4 <10 5.8 6.7 1202015248 0.051 105 0.043 neg 2.5 <10 9.8 9.8 1202015275 0.064 156 0.197 neg 2.6 <10 8.0 4.9 1202010238 0.024 183 0.457 neg 0.1 <10 8.0 6.2 1202022085 0.024 141 0.038 neg 1.3 <10 8.5 9.4 1202035056 0.026 228 0.034 neg 0.4 <10 8.0 6.7 1112125328 0.081 <25 0.009 pos 1.3 >40 4.0 0.2 1108305522 0.089 332 0.115 neg 4.3 >40 6.6 3.2 1109295263 0.421 <25 0.074 pos 4.0 >40 3.4 0.1 1109235191 0.123 112 0.126 neg 6.1 40 7.0 0.9 1109235217 0.161 <25 0.033 pos 4.1 >40 7.1 0.2 1109095319 0.053 50 0.001 pos 2.8 >40 6.1 0.1 1109095321 0.108 36 0.037 pos 3.0 >40 5.4 0.0 1201265069 0.393 <25 0.048 pos 5.6 >40 8.2 0.2 1107015084 0.082 <25 0.073 neg 2.4 >40 1.4 0.2 1108045198 0.048 67 0.147 neg 1.5 <10 7.6 4.1 1201195091 0.039 79 0.021 pos 0.4 <10 7.7 6.6 1112095327 0.598 55 0.709 pos 6.1 >40 5.9 0.2 Enzygnost Luminex N échantillon IgM IgG IgA EA-IgG (absorbance) (U/ml) (absorbance) (U/ml) 2011.12.28.6197 0.051 277 0.331 458 2012.01.05.4523 0.028 253 0.216 185 2012.01.14.4730 0.059 47 0.036 386 2012.01.23.4073 0.028 492 0.013 162 2012.01.24.4167 0.043 269 0.015 231 2012.01.25.4350 0.036 510 0.658 170 2012.01.27.4638 0.406 90 0.213 705 2012.02.02.6445 0.046 1042 0.806 250 2012.02.06.4042 0.031 1089 1.132 187 17/113
Les valeurs de référence se trouvent dans le tableau ci-dessous : IgM (absorb.) Enzygnost Virotech IFI Luminex IgG (absorb.) IgA (absorb.) Index Titre EA-IgG (U/ml) Négatif < 0.120 < 0.100 < 0.600 < 0.9 < 10 < 100 Douteux 0.100 0.200 0.9 1.1 10 100 120 Positif 0.120 > 0.200 0.600 > 1.1 20 > 120 Remarque : Dans la notice du fournisseur, l interprétation des valeurs est faite en densité optique, c est pour cette raison que les valeurs de référence des IgG sont données dans cette unité. Lorsque les EBV IgM et IgA sont testés sur Siemens, les puits des plaques de microtitration sont à double : la rangée gauche de chaque barrette est recouverte d antigène obtenu sur des cellules lymphoblastoïdes infestées par l EBV, alors que la rangée droite est recouverte d antigène obtenu sur des cellules pour lesquelles la synthèse virale a été inhibée (antigène de contrôle). Tous les résultats des paramètres IgM et IgA sont rendus en absorbance corrigée. Cette dernière permet d éliminer les fluctuations et les perturbations lors des mesures. C est ce que l on appelle le lissage. Les variations que nous pouvons rencontrer sont en fonction de la série et du numéro de lot. Le lissage permet donc d obtenir de plus faibles coefficients de variations pour la reproductibilité. L absorbance corrigée se calcule de la manière suivante : 1. Calculer l absorbance moyenne pour l Anti-EBV positif. D.O. = Puits avec l Ag EBV puits avec l Ag de contrôle 2. Diviser la valeur nominale indiquée par le fabricant par cette valeur moyenne de D.O. obtenue pour l Anti-EBV positif. On obtient ainsi le facteur de correction. valeur nominale Facteur de correction = valeur moyenne D.O. Anti-EBV pos 3. Calculer la moyenne pour chaque échantillon et multiplier le résultat par le facteur de correction. D.O. corrigée = D.O. échantillon facteur de correction [5] 18/113
Les Early Antigen IgG (EA-IgG) ont été testés par le laboratoire de St-Gall selon la méthode Luminex. Grâce à cette méthode, il est possible de mesurer plusieurs analytes dans 50µl de sérum, de plasma ou d une culture cellulaire. Des microbilles de polystyrène sont colorées avec différentes concentrations de deux fluorophores (rouge et infrarouge) permettant d individualiser 100 types de microbilles. Chaque type de billes est marqué avec un antigène spécifique. Un kit comprend une solution qui est composée d un mélange de différents types de microbilles (avec différents antigènes spécifiques), ceci permettant la détection de plusieurs antigènes en une seule fois. Le sérum du patient est ajouté sur les billes de polystyrène et les anticorps présents dans l échantillon vont se fixer sur l antigène spécifique. Un anticorps marqué par un fluorochrome est ajouté et se lie au complexe bille-antigène/anticorps. Microbille Antigène Anticorps du patient Anticorps marqué par un fluorochrome Le Luminex analyzer est doté d un double laser : un laser rouge qui excite les fluorochromes incorporés aux billes pour l identification précise de chacune d elles. Les billes excitées par le laser rouge réémettent, de façon différente, une fluorescence rouge et infrarouge. Elles sont donc identifiées par l intensité des deux fluorescences qui sont enregistrées par un capteur à la sortie du flux. un laser vert qui excite le fluorochrome couplé à une molécule reporter (ex : antiimmunoglobuline) et qui détecte l interaction antigène/anticorps se produisant à la surface de la bille après avoir ajouté un conjugué marqué avec un fluorochrome émettant dans le vert. La fluorescence témoigne de la réaction à la surface de la bille et détermine si la réaction est positive en fonction d un seuil de fluorescence propre à chaque bille. [7] Figure 9 et 10 : Lasers rouge et vert excitant une microbille 19/113
4.3.1 Répétabilité Elle contribue à vérifier la fidélité des résultats obtenus lors de l analyse d un même échantillon pour un paramètre défini dans des conditions standardisées (même méthode réalisée par le même opérateur, utilisant le même appareil ainsi que les mêmes réactifs pendant un court intervalle de temps). Cette étude est effectuée au cours d une même série en utilisant, dans la mesure du possible, des échantillons de niveaux de concentration différents (bas, moyen, haut). Les échantillons choisis sont dosés 3-4 fois pour le paramètre défini. Puis on détermine la moyenne, l écart-type et le coefficient de variation (CV). Celui-ci est comparé avec le CV du fabricant. [6] Répétabilité EBV IgM 5263-29.09.11 1 0.492 2 0.456 3 0.533 4 0.483 Moyenne 0.491 CV% 6.50 5333-09.11.11 1 0.023 2 0.019 3 0.018 4 0.013 Moyenne 0.018 CV% 22.5 CV du fabricant : 5.2 % (échantillon positif) 6.1 % (échantillon négatif) Le CV de l échantillon positif est un peu plus haut que celui du fabricant, mais il est néanmoins évalué comme bon. Répétabilité EBV IgG 341-20.01.12 1 520 2 567 3 544 4 537 Moyenne 542 CV% 3.59 5217-23.09.11 1 0.023 2 0.019 3 0.025 4 0.034 Moyenne 0.025 CV% 25.1 CV du fabricant : 7.6 % Le CV de l échantillon positif est bon et est également meilleur que celui annoncé par le fabricant. 20/113
Répétabilité EBV IgA Il n est pas possible de tester la répétabilité sur plusieurs niveaux de concentration pour le paramètre EBV IgA car il n y a pas de sérum positif en quantité suffisante pour le séparer en 4 tubes. Elle a donc été réalisée sur un seul échantillon négatif. 5226-22.12.11 1 0.001 2 0.001 3 0.000 4 0.004 Moyenne 0.002 CV% 115 CV du fabricant : 3.9 % (échantillon négatif) Pour les échantillons négatifs de chaque paramètre, nous obtenons de grands coefficients de variation. Ces CV élevés sont dus à des résultats rendus en absorbance avec de très petites valeurs. Une variation minime de ces valeurs donne un très grand CV. Il n y a pas de différence significative entre les valeurs des échantillons négatifs. Nous pouvons donc considérer les répétabilités de ces trois paramètres comme bonnes dans ces conditions de travail. 21/113
4.3.2 Reproductibilité Elle consiste à vérifier la fidélité des résultats obtenus lors de l analyse d un même échantillon pour un paramètre défini dans des conditions différentes (facteurs environnementaux, autre opérateur, jours différents). Cette étude est effectuée au cours de séries consécutives. Il est préconisé d employer plusieurs niveaux de concentration (bas, moyen, haut). Les échantillons choisis sont dosés 3-4 fois pour le paramètre défini. Puis on détermine la moyenne, l écart-type et le coefficient de variation (CV). Celui-ci est comparé avec le CV du fabricant. [6] Reproductibilité EBV IgM 5263-29.09.11 1 er jour 0.542 2 e 0.574 3 e 0.500 4 e 0.535 5 e 0.505 Moyenne 0.531 CV% 5.67 5464-07.12.11 1 er jour 0.035 2 e 0.043 3 e 0.037 4 e 0.037 5 e 0.036 Moyenne 0.038 CV% 8.33 CV du fabricant : 2.1 % (échantillon positif) 2.8 % (échantillon négatif) Les CV de l échantillon positif et négatif sont un peu plus élevés que ceux du fabricant mais sont toutefois considérés comme bons. Reproductibilité EBV IgG 5001-27.01.12 1 er jour 335 2 e 273 3 e 240 4 e 289 5 e 203 Moyenne 268 CV% 18.6 5217-23.09.12 1 er jour 0.044 2 e 0.024 3 e 0.026 4 e 0.040 5 e 0.025 Moyenne 0.032 CV% 29.7 CV du fabricant : 9.5% Le CV de l échantillon positif est plus haut que celui annoncé par le fabricant. Néanmoins, ce résultat est bon. Pour l échantillon négatif, le CV est un peu élevé. Cependant, il n y a pas de différence significative entre les valeurs obtenues pour cet échantillon. 22/113