Microscopie électronique en biologie
Objectif de la microscopie en biologie Imager des structures, Co-localiser les protéines ou certaines molécules Acquisition In vivo A haute résolution
Microscopie électronique
R R= 0.61 l /nsinm R = Limite de résolution
Avantages et limites de la MO M Photonique Signal Résolution Fixé ou in vivo Epaisseur l échantillon Durée de préparation Temps d acquisition Immunomar quages Milieu Photons 0.2 µm Fixé ou in vivo 1 à 50 µm Coupe ou culture Quelques sec à qlq heures Quelques ms en 2D Marquage et colocalisation Air, liquide Cheveu en MO 0.2 mm Support Lame, boite de pétri 60 µm Microsphère en MO En fluorescence on ne voit que ce qui est marqué
En Microscopie optique Muscle cardiaque en coupe longitudinale Gross. x300
En Microscopie électronique En Microscopie photonique X 1000 X 10000
Principe de la ME : Interaction électron-matière
LE Microscope Electronique à Transmission MET
Microscope Electronique en Transmission JEOL 100 Kv
La Microscopie Electronique en Transmission MO Immunofluorescence d une protéine de jonction sur culture cellulaire L image MET la même culture
Applications du MET Ultrastructure sur coupe de tissu vivant ou matériaux Immunomarquage des protéines par billes d or Diffraction électronique
Coupe MET dans une feuille d arabidopsis
Effet de peptides microbienne sur cellules cancéreuse
Phagocytose
Bacteries dans cellules
Coloration négative Virus, proteines, molecules Pas de coupes Phages Résultats rapides APT ou AcU à saturation dans l eau ou alcool 100 nm
Immunomarquage, Echantillons Système révélateur billes or (1 à 15 nm) Anticorps primaire Epitope Antigène Echantillon (tissus, cellules, ( bactéries virus, Stage d'immunomarquage en M E, Toulouse le 15 mai 2010
Marquage post synaptique d une protéine sur coupe de cellules nerveuse
LE Microscope Electronique à Balayage MEB
Interaction électron-matière
Microscope électronique à Balayage 840A de JEOL
MO MET L image MEB correspondante
Application du MEB Image de surface cellulaire ou de matériau Immunomarquage des protéines de surface par billes d or Imagerie en mode électrons rétrodiffusés Spectrométrie X
La différence entre la peau humaine et la peau de souris La surface d un cheveu humain. Notez les plaques de kératine qui se chevauchent comme des écailles 20µm Epiderme Poil Couchedes cellules desquamentes Poil Chez la souris les plaques s emboitent entre elles. Derme 20µm
Images de vaisseaux sanguins en MEB et MET MEB MET Pl N Gr N Gr 2µm
Fibrocytes Culture cellulaire Osteoblastes Osteocyte Osteoclaste
200µm 500µm 200µm Œufs et larves(chenilles) du papillon blanc Charançon perçant le grain de blé 500µm
Legionella pneumophila traité aux peptides antimicrobienne
Les différents types de grain de pollen 20µm 20µm
Pomme de terre Crue Pomme de terre cuite 200µm
Un poil de barbe coupé par la lame d un rasoir mécanique Un autre poil qui a été déchiqueté par un rasoir électrique 50µm
Cardiomyocite sur lame de culture
Cellule sanguine de Wolbachia
Col de chemise propre Col de chemise sale 200µm 200µm
Contraintes liées à l échantillon Le plus proche du vivant (Fixé) MET et MEB Ultrafin Epaisseur de coupe comprise entre 60 et 70 nm MET Déshydraté Surface conductrice MET et MEB MEB
3 jours minimum Etapes de préparations des échantillons pour la MET MET Fixation des protéines MEB 1 jour au mini Fixation des protéines Culture cellulaire Tissu ou Suspensions (virus, bactéries, ) Fixation des Lipides Déshydratation Acétone ou Ethanol Inclusion dans la résine Polymérisation 60 à 70 C dans étuve (obtention de blocs) Coupes au microtome Semi-fines ~ 1 µm Ultrafines ~ 60 à 70 nm Contraste Observation Déshydratation Acétone ou Ethanol Appareil par contournement du pt critique du CO2 CO2 liq par purges à 10 C CO2 liq /gaz 31 C (pt critique) CO2 gaz 40 C Dessiccation totale Métallisation Observation
Prise de contact : 35 36 Compétence et savoir faire : Préparation d échantillons biologiques pour l observation au MET et MEB Techniques classiques de fixation, déshydratation, inclusion et de coupes pour l analyse ultrastructurale, Techniques immunocytochimiques avec immunomarquage à l or colloïdal en pré ou post enrobage avec amplification à l argent si nécessaire. Coloration négative de macromolécules et de fractions cellulaires Réalisation de coupes fines suivi du contraste Métallisation et dessiccation par contournement du point critique. Observation aux microscopes MEB et MET. Collecte des résultats sous forme fichiers numériques Enseignements et formations
Nouvelles techniques microscopie Electronique AMW (Automatic Microwave Tissue Processor) Techniques à froid : cryofixation-cryocoupe- Cryo-MET cryo-transfert pour le MEB Tomographie électronique MEB 3 view Microscopie à balayage environnementale