SONIC HEDGEHOG GUIDES COMMISSURAL AXONS ALONG THE LOGITIDUNAL AXIS OF THE SPINAL CORD Dimitris Bourikas, Vladimir Pekarik, Thomas Baeriswyl, Asa Grunditz, Réjina Sadhu, Michele Nardo & Ester Stoeckli RICHARD & 2008/2009 BOURHANE
INTRODUCTION Durant le développement du système nerveux, les axones croissent, atteignent des cibles intermédiaires avant de continuer sur leurs destinations finale, où ils établissent des synapses de contact. Cet grand mouvement de croissance est fortement sensible aux signaux attractifs et répulsifs qui agissent comme des signaux de direction moléculaires pour le développement des neurones. Le système model le mieux connu est la croissance des axones commissuraux des neurones localisés dans la moelle épinière dorsale. Plusieurs protéines sont reconnues être impliquées dans le guidage des axones commissuraux vers la plaque du planché (la F-spondine, la nectrine- 1, NrCAM), mais pourquoi ces neurones tournent rostralement une fois atteint la plaque du plancher?
Le but de cet article est d identifier la (les) protéine(s) principale associée(s) à la plaque du plancher, impliquée(s) dans la direction rostrale des axones commissuraux le long de l axe longitudinal dans la moelle épinière.
Qu est-ce qu ils ont fait? L hybridation soustractive. Des expériences in ovo RNAi.
But hybridation soustractive: Identifier des gènes localisés dans la plaque du plancher exprimés différentiellement aux stades de développement 20 et 25 pouvant être candidats pour le rôle du guidage des neurones commissuraux. Shh
Analyses: L expérience a été faite entre le stade 20 et 25. Pourquoi au stade 25? Pourquoi au stade 20? Ces fragments d ADNc isolés et amplifiés par PCR pouvaient être utilisés non seulement pour générer de sondes in situ, mais directement pour des analyses fonctionnelles utilisant in ovo RNAi.
Les axone commissuraux en sens opposé tournent dans l axe longitudinal de la moelle épinière dans un contact étroit avec le bord de la plaque du planché.
Analyse fonctionnelle de Shh par in ovo RNAi Injection de dsrna de Shh dans le canal central de la moelle épinière de poulet, par électroporation in ovo.
dsrna 3 -UTR SHH Pas d effet sur la croissance de l axone, sa migration envers et dans la région de la plaque du planché. Cependant, plusieurs trainent dans le site exit de la plaque de plancher. La majorité des cônes de croissance (élargi) n ont pas l air de croitre dans la direction rostral, ou même tournent caudalement. Relativement quelques axones s étendent le long de l axe longitudinal. Parmi lesquels plusieurs tournent caudalement au lieu de tourner rostralement. dsrna N-ter Shh (après identification de gène) Ce qui n est pas le cas dans le contrôle. Même quand les axones commissuraux étaient analysés chez des embryons très jeunes, ils ne montraient jamais une morphologie de traine.
Conclusion: Shh est nécessaire pour la direction rostrale des axones commissuraux dans la plaque du planché.
Identification du récepteur r de Shh Ptc et Smo sont des corécepteurs de Shh. Sont ils impliqués dans l effet de Shh sur les axones postcommissuraux?
Coupe transversal au stade 23; Hybridation in situ Ni Ptc, ni Smo ne sont exprimés par les neurones commissuraux. Donc ils ne sont pas requis pour la fonction de Shh dans le guidage des axones postcommissuraux.
HIP: récepteur de Shh HIP est une protéine transmembranaire liant directement toutes les Protéines hedgehog chez tous les vertébrés Est-ce que HIP pourrait médier l effet de Shh sur les axones commissuraux?
Hybridation in situ à différents stades du développement (stades: 23, 24 et 26). Stade 23: pas d expression de HIP Stade 24: forte expression de HIP Stade 26: HIP est faiblement exprimée. Conclusion: HIP est exprimée de manière temporelle et transitoire. HIP pourrait être le RC de Shh responsable du guidage des Axones commissuraux le long de l axe longitudinal de la moelle épinière.
Confirmation du rôle de HIP par in ovo RNAi. HIP RNAi et Shh RNAi présentent le même phénotype Conclusion: HIP est le récepteur médiant l effet De Shh.
Quel est le mode d action de Shh? Chimioattractif ou chimiorepulsif?
Hybridation in situ de la moelle épinière( préparation open-book stade 25) forte faible Shh présente un gradiant le long de l axe restro-caudal. Shh semble avoir un rôle répulsif sur les axones commissuraux.
Confirmation du rôle répulsif de Shh sur les axones postcommissuraux. Électroporation in ovo Thoracic lumbosacral supérieur lumbosacral caudal Expression ectopique de Shh Expression endogene
Les axones postcommissuraux ne quittent pas La plaque du planquée lorsqu ils rencontrent une forte concentration de SHH Avec une faible expression ectopique de Shh Les axones tournent caudalement ou rostralement. Une forte expression ectopique de Shh ne changent pas le comportement des axone lorsque HIP est absent.
Confirmation in vitro du rôle répulsif de Shh marquage des axones par DiI explants de la corde spinale stade 24-25 Culture sur collagène présence de Bille Shh Bille BSA
Lorsqu on positionne les billes trempées dans Shh à 200 ou 700 µm de l explant: Les axones ne quittent pas la plaque du plancher ou tournent vers les régions opposées des billes. Lorsqu'on positionne les billes de Shh à une distance de 900µm, les axones migrent Normalement jusqu à une certaine distance( 320) puis elles changent de direction). Conclusion: Shh à un rôle répusif sur des axones postcommissuraux le long de l axe Longitudinal de la corde spinale.
conclusion: Shh guide les axones commissuraux rostralement le long de l axe longitudinal de la corde spinale. Au stade précoce du développement des axones, Shh a un effet attractant médié par SMO et Ptc. Hip est le récepteur qui Médie l effet répulsif de Shh sur les axones Commissuraux et il est exprimé dans le temps et dans l espace. Hip est une protéine transmembranaire qui manque le domaine intracellulaire. Comment Hip transmet le signal de Shh? Peut être Hip est un composent d un complexe de récepteur dont il serait le sous unité qui se lie à Shh et qu il existe Une sous unité non identifiée qui transmet le signal de Shh. Hypothèse: Coopération entre Shh, sfrps (secred frizzled-related proteins) et Wnt4