Cécile M. Bébéar 04/12/2006 1 L ADN BACTERIEN. - Chromosome - Plasmides

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 1 L ADN BACTERIEN - Chromosome - Plasmides

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 2 1. Chromosome 1.1 Mise en évidence 1.1.1 Microscopie optique - Difficile (beaucoup d ARN) - Après RNAse puis colorants basiques - Agents intercalants fluorescents bromure d'éthidium (UV), acridine orange é

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 3 1.1.2 Microscopie électronique - Aspect fibrillaire, clair - Pas de membrane nucléaire

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 4 1.2 Structure et organisation 1 seul / bactérie, circulaire, pas de membrane nucléaire - marquage à la thymidine tritiée 3 H - transfert génétique par conjugaison Exceptions : - Chromosome linéaire: Borrelia, Streptomyces - 2 ou 3 chromosomes: Brucella, Vibrio cholerae, etc.. A l'intérieur de la cellule: molécule d'adn circulaire surenroulé, sous la responsabilité d'enzymes essentielles, les topoisomérases (ADN gyrase) E. coli : 1,6 mm (bactérie : 1 x 2 µm) Surenroulement = moyen idéal pour compacter une molécule circulaire dans un petit espace

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 5 formes topologiques : superenroulée, circulaire relâchée ou linéaire, visibles par ultracentrifugation, m. électronique ou électrophorèse en gel d agarose.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 6 Taille Organisation in vivo - Core central + boucles (50) Core : ARN polymérase + ARN (messagers) - Lien avec la membrane cytoplasmique

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 7 Réarrangements génomiques au sein du génome bactérien: délétion, duplication, inversion 1.3 Réplication de l'adn Semi-conservative Démarre à une origine de réplication, avec une fourche bidirectionnelle Système très complexe avec nb ses protéines et enzymes - ADN polymérases - topoisomérases - utilisation pratique en BM (séquençage, PCR, hybridation ADN avec sondes marquées) Applications Pratiques Caractérisation de l ADN Amplification de l ADN Séquençage de l ADN ADN, cible d antibiotiques

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 8 1.4 Caractérisation de l ADN bactérien 1.4.1 Taille 1.4.2 Composition en bases : % G+C - paramètre quantitatif Tm (température de fusion) simple brin double brin Séparation des 2 chaînes de la double hélice par dénaturation DO 260, fonction du nb de paires GC : - variable en fonction des espèces - critère taxonomique, de classification des bactéries Ex : 26-28% pour les mycoplasmes 60% pour certaines espèces

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 9 1.4.3 Hybridation ADN-ADN % 70% : même espèce 30 < % < 70% : espèces proches 1.4.4 Etude du polymorphisme de restriction de l ADN chromosomique - Intérêt épidémiologique pour faire une comparaison fine de souches de même espèce ou pas (infection nosocomiale) - Hydrolyse de l ADN par les enzymes de restriction : profil de restriction, différent suivant les espèces bactériennes et les souches au sein d une même espèce - 3 méthodes Profil de restriction après électrophorèse conventionnelle (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 10 Lecture difficile car nombre de bandes très élevé Présence de plasmides perturbation du profil Interprétation simplifiée possible avec un logiciel informatique Etude après hybridation (Southern blot) - Plusieurs étapes 1. Hydrolyse de restriction de l ADN bactérien total et séparation des fragments par électrophorèse conventionnelle en gel d agarose 2. Transfert sur membrane de nylon ou nitrocellulose 3. Hybridation avec une sonde nucléique marquée "chaude ou froide" Lecture simple nombre réduit de bandes révélées

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 11 1-clivage enzymatique de restriction 2- électrophorèse sur gel d'agarose 3- dénaturation dans le gel des fragments de restriction 4- transfert sur support solide (membrane de nylon ou nitrocellulose) par capillarité (buvardage) 5- fixation de l'adn sur la membrane par cuisson (mb. nitrocellulose) ou exposition U.V (mb.nylon) 6- hybridation avec une sonde marquée dénaturée 7- lavages 8- autoradiographie

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 12 Sondes utilisables? Complémentaires de : - un gène spécifique - une séquence d insertion Ex: programme national de comparaison des génotypes de M. tuberculosis RFLP IS6110 - gènes codant pour les ARNr 16S, 23S = ribotypage ou ribotypie (cf ARN) FIG. 3. Southern blot hybridization of the IS probe to EcoRI digests of DNAs from 11 strains of M. fermentans. The unmarked lane corresponds to the size marker (in base pairs). Lanes 1 to 7, articular isolates, lane 8, urethral isolate; lanes PG (strain PG18) K7, and Mi, references strains. (A) Ethidium bromide-stained 0.8% agarose gel. (B) Autoradiography of a Southern blot of the gel in panel A for the IS. - Principe Profil de restriction après électrophorèse en champ pulsé (PFGE) Champs électriques dans des angles de direction différents et activés alternativement (champs pulsés). "Gold standard" des méthodes de typage moléculaire. Obtention de gros fragments d ADN, enzymes de restriction qui coupent peu.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 13 - Différents systèmes, règles d interprétation - Exemple : Enquête microbiologique épidémiologique sur différentes souches de Legionella pneumophila Définir s'il s'agit d'une légionellose communautaire (liée ou non à un voyage) ou nosocomiale, et de repérer les cas groupés.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 14 1.5 Amplification d une séquence déterminée par Polymerase Chain Reaction (PCR) Objectif : obtenir un grand nombre de copies d une séquence donnée d ADN Plusieurs étapes : dénaturation, hybridation, extension Notion de PCR en temps réel, de PCR quantitative Applications en Bactériologie - Détection de certaines bactéries de culture difficile (Chlamydia trachomatis)

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 15 - Caractérisation de certains gènes : facteurs de virulence, résistance aux antibiotiques (gène meca) etc - Comparaison de souches

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 16 1.6 Séquençage de l ADN Technique enzymatique de Sanger aux didésoxynucléosides triphosphates ou "terminateurs de chaîne" ++ Principe : synthèse d'un brin d'adn complémentaire du brin dont on veut déterminer la séquence 5' GCTAAGTCCTGTGAC 3' 3' CTG 5' Utilisation d'une amorce qui va se fixer en 3' du brin à séquencer, à partir de laquelle l'adn polymérase va copier la matrice. Utilisation de didésoxynucléosides triphosphates (ddntps) analogues de désoxynucléosides triphosphates (dntps) sans groupement OH en 3' incorporation dans une chaîne d'adn en cours de synthèse puis STOP de la chaîne (pas de liaison suivante possible). Automatisation du séquençage à l'heure actuelle avec un marquage non radioactif par des fluorochromes des ddntps : fluorescence émise lue par un laser qui transmet les informations à l'ordinateur.

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Cécile M. Bébéar 04/12/2006 18 A B Traitement informatique de la séquence Exemple d'un gel de séquençage et d'un électrophorégramme. L image de la migration électrophorétique des produits d extension (A) est traitée à l aide du logiciel «Sequencing Analysis 3.3» afin de déterminer la séquence nucléotidique du produit de chaque piste (B).

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 19 1.7 Antibiotiques agissant sur l ADN 1.7.1 Quinolones et fluoroquinolones - Acide nalidixique, ciprofloxacine - Blocage de la synthèse de l ADN au niveau de 2 topoisomérases bactériennes ADN gyrase : GyrA, GyrB Topoisomérase IV : ParC, ParE interaction complexe entre quinolone, enzymes et ADN inhibition de la réplication 1.7.2 Rifampicine Inhibition de la transcription de l ADN en ARNm par inhibition de l ARN polymérase (sous-unité β). 1.7.3 Nitroimidazolés - Actifs à l état réduit : seulement chez anaérobies - Fixation des dérivés réduits sur l ADN coupures des brins bactéricidie 1.7.4 Nitrofuranes - Inhibition de la synthèse des folates - Rôle essentiel dans la synthèse des acides nucléiques

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 20 2. Plasmides 2.1 Définitions ADN bicaténaires, extrachromosomiques Ex : contenu plasmidique de souches de Klebsiella Capables de réplication autonome : réplicons (oric +) Transmis de façon stable à la descendance Facultatifs propriétés nouvelles, meilleure adaptation des bactéries Aspect - 0,5 à 500 kpb - circulaires sauf certains linéaires (Borrelia burgdorferi: 1 chr. linéaire + 21 plasmides linéaires) Nomenclature : pip15, puc etc. 2.2 Réplication Différents systèmes Utilisent les enzymes de la bactérie ou codent pour leurs propre enzymes

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 21 Contrôle génétique, propre au plasmide régulat du nombre de copies du plasmide dans la bactérie : - grands plasmides : 1 ou 2, plasmides monocopies - petits plasmides : plusieurs, plasmides multicopies (10 à 50 ) vecteur de clonage ++ Classification en groupe d incompatibilité (Inc) 2.3 Transfert horizontal 2.3.1 Plasmides conjugatifs - Autotransférables d'1 bactérie à 1 autre par la conjugaison, souvent sans spécificité d hôte (diffusion entres espèces différentes ++) - Grands plasmides, plasmide F chez E. coli: 90 kb codent pour pili : exemple pili F ou pili sexuels

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 22 2.3.2 Plasmides non conjugatifs - Petits plasmides 5 kb - Transfert possible o par mobilisation (coexistence avec un plasmide conjugatif) o ou par transduction, transformation 2.4 Rôle dans la résistance aux ATB 2.4.1 Mise en évidence Epidémie de diarrhées à entérobactéries (Shigella) multirésistantes au Japon (1950) 2.4.2 Fréquence Mécanisme de résistance le plus répandu Présents chez la plupart des Gram+ et Gram-

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 23 2.4.3 ATB concernés : tous! - β-lactamines, aminosides, macrolides, chloramphénicol, tétracyclines - Plusieurs gènes de résistance sur 1 plasmide - Mécanisme : souvent production d enzymes inactivant l antibiotique - Egalement résistance antiseptiques, métaux lourds.. 2.4.4 Transfert - Transfert horizontal extension résistance, entre espèces voisines ou pas - Transfert entre 2 plasmides, ou entre plasmide et chromosome (transposon, intégron) 2.5 Rôle dans le pouvoir pathogène - Exotoxines (E. coli) - Facteurs d adhérence - Facteurs invasifs (Shigella) - Oncogénèse.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 24 2.6 Métabolisme - Acides aminés, hydrates de carbone, hydrocarbures 2.7 Plasmides cryptiques Ex : Addition de toutes ces propriétés dans une seule souche bactérienne 2.8 Caractérisation des plasmides 2.8.1 Nombre, taille - Comparaison du profil plasmidique de différentes souches. - Comparaison de la taille des fragments obtenus après hydrolyse de restriction.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 25 - Limites : o mobilité et instabilité des plasmides o possibilité de modification génétique des plasmides (transposition) o faible pouvoir discriminant si les bactéries hébergent seulement 1 ou 2 plasmides. o technique supplantée actuellement par l étude de l ADN chromosomique. 2.8.2 Structure : extraction, purification et analyse de l'adn plasmidique

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 26 3. Transposons (Tn) 3.1 Historique - Expériences de génétique du maïs - Recombinaison de gènes de résistance aux antibiotiques avec accroissement de la taille du plasmide receveur. 3.2 Définitions - Séquences d'adn mobiles pouvant se déplacer d'un site à un autre de l'adn sans jamais apparaître sous forme libre - 700 à 10 000 pb - Pas de réplication autonome mais codent pour leur propre transposition (transposase) - Transposition : addition de gènes de taille définie au sein d un génome (chromosome ou plasmide) en l absence d homologie de séquence nucléotidique :

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 27 o au sein d'un même chromosome Chromosome Chromosome Chromosome Plasmide o Pas besoin d'homologie génétique entre le Tn et le site d'insertion pour qu'il y ait intégration ou transposition = recombinaison illégitime - Plusieurs modes de transposition selon, par ex, qu'il y ait ou non conservation du Tn au site donneur. - Tn conjugatifs, capables d'autotransfert, de grande taille. Ex: Tn916 (gène tet(m) de résistance à la tétracycline) chez Enterococcus faecalis, transféré in vitro et in vivo chez espèces bactériennes. 3.3 Classification - Les plus simples: séquences d'insertion des bactéries "IS", extrémités identiques avec séquences inverses répétées (IR), (Figure (a)). - Les plus complexes: véhiculent d'autres gènes que ceux nécessaires à leur transposition (excision + intégration) ex : gènes de R aux ATB, (Figure (b)). - Plusieurs familles de Tn, chez les bactéries à Gram négatif et bactéries à Gram positif.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 28 3.4 Conséquences lors de l'insertion dans l'adn Modifier l'expression des gènes de la bactérie - Patrimoine génétique commun à la bactérie, «génie génétique in vivo» de la bactérie. - Tn=agent mutagène par insertion : - Réarrangements génomiques - Propriétés additionnelles portées par les gènes du Tn (R ATB, gènes de virulence) - Utilisés en biologie moléculaire: mutagenèse in vitro par transposition aléatoire

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Cécile M. Bébéar 04/12/2006 30 4. Intégrons (In) 4.1 Définition - Système de capture et d expression des gènes sous forme de cassettes. - Cassettes : éléments génétiques mobiles capables d être intégrés et excisés par un mécanisme de recombinaison site spécifique médié par une intégrase - Insérés dans des plasmides, des transposons ou dans le chromosome bactérien - bactéries à Gram négatif+++ Plasmide Transposon Intégron 4.2 Structure - Incapables d auto réplication, immobiles - Portés par 1 réplicon (plasmide ou chromosome) ou 1 élément transposable - Plusieurs classe d In selon la nature des gènes codant pour l intégrase

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 31 - Différences avec les Tn : Pas de gène dans les cassettes qui catalyse leur mouvement pas de séquences inversées répétées aux extrémités intégrase cassette 4.3 Fonction - Cassettes : gènes de résistance aux ATB ou aux antiseptiques dissémination, mosaïque de combinaisons ++ - Bactéries à Gram négatif essentiellement, >60 cassettes décrites 5. Modifications de l ADN génomique (génétique bactérienne) - Modification du génome : mutations, modulation de l expression des gènes. - Acquisition de gènes (transformation, conjugaison, transduction).

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 32 - Applications en biologie moléculaire (recherche, industrie alimentaire, pharmaceutique) : clonage de gènes, mutagenèse par insertion, transfert de plasmides etc Pour en savoir plus : http://www.microbesedu.org/etudiant/

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 33 LE RIBOSOME BACTERIEN Très nombreux : 25 000 / bactérie en active aspect granulaire Certains : polyribosomes liés à l'arnm (~ 40) parfois liés à la membrane cytoplasmique 1. Structure 1.1 Taille : ~ 20 nm 1.2 Deux sous-unités 30S 50S 70S 1 ensemble (70S) ou 2 sous-unités fonction de la [c] en Mg++ : forte [c] 2-20 mm 70S faible [c] 0,1-1 mm 30S + 50S Aspect asymétrique «armchair-like» : 50S «embryo-like» : allongée (30S)

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Cécile M. Bébéar 04/12/2006 35 2. Composition Globale : 2/3 ARNr 1/3 protéines 36 (L1 - L36)

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 36 A B Rotation 90 Tunnel de sortie C D Figure 12. Structure du ribosome 70S de T. thermophilus déterminée par cristallographie aux rayons X (355). A. Vue de l interface entre les deux sous-unités, sous-unité 30S à gauche, sous-unité 50S à droite avec un aminoacyl-arnt en orange à l interface, au niveau du site A. B. Vue de l arrière de la sous-unité 50S, indiquant la sortie du tunnel. C. Vue de la sous-unité 50S depuis l interface entre les deux sousunités. Les ARNt présents aux sites A, P et E sont en orange et rouge. D. Vue de la sous-unité 30S depuis l interface entre les deux sous-unités. 39

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 37 3. Protéines ribosomiques B C D Figure 15. Le tunnel de sortie des polypeptides (d après 219). A. La sous-unité 50S a été coupée en deux dans la longueur du tunnel et ouverte comme un livre. L ARNr est en bleu clair; les protéines sont en vert. PT, centre peptidyl transférase. B. Localisation des domaines de l ARNr 23S et des protéines ribosomiques autour du tunnel. C. Vue rapprochée de la première moitié du tunnel montrant la proximité du centre peptidyl transférase et des protéines L4 et L22 formant une constriction. D. Structure secondaire de l ARNr 23S. Les séquences approchant le tunnel sont en rouge.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 38 Exemple d applications: - Etude de l assemblage des ribosomes - Etude de la résistance aux antibiotiques agissant sur le ribosome 4. ARN ribosomiques ARNr 4.1 Opérons ribosomiques - Regroupent les gènes codant pour les ARNr - Nombre variable selon les espèces 1 à 2 pour mycoplasmes 7 pour E. coli (rrna etc... ) E. coli

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 39 4.2 Structure générale d un opéron ribosomique - Gène 16S - ARNt - gène 23S - gène 5S ARNt - Séquence des opérons - gènes des ARNr presque identiques pour une bactérie et très conservés entre les espèces - régions situées avant, entre et après les gènes, différentes («spacers») - région 16S 23S : 1 ou 2 trna région après 5S : 0 à 2 trna - ARNr 16S très utilisé - séquences connues pour très nb bactéries - zones très conservées, zones variables (signature oligonucléotidique pour certains groupes de bactéries)

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 40 4.2 Structure des ARNr - ARNr 16S organisé en 4 domaines (structure secondaire)

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 41 - ARNr 23S organisé en 6 domaines 5. Applications 5.1 Phylogénie - ARNr 16S : chronomètres moléculaires - Arbre phylogénique Appréciation des distances phylogéniques entre bactéries

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Cécile M. Bébéar 04/12/2006 44 5.2 Identification d'espèces nouvelles Ex : maladie de Whipple - 1991 : ARNr 16S d une nouvelle bactérie classée dans actinomycètes - 1997 : 1 ère culture : Tropheryma whippleii 5.3 Détection par PCR - Séquences prises dans gènes ARNr 16S - Très utilisées pour l'amplification 5.4 Caractérisation des espèces : ribotypie RFLP et Southern blot avec une sonde complémentaire des gènes codant pour les ARNr (ribotypage ou ribotypie) : - universelle, séquences très conservées entre espèces bactériennes ARNr 16S et 23S E. coli - discriminante, gènes codant pour les ARNr groupés en opérons présents en plusieurs copies, situées à des endroits différents sur les chromosomes bactériens profils obtenus Les espèces ayant plusieurs opérons ribosomiques (E. coli) donneront des profils variables.

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 45 Celles ayant 1 seul opéron ribosomique (M. pneumoniae) donneront des profils homogènes ribotype caractéristique de l'espèce mais trop faiblement discriminant comme marqueur épidémiologique Large application épidémiologique 5.5 Site d action des antibiotiques

Cécile M. Bébéar 04/12/2006 46 5.5.1 Grande SU 50S Macrolides et apparentés Inhibition élongation, erreurs de lecture, interruption prématurée de la traduction du polypeptide ARNr 23S domaines II et V Chloramphénicol Inhibition élongation, pas de transpeptidation ARNr 23S, domaine V Oxazolidinones Inhibition phase d initiation de la traduction ARNr 23S Acide fusidique Inhibition translocation 5.5.2 Petite SU 30S Tétracyclines Inhibition de la fixation du complexe aa-arnt sur le site aminé A du ribosome, ARNr 16S Aminosides Inhibition de la translocation, ARNr 16S