Université catholique de Louvain Faculté de Médecine École de Pharmacie Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire Mémoire présenté par Sophie Denamur en vue de l obtention du diplôme de Licence en Sciences Biomédicales Orientation Toxicologie Promoteur : Pr. M.P. Mingeot-Leclercq Année académique 2006-2007
Apoptose : un marqueur de toxicité des aminoglycosides? Étude comparative sur cellules en culture incubées avec de la gentamicine et de l amikacine.
Introduction Aminoglycosides Infections sévères à Gram négatif Molécules polaires et polycationiques. Fonctions aminées chargées positivement à ph acide Ototoxicité et néphrotoxicité HO H 3 C HN H 3 C HO H 2 N O OH O H 2 N OH O OH R HO H 2 N O gentamicine O NH 2 CH R 1 R 2 OH HO OH O HO O O NH 2 N H NH 2 amikacine Sophie Denamur 3
Introduction Toxicité sélective Accumulation spécifique des aminoglycosides : Interaction avec les phospholipides acides de la membrane plasmique Endocytose médiée par la mégaline Sophie Denamur 4
Introduction Manifestations cliniques de néphrotoxicité Phospholipidurie et présence d enzymes lysosomiaux dans l urine Protéinurie Polyurie Augmentation de l urée sanguine et de la créatinine Anurie (au stade terminal, très rare) Sophie Denamur 5
Introduction Comparaison de l induction de néphrotoxicité in vivo Mean nephrotoxicity score 15 10 5 0 GEN AMK Control 1 2 3 4 5 Multiples of human dose Score déterminé en fonction de la dégénérescence tubulaire, de l inflammation péritubulaire, de la nécrose tubulaire, de la dilatation tubulaire, de la basophilie tubulaire et de la fibrose interstitielle Hottendorf et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1981; 19 (6) : 1024-1028 Sophie Denamur 6
Introduction Mécanismes de néphrotoxicité Mingeot-Leclercq & Tulkens, 1999, Antimicrob. Agents Chemother., 43 : 1003-1012 Accumulation dans les lysosomes (Tulkens et al. 1978) Phospholipidose (Kosek et al.,1974; Aubert-Tulkens et al., 1979; Laurent et al., 1982; Mingeot-Leclercq et al., 1988; Laurent et al., 1990; Piret et al., 1992) Apoptose (El Mouedden et al., 2000.a, b) Sophie Denamur 7
Introduction Apoptose Phénomène actif Perte des contacts intercellulaires Modifications de la membrane plasmique (translocation des PS) Altérations du cytosquelette Réduction du volume cellulaire Condensation de la chromatine Sophie Denamur 8
Introduction Apoptose (2) Fragmentation de l ADN Pas de changement apparent des organites subcellulaires Formation de corps apoptotiques Voie intrinsèque (mitochondriale) ou voie extrinsèque (death receptors) http://dialogica.com.ar dialogica.com.ar/medline/archives/2004/07/ apoptosis_celul.html Sophie Denamur 9
Sophie Denamur 10
Introduction Rôle du réticulum endoplasmique Sandoval and Molitoris, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004 ; 286 : 617-624 Sophie Denamur 11
Introduction Apoptose in vitro Induction d apoptose in vitro sur différents types cellulaires El Mouedden et al., Toxicological Sciences 2000; 56 : 229-239 Sophie Denamur 12
Introduction Néphrotoxicité in vivo El Mouedden et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44 : 665-675 Sophie Denamur 13
Introduction Objectifs du mémoire L apoptose observée in vitro peut-elle constituer un marqueur prédictif de la toxicité d aminoglycosides? Meilleure compréhension du mécanisme d induction d apoptose par la gentamicine et l amikacine Sophie Denamur 14
Modèles cellulaires et antibiotiques utilisés Matériel et méthodes LLC-PK1 : lignée cellulaire provenant du tube contourné proximal de rein de porc J774 : lignée de macrophages dérivée d'un réticulosarcome de souris Gentamicine : Geomycin Pro injection 40 mg/ml, Schering-Plough, mélange de gentamicine C1, C1a et C2 Amikacine : Amukin, solution injectable IV-IM 50 mg/ml, Bristol-Myers Squibb Belgium Sophie Denamur 15
Quantification du nombre de cellules en apoptose : technique du DAPI Matériel et méthodes 4, 6 -diamidine-2 phenylindole dihydrochloride Agent intercalant Cellule apoptotique p p q Cellules non apoptotiques Marquage des noyaux Sophie Denamur 16
Matériel et méthodes Détermination de l'activité apoptogène d'un composé : dosage de l'activité de la caspase 3 OH O O O O N H O H N N H O H N N H OH O O AMC O O O H Clivage du substrat Ac-DEVD par la caspase 3 et libération de l AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) Evaluation de l activité de la caspase 3 (caspase effectrice) Sophie Denamur 17
Détermination de la cytotoxicité cellulaire : dosage de lactate déshydrogénase (LDH) Mesure de la consommation de NADH au cours de la réduction du pyruvate en lactate par la lactate déshydrogénase Matériel et méthodes O O O - + NADH +H LDH O - + NAD + H 2 O O pyruvate OH lactate Évaluation du relargage de LDH dans le milieu Sophie Denamur 18
Matériel et méthodes Évaluation de la concentration cellulaire en aminoglycosides : dosage microbiologique Détermination de la concentration en aminoglycosides grâce au diamètre d inhibition de croissance de Bacillus subtilis induit par l échantillon sur une gélose. Droite d'étalonnage Diamètre d'inhibition (cm) 4 3 2 1 0 y = 1,0961x + 1,3579 R 2 = 0,9926-0,500 0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 Log concentration AMK (µg/ml) Sophie Denamur 19
Matériel et méthodes Electroporation Aminoglycosides directement amenés dans le cytosol Tampon d électroporation contenant l aminoglycoside 8 pulses d ondes carrées, 800V/cm, 1ms Milieu de culture et incubation de 24h à 37 C sous 5% CO 2 Pulse power supply Electrodes Electrical contacts Cells in suspension Sophie Denamur 20
Matériel et méthodes Autres techniques Perméabilisation lysosomiale (acridine orange) Délocalisation du cytochrome c (fractionnement, immunoprécipitation, western blot) Sophie Denamur 21
Résultats Induction d apoptose dans les LLC-PK1 Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine DAPI % of apoptotic cells (DAPI [+]) 25 20 15 10 5 0 24h 48h 72h 0 1 2 3 gentamicin extracellular concentration (mm) % of apoptotic cells (DAPI [+]) 25 20 15 10 5 0 24h 48h 72h 0 3.162 6.325 9.445 amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 22
Induction d apoptose dans les LLC-PK1 (2) Résultats Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine Caspase-3 Caspase-3 activity (% of control) 500 400 300 200 100 24h 48h 72h 0 1 2 3 gentamicin extracellular concentration (mm) Caspase-3 activity (% of control) 500 400 300 200 100 24h 48h 72h 0 3.162 6.325 9.445 amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 23
Induction d apoptose dans les LLC-PK1 (3) Comparaison gentamicine / amikacine à 24h Caspase-3 Résultats Caspase-3 activity (% of control) 500 400 300 200 100 a GEN AMK a a a *** *** b b Activité de la caspase-3 après 24h d incubation avec de la gentamicine ou de l amikacine 0 00.003 0.03 0.3 3 Extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 24
Induction d apoptose dans les LLC-PK1(4) Résultats Caspase-3 / DAPI en fonction de la concentration et du temps - Gentamicine % apoptotic cells (DAPI [+]) 25 20 15 10 5 0 24h 48h 72h Time 500 400 300 200 100 0 Caspase-3 activity (% of control) DAPI 2mM DAPI 3mM Caspase-3 2mM Caspase-3 3mM Sophie Denamur 25
Résultats Induction de nécrose dans les LLC-PK1 Effet temps effet concentration gentamicine / amikacine LDH incubation 24h incubation 72h Co GEN 1mM GEN 2mM GEN 3mM AMK 3.162mM AMK 6.325mM AMK 9.445mM 100 75 50 25 0 *** *** % of LDH released Co GEN 1mM GEN 2mM GEN 3mM AMK 3.162mM AMK 6.325mM 100 75 50 25 0 *** *** ** % of LDH released AMK 9.445mM Sophie Denamur 26
Résultats Mise en évidence in vitro d une différence significative entre l effet apoptogène de la gentamicine et celui de l amikacine, qui reflète leur toxicité in vivo. Sophie Denamur 27
Généralisation des résultats à une autre lignée cellulaire (macrophages J774) Effet concentration gentamicine / amikacine Incubation 24h DAPI - LDH Résultats % of apoptotic cells (DAPI [+]) 25 20 15 10 5 0 0 GEN AMK *** *** 0.3 1 2 3 6 12 extracellular concentration (mm) % of LDH released 25 20 15 10 5 0 0 0.003 GEN AMK 0.03 0.3 3 extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 28
Généralisation des résultats à une autre lignée cellulaire (macrophages J774) Effet concentration gentamicine / amikacine Incubation 24h DAPI - LDH Résultats % of apoptotic cells (DAPI [+]) 25 20 15 10 5 0 0 GEN AMK *** *** 0.3 1 2 3 6 12 extracellular concentration (mm) % of LDH released 100 75 50 25 *** *** *** 0 0 3 4 6 8 9 12 amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 29
Résultats Reproductibilité des résultats dans un autre type cellulaire Sophie Denamur 30
Mécanisme d induction d apoptose Résultats Importance de la quantité d'aminoglycosides accumulée au sein des cellules Rôle des aminoglycosides dans le cytosol (électroporation) Sophie Denamur 31
Accumulation des aminoglycosides au sein des cellules Résultats Cc/Ce Toxicité (apoptose) GEN 4 +++ AMK 2.5 + Sophie Denamur 32
Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol des cellules LLC-PK1 Effet concentration gentamicine / amikacine DAPI après électroporation % of apoptotic cells (DAPI [+]) 20 15 10 5 0 0 *** *** *** *** *** 0.03 0.064 0.128 0.256 0.512 Gentamicin extracellular concentration (mm) 1 % of apoptotic cells (DAPI [+]) 20 15 10 5 0 0 0.09 0.144 0.288 0.576 1.536 Amikacin extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 33 3
Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol (2) Effet concentration gentamicine / amikacine Dosage activité caspase-3 après électroporation Caspase-3 activity (% of control) 300 200 100 0 0 0.003 * ** * 0.03 0.064 0.128 0.256 0.512 1 Gentamicin extracellular concentration (mm) Caspase-3 activity (% of control) 300 200 100 0 0 0.009 0.09 0.384 Amikacin extracellular concentration (mm) 1.54 3 Sophie Denamur 34
Résultats Induction d apoptose par les aminoglycosides dans le cytosol (3) % of apoptotic cells (DAPI [+]) 20 15 10 5 0 0 0.03 0.064 0.128 0.256 0.512 Gentamicin extracellular concentration (mm) 1 300 250 200 150 100 Caspase-3 (% of control) Caspase-3 DAPI Sophie Denamur 35
Résultats Accumulation après électroporation Cellular concentration (µg/ml) 120 100 80 60 40 20 GEN AMK 0 0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 Extracellular concentration (mm) Sophie Denamur 36
Résultats Accumulation après électroporation (2) Cc/Ce Toxicité (apoptose) GEN 6 +++ AMK 11.3 + Sophie Denamur 37
Résultats Comme dans les cellules incubées, la gentamicine induit nettement plus d apoptose que l amikacine L effet apoptotique est détectable à des concentrations beaucoup plus faibles lorsque les cellules sont électroporées Le rapport Cc/Ce dans les cellules électroporées n est pas directement lié à la quantité d apoptose induite, alors que ces facteurs semblent être en relation directe dans les cellules incubées Sophie Denamur 38
Discussion et perspectives Apoptose in vitro vs toxicité in vivo Mise en évidence d une différence significative entre l effet apoptogène de la gentamicine et celui de l amikacine, qui reflète leur toxicité in vivo. l apoptose pourrait être un bon marqueur prédictif de la toxicité induite in vivo par des aminoglycosides. Sophie Denamur 39
Discussion et perspectives Apoptose, bon marqueur prédictif? Élargissement de l étude à d autres aminoglycosides : molécules déjà commercialisées (ex : isépamicine) et des molécules en développement (ex : sous composés de la gentamicine) Sophie Denamur 40
Discussion et perspectives Modèles cellulaires Résultats observés sur les LLC-PK1 généralisables à un autre type cellulaire (macrophages J774) Accumulation semblable dans les deux types cellulaires capture indépendante de la mégaline dans les LLC-PK1 Perspective : utilisation de cellules LLC-PK1 exprimant la mégaline Sophie Denamur 41
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (1) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 42
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (2) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB Vérification de la localisation subcellulaire des aminoglycosides après incubation et électroporation AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 43
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (3) INCUBATION ELECTROPORATION Meilleure compréhension des mécanismes de perméabilisation lysosomiale AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 44
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (4) INCUBATION ELECTROPORATION Mise en évidence de la sortie des aminoglycosides à partir des lysosomes vers le cytosol AG Lysosome AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB Sophie Denamur 45
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (5) Suivi de la cathepsine D INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Sophie Denamur 46
Discussion et perspectives Compréhension du mécanisme (6) INCUBATION ELECTROPORATION AG Lysosome Apoptose directement liée à la concentration cellulaire en AB AG Pouvoir apoptotique intrinsèque Implication de la mitochondrie dans l apoptose induite par les AG Sophie Denamur 47
A ma promotrice, Madame le Professeur M.P. Mingeot-Leclercq, aux Professeurs F. Van Bambeke et P. Tulkens, à tous les membres de l équipe FACM, Merci Sophie Denamur 48
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CMIs moyennes (mg/l) des aminoglycosides pour des bactéries pathogènes courantes GENTA AMIKA Staph. aureus 0.25 1 Coagulase-negative staphylococci 0.03 0.25 Str. pyogenes 4 32 Str. pneumoniae 4 64 E. faecalis 16 128 N. meningiditis 16 32 N. gonorrhoeae 4 16 H. influenzae 0.5 1 E. coli 0.5 2 K. pneumoniae 0.5 2 B. fragilis R R M. tuberculosis R 1 Sophie Denamur 50
Sophie Denamur 51 Chan S-L et al,clin & Exp Pharmacol and Physiol 2004, 31:119-128
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Perméabilisation des lysosomes Control 4h Gentamicin 2mM 4h MSDH 25µM 3h H. Servais et al.,toxicology and Applied Pharmacology 2005 : 206; 321 333 Sophie Denamur 53
Effet de la gentamicine directement dans le cytosol Servais et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 2006 ; 50 (4) : 1213-1221 Sophie Denamur 54
Détermination de la perméabilisation lysosomiale : acridine orange AO 5 µg/ml 37 C 15 min AO AOH+ λ ex : 485 nm; λ em : 530 nm and 620 nm AOH+ Control cells Gm1-2-3 mm Amk 3-6-9 mm Millot et al., 1997 Neuzil et al., 2002 AO AOH+ AO+ H+ AO Monomer Emission 530 nm AO Multimer Emission 620 nm Sophie Denamur 55
Introduction 16h 9 mars 2007 Sophie Denamur - FACM 56
Matériel et méthodes Mise en évidence de la délocalisation du cytochrome c Fractionnement cellulaire Immunoprécipitation Western blot Sophie Denamur 57
Matériel et méthodes Fractionnement cellulaire Homogénat Basse vitesse (3 x) 2000 rpm (783g) 1800 rpm (634g) 1600 rpm (501g) Haute vitesse 40000 rpm (195.000 g) Surnageant (cytoplasme) Fraction nucléaire (noyaux) Fraction MLP (mitochondries, lysosomes, peroxysomes) Sophie Denamur 58
Matériel et méthodes Immunoprécipitation Sophie Denamur 59
Matériel et méthodes Western blot Migration dans un gel de polyacrylamide Transfert sur membrane de nitrocellulose Marquage avec anticorps (primaires et secondaires) Révélation Sophie Denamur 60
Résistance acquise (GEN) APH (3 )-I AAC (2 ) ANT (4 )-I HO H 3 C HN H 3 C O OH O HO H 2 N O O CH R 1 R 2 H 2 N NH 2 APH (2 ) + AAC (6 ) ANT (2 )-I AAC (3) AAC (6 )-II et IV Sophie Denamur 61
Résistance acquise (AMK) HO H 2 N OH O OH APH (3 )-II, III, IV, VI, VII ANT (4 )-II OH HO OH O HO O O NH 2 NH 2 APH(2 ) + AAC(6 ) R N H AAC (6 )-I I et III Sophie Denamur 62