Détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260

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1 Détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 Manuel d'utilisation Agilent Technologies

2 Avertissements Agilent Technologies, Inc , 2013 Conformément aux lois nationales et internationales relatives à la propriété intellectuelle, toute reproduction totale ou partielle de ce manuel sous quelque forme que ce soit, par quelque moyen que ce soit, voie électronique ou traduction, est interdite sans le consentement écrit préalable de la société Agilent Technologies, Inc. Référence du manuel G Edition 05/2013 Imprimé en Allemagne Agilent Technologies Hewlett-Packard-Strasse Waldbronn Ce produit peut être utilisé en tant que composant d'un dispositif de diagnostic in vitro, si ce dernier est enregistré auprès des autorités compétentes et est conforme aux directives correspondantes. Faute de quoi, il est exclusivement réservé à un usage général en laboratoire. Garantie Les informations contenues dans ce document sont fournies en l'état et pourront faire l'objet de modifications sans préavis dans les éditions ultérieures. Dans les limites de la législation en vigueur, Agilent exclut en outre toute garantie, expresse ou implicite, quant à ce manuel et aux informations contenues dans ce dernier, notamment, mais sans s'y restreindre, toute garantie marchande et aptitude à un but particulier. En aucun cas, Agilent ne peut être tenu responsable des éventuelles erreurs contenues dans ce document, ni des dommages directs ou indirects pouvant découler des informations contenues dans ce document, de la fourniture, de l'usage ou de la qualité de ce document. Si Agilent et l'utilisateur ont souscrit un contrat écrit distinct dont les conditions de garantie relatives au produit couvert par ce document entrent en conflit avec les présentes conditions, les conditions de garantie du contrat distinct se substituent aux conditions stipulées dans le présent document. Licences technologiques Le matériel et le logiciel décrits dans ce document sont protégés par un accord de licence et leur utilisation ou reproduction sont soumises aux termes et conditions de ladite licence. Mentions de sécurité ATTENTION Une mention ATTENTION signale un danger. Si la procédure, le procédé ou les consignes ne sont pas exécutés correctement, le produit risque d'être endommagé ou les données d'être perdues. En présence d'une mention ATTENTION, vous devez continuer votre opération uniquement si vous avez totalement assimilé et respecté les conditions mentionnées. AVERTISSEMENT Une mention AVERTISSEMENT signale un danger. Si la procédure, le procédé ou les consignes ne sont pas exécutés correctement, les personnes risquent de s'exposer à des lésions graves. En présence d'une mention AVERTISSEMENT, vous devez continuer votre opération uniquement si vous avez totalement assimilé et respecté les conditions mentionnées. Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

3 Contenu de ce manuel Contenu de ce manuel Ce manuel concerne : le détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321B SPECTRA), le détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321C), et le détecteur à fluorescence Agilent série 1200 (G1321A) (obsolète). 1 Présentation du détecteur à fluorescence Ce chapitre présente le détecteur et son principe de fonctionnement. 2 Exigences et spécifications relatives au site Ce chapitre fournit des informations concernant les exigences d'ordre environnemental, ainsi que les caractéristiques techniques et les performances. 3 Installation du module Ce chapitre fournit des informations concernant la configuration de la pile de modules conseillée pour votre système et l'installation de votre module. 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Ce chapitre vous explique comment utiliser le détecteur. 5 Optimisation du détecteur Ce chapitre fournit des informations concernant l'optimisation du détecteur. 6 Dépannage et diagnostic Ce chapitre donne un aperçu des fonctions de dépannage et de diagnostic et des différentes interfaces utilisateur. Manuel d utilisation du FLD Agilent

4 Contenu de ce manuel 7 Informations concernant les erreurs Le chapitre suivant explique la signification des messages d'erreur et fournit des informations sur les causes probables et les actions recommandées pour revenir à un état de fonctionnement normal. 8 Fonctions de test Ce chapitre décrit les fonctions de test intégrées du détecteur. 9 Maintenance Ce chapitre fournit les informations générales concernant la maintenance et la réparation du détecteur. 10 Pièces pour la maintenance Ce chapitre présente des informations sur les pièces utilisées pour la maintenance. 11 Identification des câbles Ce chapitre fournit des informations sur les câbles utilisés avec les modules Agilent Infinity série Informations sur le matériel Ce chapitre décrit le détecteur de manière plus détaillée d'un point de vue matériel et électronique. 13 Annexe Ce chapitre fournit des informations générales et des informations concernant la sécurité. 4 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

5 Sommaire Sommaire 1 Présentation du détecteur à fluorescence 9 Présentation du détecteur 10 Fonctionnement du détecteur 12 Effet Raman 15 Unité optique 16 Informations analytiques découlant des données primaires 24 Présentation du système 29 Matériaux Bio-Inert 32 2 Exigences et spécifications relatives au site 35 Exigences relatives au site 36 Caractéristiques physiques 39 Caractéristiques de performance 40 3 Installation du module 51 Déballage du module 52 Optimisation de la configuration de la pile de modules 54 Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets 59 Installation du module 63 Raccordements des liquides au module 66 4 Utilisation du détecteur à fluorescence 71 Gestion des fuites et déchets 72 Avant de commencer 73 Mise en service et vérification des performances du détecteur 74 Développement de méthodes 78 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 97 Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT 107 Informations sur les solvants 111 Manuel d utilisation du FLD Agilent

6 Sommaire 5 Optimisation du détecteur 115 Généralités sur l optimisation 116 Les caractéristiques de conception facilitent l optimisation. 119 Détermination des meilleures longueurs d onde 120 Détermination de la meilleure amplification du signal 122 Changement de la fréquence de la lampe-éclair au xénon 129 Sélection du meilleur temps de réponse 131 Réduction de la lumière parasite Dépannage et diagnostic 137 Présentation des voyants et des fonctions de test du module 138 Voyants d'état 139 Interfaces utilisateur 141 Logiciel Agilent Lab Advisor Informations concernant les erreurs 143 Qu'est-ce qu'un message d'erreur? 144 Messages d'erreur généraux 145 Messages d erreur du détecteur Fonctions de test 161 Introduction 162 Schéma du trajet de la lumière 163 Test d'intensité de lampe 164 Test de signal sur bruit Raman ASTM 166 Utilisation du chromatogramme de test intégré 170 Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration 172 Test de précision de la longueur d onde 175 Procédure de calibration en longueur d'onde Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

7 Sommaire 9 Maintenance 187 Introduction à la maintenance 188 Avertissements et mises en garde 189 Présentation de la maintenance 191 Nettoyage du module 192 Remplacement d'une cuve à circulation 193 Utilisation de la cuvette 197 Rinçage de la cuve à circulation 198 Élimination des fuites 199 Remplacement des pièces du système d'élimination des fuites 200 Remplacement de la carte d'interface 201 Remplacement du micrologiciel du module 202 Tests et calibrations Pièces pour la maintenance 205 Présentation des pièces utilisées pour la maintenance 206 Kit de cuvette 207 Kit d'accessoires Identification des câbles 211 Présentation générale des câbles 212 Câbles analogiques 214 Câbles de commande à distance 216 Câbles DCB 219 Câbles réseau CAN/LAN 221 Câble de contacts externes 222 Entre module Agilent et PC Informations sur le matériel 225 Description du micrologiciel 226 Cartes d interface optionnelles 229 Raccordements électriques 233 Interfaces 236 Réglage du commutateur de configuration 8 bits (sans LAN intégré) 243 Maintenance préventive 248 Structure de l instrument 249 Manuel d utilisation du FLD Agilent

8 Sommaire 13 Annexe 251 Informations de sécurité générales 252 Directive sur les déchets d'équipements électriques et électroniques (DEEE) (2002/96/CE) 255 Informations sur les piles au lithium 256 Perturbations radioélectriques 257 Émissions sonores 258 Radiation UV (lampe UV seulement) 259 Informations sur les solvants 260 Agilent Technologies sur Internet Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

9 Manuel d utilisation du FLD Agilent Présentation du détecteur à fluorescence Présentation du détecteur 10 Fonctionnement du détecteur 12 Effet Raman 15 Unité optique 16 Système de référence 23 Informations analytiques découlant des données primaires 24 Détection de fluorescence 24 Détection de phosphorescence 25 Traitement des données brutes 25 Présentation du système 29 Gestion des fuites et déchets 29 Matériaux Bio-Inert 32 Ce chapitre présente le détecteur et son principe de fonctionnement. Agilent Technologies 9

10 1 Présentation du détecteur à fluorescence Présentation du détecteur Présentation du détecteur Versions du détecteur Tableau 1 Versions du détecteur Version G1321C G1321B SPECTRA G1321A Description Commercialisé en juin 2013 comme FLD Infinity 1260 mono-canal sans fonctionnalités de spectre. Fréquence d'acquisition maximale de 74 Hz. Micrologiciel de l'instrument : A Commandé par Instant Pilot avec micrologiciel B.02.16, pilote A.02.08, Agilent OpenLAB CDS ChemStation Edition C.01.05, OpenLAB EZChromEdition EE A.04.05, ICF A et Lab Advisor B La version G1321C ne peut pas être convertie en G1321A/B. Commercialisé en juin 2010 comme FLD Infinity 1260 multi-canal avec fonctionnalités de spectre. Fréquence d'acquisition maximale de 74 Hz. La version G1321B peut être convertie en G1321A (mode émulation). Lors de la commercialisation du G1321C, la fréquence d'acquisition a été augmentée à 144,9 Hz au maximum ( micrologiciel de l'instrument A.06.54). Commercialisé en août 1998 comme FLD série 1100 multi-canal avec fonctionnalités de spectre. Fréquence d'acquisition maximale de 18 Hz. Devenu obsolète à la commercialisation du FLD G1321B. Le détecteur se caractérise par les plus hautes performances optiques, la conformité aux BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoire) et une maintenance facile. Il possède les caractéristiques suivantes : lampe-éclair pour une intensité maximale et des limites de détection très basses, mode multi-canaux pour les spectres en ligne (G1321B SPECTRA), acquisition de spectres et détection multi-canaux simultanées (G1321B SPECTRA), cuvette en option pour les mesures hors ligne, accès facile à la cuve à circulation par l'avant, pour remplacement rapide et fonction intégrée de vérification de la précision de la longueur d'onde. 10 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

11 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Présentation du détecteur Pour plus de détails sur les caractéristiques, voir «Caractéristiques de performance», page 40 Figure 1 Détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 Manuel d utilisation du FLD Agilent

12 1 Présentation du détecteur à fluorescence Fonctionnement du détecteur Fonctionnement du détecteur Détection de la luminescence La luminescence, ou émission de lumière, se produit lorsque des molécules retournent à leur état fondamental après avoir été excitées par un apport d'énergie. Les molécules peuvent être excitées par différentes formes d'énergie, le processus d'excitation étant spécifique pour chaque forme d'énergie. Par exemple, lorsque l'énergie est apportée sous forme de lumière, le processus d'excitation est appelé photoluminescence. Dans les cas simples, l'émission de lumière est le phénomène inverse de l'absorption (voir Figure 2, page 12). Pour le sodium gazeux, par exemple, les spectres d absorption et d émission correspondent à une simple ligne à la même longueur d onde. Les spectres d absorption et d émission de molécules organiques en solution sont des raies et non des lignes. Figure 2 Absorption de lumière en fonction de l émission de lumière Quand une molécule plus complexe passe de son état fondamental à un état excité, l énergie absorbée est distribuée dans divers sous-niveaux vibrationnels et rotatoires. Lorsque cette même molécule revient à son état fondamental, cette énergie vibrationnelle et rotatoire est d abord perdue par relaxation 12 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

13 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Fonctionnement du détecteur sans émission radiative. Ensuite, la molécule passe de son niveau d énergie à l un des sous-niveaux vibrationnels ou rotatoires de son état fondamental en émettant de la lumière (voir Figure 3, page 13). Le maximum d absorption caractéristique d une substance est λ EX et le maximum d émission est λ EM. Figure 3 Relation entre longueurs d'onde d'excitation et d'émission Le terme photoluminescence regroupe deux phénomènes, fluorescence et phosphorescence, qui diffèrent l un de l autre sur un point caractéristique : le décalage de l'émission après l'excitation. Si une molécule émet de la lumière 10-9 à 10-5 secondes après avoir été illuminée, le phénomène observé est la fluorescence. Si une molécule émet de la lumière plus de 10-3 secondes après illumination, le phénomène observé est la phosphorescence. La phosphorescence est un phénomène plus long car il y a changement de spin de l un des électrons impliqué dans le rayonnement d excitation, lors d une collision avec une molécule de solvant, par exemple. La molécule excitée se retrouve alors à l'état triplet T (voir Figure 4, page 14). Manuel d utilisation du FLD Agilent

14 1 Présentation du détecteur à fluorescence Fonctionnement du détecteur Figure 4 Transitions d énergie en phosphorescence Avant de pouvoir retourner à son état fondamental, la molécule doit rétablir le spin antérieur. Comme la probabilité de collision avec une autre molécule ayant le spin nécessaire est faible, la molécule reste dans l état triplet pendant un temps relativement long. Durant le deuxième changement de spin, la molécule perd plus d énergie par relaxation sans émission radiative. Par conséquent, la lumière émise par phosphorescence présente une énergie inférieure et une longueur d'onde supérieure à celle émise par fluorescence. Formule : E = h x λ -1 Où : E désigne l'énergie h représente la constante de Planck λ désigne la longueur d'onde 14 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

15 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Effet Raman Effet Raman L'effet Raman se produit lorsque la lumière incidente excite, dans l échantillon, des molécules qui diffusent ensuite la lumière. Si la majeure partie de cette lumière diffusée est à la même longueur d'onde que la lumière incidente, une partie est diffusée à une longueur d'onde différente. Cette diffusion inélastique de la lumière est appelée diffusion Raman. Elle découle de modifications du mouvement de la molécule. Figure 5 Raman La différence d énergie entre la lumière incidente (E i ) et la lumière diffusée par effet Raman (E s ) est égale à l'énergie nécessaire pour modifier l état vibrationnel de la molécule (c est-à-dire l énergie nécessaire pour que la molécule entre en vibration, E v ). La différence d énergie est appelée décalage Raman. E v = E i - E s On observe souvent plusieurs signaux à décalage Raman différents, chacun associé à différents mouvements de vibration ou de rotation des molécules contenues dans l'échantillon. La molécule et son environnement déterminent les signaux Raman observés (le cas échéant). Un tracé de l intensité Raman en fonction du décalage Raman est un spectre Raman. Manuel d utilisation du FLD Agilent

16 1 Présentation du détecteur à fluorescence Unité optique Unité optique Tous les éléments du système optique illustrés dans la Figure 6, page 17, y compris la lampe- éclair au xénon, le condenseur d'excitation, la fente d'excitation, le miroir, le réseau d'excitation, la cuve à circulation, le condenseur d'émission, le filtre passe-bande, la fente d'émission, le réseau d'émission et le tube photomultiplicateur se trouvent dans un boîtier métallique à l'intérieur du détecteur. Le détecteur à fluorescence dispose d'un système optique de type réseau/réseau permettant la sélection des longueurs d'onde d'excitation et d'émission. La cuve à circulation est accessible par l'avant du détecteur à fluorescence. 16 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

17 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Unité optique Figure 6 Unité optique La source de rayonnement est une lampe-éclair au xénon. L'éclair de 3 µs génère un spectre de lumière continu de 200 nm à 900 nm. La distribution de la lumière sortante peut être exprimée sous forme de pourcentages par intervalle de 100 nm (voir Figure 7, page 18). Selon la sensibilité requise, la lampe peut être utilisée pendant environ heures. En fonctionnement automatique, vous pouvez économiser la lampe en paramétrant, à partir du clavier, des points de consigne tels que la lampe ne produise des éclairs que pendant l analyse. Vous pouvez utiliser la lampe tant qu elle s allume, mais le niveau de bruit risque d'augmenter avec le temps. Manuel d utilisation du FLD Agilent

18 1 Présentation du détecteur à fluorescence Unité optique La dégradation des UV (en particulier en dessous de 250 nm) est considérablement plus élevée que la dégradation dans le domaine visible. En général, l utilisation de l'option "Lampe allumée pendant l'analyse" et du mode "économie" prolonge la vie de la lampe d un ordre de grandeur. Figure 7 Distribution de l'énergie lumineuse (données du fournisseur) Le rayonnement émis par la lampe est dispersé et réfléchi par le réseau du monochromateur d'excitation sur la fente d'entrée de la cuve. Le réseau holographique concave constitue le principal élément du monochromateur chargé de disperser et de réfléchir la lumière incidente. Sa surface est parcourue par de nombreux sillons microscopiques (1 200 sillons par millimètre). Le réseau est de type échelette pour améliorer les performances dans le domaine visible. 18 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

19 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Unité optique Figure 8 Ensemble miroir La géométrie des sillons est optimisée pour réfléchir la quasi-totalité de la lumière incidente dans le 1 er ordre et la disperser avec une efficacité d'environ 70 % dans le domaine ultraviolet. La plus grande partie des 30 % de lumière restants est réfléchie dans l'ordre zéro, sans dispersion. Figure 9, page 20 illustre le trajet optique à la surface du réseau. Manuel d utilisation du FLD Agilent

20 1 Présentation du détecteur à fluorescence Unité optique Figure 9 Dispersion de la lumière par un réseau Le réseau est entraîné en rotation par un moteur à courant continu sans balais à trois phases. La position du réseau détermine la longueur d'onde ou la gamme de longueurs d onde de la lumière qui frappe la cuve à circulation. On peut programmer le réseau pour qu'il change de position (ce qui provoque un changement de longueur d'onde) au cours d'une analyse. Pour l'acquisition de spectres et la détection multi-canal, le réseau tourne à la vitesse de tours par minute. Les réseaux d'excitation et d'émission sont de conception similaire, mais présentent des longueurs d'onde d'échelette différentes. Le réseau d'excitation reflète la majeure partie de la lumière dans le 1 er ordre dans le domaine ultraviolet aux alentours de 250 nm, tandis que le réseau d'émission réfléchit mieux dans le domaine visible autour de 400 nm. 20 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

21 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Unité optique La cuve à circulation possède un corps en silice fondue massif et peut être soumise à une contre-pression maximale de 20 bar. Une contre-pression excessive entraîne la destruction de la cuve. Il est recommandé de faire fonctionner le détecteur à proximité de l évacuation, la contre-pression y étant faible. Le corps comporte une fente. Figure 10 Coupe de la cuve à circulation La luminescence de l'échantillon présente dans la cuve à circulation est recueillie perpendiculairement à la lumière incidente par une deuxième lentille et traverse une deuxième fente. Avant que la luminescence n'atteigne le monochromateur d'émission, un filtre passe-bande élimine les longueurs d onde au-dessous d un certain seuil afin de réduire le bruit dû à la diffusion dans le 1 er ordre et la lumière parasite dans le 2 ème ordre (voir Figure 9, page 20). Manuel d utilisation du FLD Agilent

22 1 Présentation du détecteur à fluorescence Unité optique La longueur d'onde sélectionnée est réfléchie sur la fente d entrée du photomultiplicateur de l unité optique. La bande passante de la lumière émise est de 20 nm. Sur la photocathode (Figure 11, page 22), les photons incidents engendrent des électrons. Ces électrons sont accélérés par un champ électrique produit par plusieurs dynodes arquées. Selon la différence de tension entre les paires de dynodes, un électron incident peut provoquer l accélération d autres électrons. Il en découle un effet d'avalanche et en fin de compte le nombre d'électrons produits est tel que l on peut mesurer un courant. L'amplification est fonction de la tension des dynodes. Elle est contrôlée par microprocesseur et peut être réglée à l'aide de la fonction Gain PMT. Figure 11 Tube photomultiplicateur Ce type de photomultiplicateur latéral est compact, ce qui garantit une réponse rapide et préserve les avantages du trajet optique court illustré dans la Figure 6, page 17. Les tubes photomultiplicateurs sont conçus pour des plages de longueurs d'onde spécifiques. Un PMT standard offre une sensibilité optimale entre 200 et 600 nm. Pour les longueurs d onde supérieures, l utilisation d un PMT sensible au rouge peut améliorer les performances. 22 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

23 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Unité optique Système de référence Une diode de référence (située derrière la cuve à circulation) mesure la lumière d'excitation (EX) transmise par la cuve, puis corrige les fluctuations de la lampe et les décalages d intensité à long terme. La diode délivrant un signal non linéaire (en fonction de la longueur d'onde EX), les mesures sont normalisées. Un diffuseur est situé devant la diode de référence (voir Figure 6, page 17). Ce diffuseur en quartz réduit la lumière et permet d effectuer une mesure intégrale de la lumière. Manuel d utilisation du FLD Agilent

24 1 Présentation du détecteur à fluorescence Informations analytiques découlant des données primaires Informations analytiques découlant des données primaires Nous savons maintenant comment sont acquises, dans l unité optique, les données primaires concernant votre échantillon. Mais comment utiliser ces informations en chimie analytique? Selon la chimie de votre application, la luminescence mesurée par le détecteur à fluorescence a des caractéristiques différentes. Vous devez décider, sur la base de votre connaissance de l échantillon, quel mode de détection vous voulez utiliser. Détection de fluorescence Quand la lampe produit un éclair, les composés fluorescents de l'échantillon émettent presque simultanément un rayonnement (voir Figure 12, page 24). Le phénomène de luminescence étant très limité dans le temps, le détecteur à fluorescence n acquiert des données que sur une courte période de temps après l'éclair de la lampe. Figure 12 Mesure de fluorescence 24 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

25 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Informations analytiques découlant des données primaires Détection de phosphorescence Un jeu de paramètres approprié est utilisé dès que vous choisissez le mode détection de phosphorescence (points de consigne spéciaux dans Paramètres du FLD). Figure 13 Mesure de phosphorescence Traitement des données brutes Si la lampe produit des éclairs à une longueur d onde unique et à une puissance élevée, la fréquence d'acquisition de fluorescence est alors de 296 Hz. Cela signifie que votre échantillon est illuminé 296 fois par seconde et que toute luminescence produite par les composants élués hors de la colonne est mesurée 296 fois par seconde. En mode Économie ou Multi-canal, la fréquence des éclairs est de 74 Hz. Manuel d utilisation du FLD Agilent

26 1 Présentation du détecteur à fluorescence Informations analytiques découlant des données primaires Figure 14 LAMPE : Fréquence des éclairs, fluorescence et phosphorescence Vous pouvez améliorer le rapport signal/bruit en désactivant le mode Économie. REMARQUE Si le mode Économie est désactivé, la durée de vie de la lampe sera considérablement réduite. Prolongez la durée de vie de la lampe en l éteignant après l analyse. La résolution des données est de 20 bits pour un temps de réponse de 4 secondes (temps de réponse par défaut équivalent à une constante de temps de 1,8 seconde et approprié dans des conditions chromatographiques standard). Les signaux faibles peuvent entraîner des erreurs de quantification dues à une résolution insuffisante. Vérifiez le gain PMT que l on vous propose. S il est très différent de la valeur de votre paramètre, changez de méthode ou vérifiez la pureté de votre solvant. Voir aussi «Détermination de la meilleure amplification du signal», page 122. Vous pouvez utiliser le paramètre Gain PMT pour amplifier le signal. Un nombre d électrons proportionnel au gain PMT est produit pour chaque photon qui atteint le photomultiplicateur. Vous pouvez quantifier les pics petits et grands sur un même chromatogramme en modifiant le paramètre Gain au cours de l analyse dans un tableau de chronoprogrammation. 26 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

27 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Informations analytiques découlant des données primaires Figure 15 Gain PMT : Amplification du signal Vérifiez le gain PMT que l on vous propose. Si le gain proposé s écarte de plus de 2 du gain de la méthode, vous devez corriger la méthode. Chaque pas de réglage du gain PMT (de 0 à 18) correspond approximativement à un doublement du signal. Pour optimiser l amplification pour le pic avec l émission la plus importante, augmentez la valeur du paramètre Gain PMT jusqu à obtenir le meilleur rapport signal/bruit. Une fois les photons multipliés et convertis en un signal électronique, le signal (analogique) est suivi et maintenu au-delà du photomultiplicateur. Ensuite, le signal est converti par un convertisseur A/N pour donner un point de données brut (numérique). Onze de ces points de données sont regroupés au cours de la première étape du traitement des données. Le groupement des données améliore le rapport signal/bruit. Les données groupées, qui apparaissent sous forme de gros points noirs dans la Figure 16, page 28, sont ensuite filtrées à l aide d un filtre boxcar. Les données sont lissées, sans être réduites, en prenant la moyenne d un certain nombre de points. La moyenne des mêmes points moins le premier plus le suivant, et ainsi de suite, est calculée de sorte qu il y ait autant de points groupés et filtrés que de points groupés à l origine. Vous pouvez définir la longueur de l élément boxcar à l aide de la fonction Temps de Réponse : plus le temps de réponse est long et plus le nombre de points pour lequel la moyenne est calculée est grand. Une augmentation d un facteur quatre du paramètre Temps de réponse (par exemple, 1 s à 4 s) double le rapport signal/bruit. Manuel d utilisation du FLD Agilent

28 1 Présentation du détecteur à fluorescence Informations analytiques découlant des données primaires Figure 16 Temps de Réponse : Rapport signal/bruit 28 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

29 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Présentation du système Présentation du système Gestion des fuites et déchets Les instruments Infinity série 1200 ont été conçus pour permettre une évacuation sans danger des fuites et des déchets. Il importe que tous les principes de sécurité soient bien compris et les consignes respectées. Manuel d utilisation du FLD Agilent

30 1 Présentation du détecteur à fluorescence Présentation du système Figure 17 Principe d'évacuation des fuites et des déchets (vue d'ensemble, exemple d'une configuration en pile classique) 30 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

31 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Présentation du système Le compartiment à solvants (1) est conçu pour contenir un volume maximal de 6 L de solvant. Le volume maximal d'un flacon donné placé dans le compartiment à solvants ne doit pas dépasser 2,5 L. Pour de plus amples détails, consultez les recommandations d'utilisation pour les cabinets à solvants Agilent Infinity série 1200 (une copie imprimée de ces recommandations est expédiée avec le cabinet à solvants et des copies électroniques sont accessibles sur Internet). Le bac de récupération (2) (conçu sur mesure pour chaque module) dirige les solvants vers l'avant du module. Cela permet d'éviter tout écoulement de liquide sur les composants internes (p. ex. la cuve à circulation du détecteur). Le capteur de fuites du bac de récupération arrête le système dès que le niveau de détection de fuite est atteint. Le port de sortie du bac de récupération (3, A) dirige tout surplus de solvant d'un module à l'autre par l'intermédiaire de l'entonnoir de fuites du module suivant (3, B) jusqu'au tuyau d'évacuation souple (3, C). Le tuyau d'évacuation souple dirige le solvant vers le collecteur de fuites et le capteur de fuites du module d'en dessous. Le tuyau d'évacuation du port de lavage de l'aiguille de l'échantillonneur (4) dirige les solvants vers l'évacuation. La sortie du tuyau d'évacuation de condensation du refroidisseur de l'échantillonneur automatique (5) dirige les liquides condensés vers l'évacuation. Le tuyau d'évacuation de la vanne de purge (6) dirige les solvants vers l'évacuation. Le tuyau d'évacuation relié à la sortie du bac de récupération de chacun des instruments en bas de la pile (7) dirige le solvant vers un récipient à déchets approprié. Manuel d utilisation du FLD Agilent

32 1 Présentation du détecteur à fluorescence Matériaux Bio-Inert Matériaux Bio-Inert Pour le système CPL Agilent Infinity Bio-Inert 1260, Agilent Technologies utilise des matériaux de qualité optimale pour le circuit (également appelés pièces mouillées). Ces matériaux sont largement acceptés par les biologistes car réputés pour leur inertie optimale par rapport aux échantillons biologiques et garantissant la meilleure compatibilité avec les échantillons et les solvants courants sur une large plage de ph. En clair, le circuit tout entier est dépourvu d'acier inoxydable et d'autres alliages contenant des métaux tels que le fer, le nickel, le cobalt, le chrome, le molybdène ou le cuivre, susceptibles d'interférer avec les échantillons biologiques. Le circuit en aval de l'introduction des échantillons ne contient aucun métal quel qu'il soit. Tableau 2 Matériaux Bio-Inert utilisés dans les systèmes Agilent Infinity série 1260 Module Pompe quaternaire Agilent Infinity Bio-Inert série 1260 (G5611A) Échantillonneur automatique haute performance Agilent Infinity Bio-Inert série 1260 (G5667A) Injecteur manuel Agilent Infinity Bio-Inert série 1260 (G5628A) Collecteur de fraction analytique Agilent Infinity Bio-Inert série 1260 (G5664A) Matériaux Titane, or, platine iridié, céramique, rubis, PTFE, PEEK En amont de l'introduction des échantillons : Titane, or, PTFE, PEEK, céramique En aval de l'introduction des échantillons : PEEK, céramique PEEK, céramique PEEK, céramique, PTFE Cuves à circulation Bio-Inert : Cuve à circulation standard bio-inert, 10 mm, 13 µl, 120 bar ( 12 MPa) pour MWD/DAD, comprend cuves de circulation BIO du kit de capillaires (réf. G ) (G ) (pour détecteurs à barrette de diodes DAD Agilent Infinity série 1260 G1315C/D) PEEK, céramique, saphir, PTFE 32 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

33 Présentation du détecteur à fluorescence 1 Matériaux Bio-Inert Tableau 2 Matériaux Bio-Inert utilisés dans les systèmes Agilent Infinity série 1260 Module Cuve de type cartouche Max-Light Bio-inert ( 10 mm, V(s) 1.0 µl) (G ) et Cuve de type cartouche Max-Light Bio-inert ( 60 mm, V(s) 4.0 µl) (G ) (pour détecteurs à barrette de diodes DAD Agilent Infinity série 1200 G4212A/B) La cuve à circulation Bio-Inert, 8 µl, 20 bar (ph 1 12) comprend un kit de capillaires pour cuves à circulation BIO (réf. G ) (G ) (pour détecteur à fluorescence FLD Agilent Infinity 1260 G1321B) Échangeur de chaleur Bio-Inert G (pour compartiment de colonne thermostaté Agilent Infinity série 1290 G1316C) Têtes de vanne Bio-Inert Capillaires de connexion Bio-Inert Matériaux PEEK, silice fondue PEEK, silice fondue, PTFE PEEK (revêtement acier) G4235A, G5631A, G5639A : PEEK, céramique (à base de Al 2 O 3 ) En amont de l'introduction des échantillons : Titane En aval de l'introduction des échantillons : Agilent utilise des capillaires en PEEK recouverts d'acier inoxydable qui maintiennent le circuit à l'abri de l'acier et assurent la stabilité de la pression jusqu'à 600 bar au moins. REMARQUE Afin de garantir une biocompatibilité optimale de votre système CPL Agilent Infinity Bio-Inert 1260, n'intégrez pas de modules ou de pièces standard non inertes au circuit. N'utilisez aucune pièce non étiquetée Agilent "Bio-Inert". Pour la compatibilité des solvants avec ces matériaux, reportez-vous à «Informations sur les solvants pour les pièces du système CPL 1260 Infinity Bio-Inert», page 111. Manuel d utilisation du FLD Agilent

34 1 Présentation du détecteur à fluorescence Matériaux Bio-Inert 34 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

35 Manuel d utilisation du FLD Agilent Exigences et spécifications relatives au site Exigences relatives au site 36 Caractéristiques physiques 39 Caractéristiques de performance 40 Ce chapitre fournit des informations concernant les exigences d'ordre environnemental, ainsi que les caractéristiques techniques et les performances. Agilent Technologies 35

36 2 Exigences et spécifications relatives au site Exigences relatives au site Exigences relatives au site Un environnement adéquat est indispensable pour obtenir des performances optimales de l'instrument. Remarques sur l alimentation L alimentation du module a une plage de tolérance étendue. Elle accepte toute tension de secteur située dans la plage décrite dans le Tableau 3, page 39. Par conséquent, l arrière du module ne comporte pas de sélecteur de tension. Le module d'alimentation intégrant des fusibles électroniques automatiques, il n'y a pas non plus de fusibles externes accessibles. AVERTISSEMENT Il existe un danger d électrocution ou de dégât matériel sur votre instrument si l appareil est alimenté sous une tension de secteur supérieure à celle spécifiée. Raccordez votre instrument à la tension spécifiée uniquement. AVERTISSEMENT Le module est partiellement activé lorsqu'il est éteint, tant que le câble d'alimentation reste branché. Certaines réparations sur le module peuvent occasionner des blessures, par exemple une électrocution, si le capot est ouvert lorsque le module est sous tension. Débranchez toujours le câble d'alimentation avant d'ouvrir le capot. Ne rebranchez pas le câble d'alimentation avant que les capots ne soient remis en place. 36 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

37 Exigences et spécifications relatives au site 2 Exigences relatives au site ATTENTION Accessibilité de l'embase d'alimentation. En cas d'urgence, il doit être possible de débrancher à tout instant l'instrument du secteur. Veillez à faciliter l'accès à la prise d'alimentation de l'instrument et le débranchement de ce dernier. Laissez un espace suffisant au niveau de la prise d'alimentation de l'instrument pour débrancher le câble. Câbles d alimentation Différents câbles d alimentation sont proposés en option avec le module. L extrémité femelle est la même pour tous les câbles. Elle se branche dans l'embase d'alimentation à l'arrière du module. L extrémité mâle, destinée à être branchée à la prise de courant murale, varie selon le pays ou la région. AVERTISSEMENT Absence de mise à la terre ou utilisation d'un câble d'alimentation non recommandé L'absence de mise à la terre ou l'utilisation d'un câble d'alimentation non recommandé peut entraîner des chocs électriques ou des courts-circuits. N'utilisez jamais une prise de courant sans mise à la terre. N utilisez jamais de câble d alimentation autre que le modèle Agilent Technologies destiné à votre pays. AVERTISSEMENT Utilisation de câbles non fournis L'utilisation de câbles non fournis par Agilent Technologies risque d'endommager les composants électroniques ou d'entraîner des blessures. Pour un bon fonctionnement et le respect des normes de sécurité et CEM (compatibilité électromagnétique), utilisez exclusivement les câbles fournis par Agilent Technologies. Manuel d utilisation du FLD Agilent

38 2 Exigences et spécifications relatives au site Exigences relatives au site AVERTISSEMENT Utilisation non prévue pour les câbles d'alimentation fournis L'utilisation de câble d'alimentation à des fins non prévues peut entraîner des blessures corporelles ou endommager des équipements électroniques. Ne jamais utiliser le câble d'alimentation qu'agilent Technologies fournit avec cet instrument pour alimenter un autre équipement. Encombrement Les dimensions et le poids du module (voir Tableau 3, page 39) vous permettent de le placer sur pratiquement n'importe quelle paillasse de laboratoire. Il requiert un espace supplémentaire de 2,5 cm des deux côtés et d'environ 8 cmà l'arrière pour la circulation d'air et les raccordements électriques. Si la paillasse doit accueillir un système HPLC complet, assurez-vous qu'elle peut supporter le poids de tous les modules. Le module doit fonctionner en position horizontale. Condensation ATTENTION Condensation à l intérieur du module La condensation endommage les circuits électroniques du système. Ne pas entreposer, transporter ou utiliser votre module dans des conditions où les fluctuations de température peuvent provoquer de la condensation à l intérieur du module. Si le module a été transporté par temps froid, ne la sortez pas de son emballage et laissez-la atteindre progressivement la température ambiante pour éviter toute condensation. 38 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

39 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques physiques Caractéristiques physiques Tableau 3 Caractéristiques physiques Type Spécification Commentaires Poids Dimensions (hauteur largeur profondeur) 11,5 kg 140 x mm Tension secteur VAC, ± 10 % Plage de tensions étendue Fréquence secteur 50 ou 60 Hz, ± 5 % Puissance consommée 180 VA / 70 W / 239 BTU Maximum Température ambiante de fonctionnement Température ambiante hors fonctionnement 0-40 C ( F) C Humidité < 95 % à 40 C Sans condensation Altitude de fonctionnement Jusqu'à 2000 m Altitude hors fonctionnement Jusqu'à 4600 m Pour l'entreposage du module Normes de sécurité : CEI, CSA, UL Catégorie d'installation II, degré de pollution 2 Utilisation intérieure uniquement. Manuel d utilisation du FLD Agilent

40 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance Caractéristiques de performance Tableau 4 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321B) Type Caractéristique Commentaires Type de détection Caractéristiques de performance Source de lumière Fréquence des impulsions Détecteur à fluorescence multi-canal avec capacités rapides de balayage et d analyse des données spectrales en ligne Fonctionnement mono-canal : RAMAN (H 2 O) > 500 (bruit de référence mesuré au signal) Ex = 350 nm, Em = 397 nm, valeur d obscurité 450 nm, cuve à circulation standard RAMAN (H 2 O) > 3000 (bruit de référence mesuré à la valeur d'obscurité) Ex = 350 nm, Em = 397 nm, valeur d obscurité 450 nm, cuve à circulation standard Fonctionnement à deux canaux : RAMAN (H 2 O) > 300 Ex 350 nm, Em 397 nm et Ex 350 nm, Em 450 nm, cuve à circulation standard. Lampe-éclair au xénon, mode normal 20 W, mode économie 5 W, durée de vie 4000 h 296 Hz en mode mono-canal 74 Hz en mode économie voir la remarque sous ce tableau voir Manuel d'entretien Fréquence d'acquisition maximale 74 Hz, 145 Hz 145 Hz avec micrologiciel A ou supérieur 40 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

41 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques de performance Tableau 4 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321B) Type Caractéristique Commentaires Monochromateur d'excitation Monochromateur d'émission Système de référence Chronoprogrammation Acquisition de spectres Caractéristiques de longueur d onde Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 300 nm Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 400 nm mesure d excitation en ligne Jusqu à 4 longueurs d onde, temps de réponse, gain PMT, comportement de la ligne de base (modifié, libre, zéro), paramètres spectraux Spectres d excitation ou d émission Vitesse de balayage : 28 ms par point de données (p. ex. 0,6 s/spectre nm, 10 nm pas) Valeur du pas : 1 20 nm Spectres stockés : Tous Répétabilité +/- 0,2 nm Précision +/- 3 nm par réglage Manuel d utilisation du FLD Agilent

42 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance Tableau 4 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321B) Type Caractéristique Commentaires Cuves à circulation Contrôle et évaluation des données Standard : 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), bloc de silice fusionné En option : Cuvette à fluorescence pour mesures spectroscopiques hors ligne à l'aide de la seringue de 1 ml d'un volume de 8µL Bio-Inert 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), (ph de 1 à 12) Micro : 4 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa) Agilent ChemStation pour CPL, Agilent Instant Pilot G4208A avec capacités d analyse des données spectrales et d impression de spectre limitées Sorties analogiques Enregistreur/intégrateur : 100 mv ou 1 V, plage de sortie > 100 LU, deux sorties 100 LU est la plage recommandée, voir "Échelle et conditions de fonctionnement du FLD" Communications Sécurité et maintenance Bus CAN, RS-232C, LAN, APG Commande à distance : signaux prêt, démarrage, arrêt et mise hors tension Une assistance complète pour le dépannage et la maintenance est fournie par Instant Pilot, Agilent Lab Advisor et le système de données chromatographiques. Les fonctions de sécurité sont la détection des fuites, l'évacuation des fuites, le signal de détection des fuites pour arrêt du système de pompage et les basses tensions dans les zones de maintenance principales. 42 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

43 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques de performance Tableau 4 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321B) Type Caractéristique Commentaires Fonctionnalités BPL Boîtier Environnement Dimensions Poids Maintenance préventive (EMF) pour le suivi continu de l'utilisation de l'instrument en matière de durée d'utilisation des lampes avec des limites réglables par l'utilisateur et des messages d'information. Enregistrement électronique des opérations de maintenance et des erreurs. Vérification de la précision de longueur d onde à l aide de la bande Raman de l eau. Utilisation exclusive de matériaux recyclables C température constante à une humidité < 95 % (sans condensation) 140mmx345mmx435mm (5,5" x 13,5" x 17".) (hauteur x largeur x profondeur) 11,5 kg (25,5 lbs) Manuel d utilisation du FLD Agilent

44 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance Tableau 5 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321C) Type Caractéristique Commentaires Type de détection Caractéristiques de performance Source de lumière Fréquence des impulsions Fréquence d'acquisition maximale Monochromateur d'excitation Signal mono-canal (excitation et émission) Fonctionnement mono-canal : RAMAN (H 2 O) > 500 (bruit de référence mesuré au signal) Ex = 350 nm, Em = 397 nm, valeur d obscurité 450 nm, cuve à circulation standard RAMAN (H 2 O) > 3000 (bruit de référence mesuré à la valeur d'obscurité) Ex = 350 nm, Em = 397 nm, valeur d obscurité 450 nm, cuve à circulation standard Lampe-éclair au xénon, mode normal 20 W, mode économie 5 W, durée de vie 4000 h 296 Hz en mode mono-canal 74 Hz en mode économie 74 Hz Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 300 nm Détecteur à fluorescence mono-canal programmable (excitation et émission) voir la remarque sous ce tableau voir Manuel d'entretien 44 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

45 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques de performance Tableau 5 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321C) Type Caractéristique Commentaires Monochromateur d'émission Système de référence Chronoprogrammation Caractéristiques de longueur d onde Cuves à circulation Contrôle et évaluation des données Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 400 nm mesure d excitation en ligne Jusqu à 4 longueurs d onde, temps de réponse, gain PMT, comportement de la ligne de base (modifié, libre, zéro), paramètres spectraux Répétabilité +/- 0,2 nm Précision +/- 3 nm par réglage Standard : 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), bloc de silice fusionné En option : Cuvette à fluorescence pour mesures spectroscopiques hors ligne à l'aide de la seringue de 1 ml d'un volume de 8µL Bio-Inert 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), (ph de 1 à 12) Micro : 4 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa) Agilent ChemStation pour CPL, Agilent Instant Pilot G4208A avec capacités d analyse des données spectrales et d impression de spectre limitées Sorties analogiques Enregistreur/intégrateur : 100 mv ou 1 V, plage de sortie > 100 LU, deux sorties 100 LU est la plage recommandée, voir "Échelle et conditions de fonctionnement du FLD" Manuel d utilisation du FLD Agilent

46 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance Tableau 5 Caractéristiques de performance du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 (G1321C) Type Caractéristique Commentaires Communications Sécurité et maintenance Fonctionnalités BPL Boîtier Environnement Dimensions Poids Bus CAN, RS-232C, LAN, APG Commande à distance : signaux prêt, démarrage, arrêt et mise hors tension Une assistance complète pour le dépannage et la maintenance est fournie par Instant Pilot, Agilent Lab Advisor et le système de données chromatographiques. Les fonctions de sécurité sont la détection des fuites, l'évacuation des fuites, le signal de détection des fuites pour arrêt du système de pompage et les basses tensions dans les zones de maintenance principales. Maintenance préventive (EMF) pour le suivi continu de l'utilisation de l'instrument en matière de durée d'utilisation des lampes avec des limites réglables par l'utilisateur et des messages d'information. Enregistrement électronique des opérations de maintenance et des erreurs. Vérification de la précision de longueur d onde à l aide de la bande Raman de l eau. Utilisation exclusive de matériaux recyclables C température constante à une humidité < 95 % (sans condensation) 140mmx345mmx435mm (5,5" x 13,5" x 17".) (hauteur x largeur x profondeur) 11,5 kg (25,5 lbs) 46 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

47 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques de performance Tableau 6 Caractéristiques de performances du détecteur à fluorescence Agilent série 1200 (G1321A) Type Caractéristique Commentaires Type de détection Caractéristiques de performance Source de lumière Fréquence des impulsions Fréquence d'acquisition maximale Monochromateur d'excitation Monochromateur d'émission Système de référence Détecteur à fluorescence multi-canal avec capacités rapides de balayage et d analyse des données spectrales en ligne Fonctionnement mono-canal : RAMAN (H 2 O) > 500 (bruit de référence mesuré au signal) Ex = 350 nm, Em = 397 nm, valeur d obscurité 450 nm, cuve à circulation standard Fonctionnement à deux canaux : RAMAN (H 2 O) > 300 Ex 350 nm, Em 397 nm et Ex 350 nm, Em 450 nm, cuve à circulation standard. Lampe-éclair au xénon, mode normal 20 W, mode économie 5 W, durée de vie 4000 h 296 Hz en mode mono-canal 74 Hz en mode économie 37 Hz Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 300 nm Plage : réglable de 200 nm à 1200 nm et d'ordre zéro Bande passante : 20 nm (fixe) Monochromateur : réseau holographique concave, F/1,6, de type échelette : 400 nm mesure d excitation en ligne voir la remarque sous ce tableau voir Manuel d'entretien Manuel d utilisation du FLD Agilent

48 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance Tableau 6 Caractéristiques de performances du détecteur à fluorescence Agilent série 1200 (G1321A) Type Caractéristique Commentaires Chronoprogrammation Acquisition de spectres Caractéristiques de longueur d onde Cuves à circulation Contrôle et évaluation des données Jusqu à 4 longueurs d onde, temps de réponse, gain PMT, comportement de la ligne de base (modifié, libre, zéro), paramètres spectraux Spectres d excitation ou d émission Vitesse de balayage : 28 ms par point de données (p. ex. 0,6 s/spectre nm, 10 nm pas) Valeur du pas : 1 20 nm Spectres stockés : Tous Répétabilité +/- 0,2 nm Précision +/- 3 nm par réglage Standard : 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), bloc de silice fusionné En option : Cuvette à fluorescence pour mesures spectroscopiques hors ligne à l'aide de la seringue de 1 ml d'un volume de 8µL Bio-Inert 8 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa), (ph de 1 à 12) Micro : 4 µl volume et pression maximale de 20 bar (2 MPa) Agilent ChemStation pour CPL, Agilent Instant Pilot G4208A avec capacités d analyse des données spectrales et d impression de spectre limitées Sorties analogiques Enregistreur/intégrateur : 100 mv ou 1 V, plage de sortie > 100 LU, deux sorties 100 LU est la plage recommandée, voir "Échelle et conditions de fonctionnement du FLD" 48 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

49 Exigences et spécifications relatives au site 2 Caractéristiques de performance Tableau 6 Caractéristiques de performances du détecteur à fluorescence Agilent série 1200 (G1321A) Type Caractéristique Commentaires Communications Sécurité et maintenance Fonctionnalités BPL Boîtier Environnement Dimensions Poids Bus CAN, RS-232C, LAN, APG Commande à distance : signaux prêt, démarrage, arrêt et mise hors tension Diagnostics étendus, détection et affichage des erreurs (par Instant Pilot G4208A et ChemStation), détection des fuites, évacuation des fuites, signal de sortie des fuites pour l'arrêt du système de pompage. Basses tensions dans les zones de maintenance principales. Maintenance préventive (EMF) pour le suivi continu de l'utilisation de l'instrument en matière de durée d'utilisation des lampes avec des limites réglables par l'utilisateur et des messages d'information. Enregistrement électronique des opérations de maintenance et des erreurs. Vérification de la précision de longueur d onde à l aide de la bande Raman de l eau. Utilisation exclusive de matériaux recyclables C température constante à une humidité < 95 % (sans condensation) 140mmx345mmx435mm (5,5" x 13,5" x 17".) (hauteur x largeur x profondeur) 11,5 kg (25,5 lbs) Manuel d utilisation du FLD Agilent

50 2 Exigences et spécifications relatives au site Caractéristiques de performance 50 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

51 Manuel d utilisation du FLD Agilent Installation du module Déballage du module 52 Optimisation de la configuration de la pile de modules 54 Configuration en une seule pile 55 Configuration en deux piles 57 Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets 59 Installation du module 63 Raccordements des liquides au module 66 Ce chapitre fournit des informations concernant la configuration de la pile de modules conseillée pour votre système et l'installation de votre module. Agilent Technologies 51

52 3 Installation du module Déballage du module Déballage du module Emballage endommagé Si l emballage de livraison présente des signes de dommages externes, contactez immédiatement votre revendeur Agilent Technologies. Informez-en également votre ingénieur de maintenance Agilent. ATTENTION Problèmes «Défectueux à l arrivée» Ne pas installer le module s il présente des signes de dommages. Agilent doit effectuer une vérification afin de déterminer si l instrument est en bon état ou endommagé. Prévenez le revendeur et le service après-vente Agilent en cas de dommages. Un technicien de maintenance Agilent inspectera l instrument dans vos locaux et fera le nécessaire. 52 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

53 Installation du module 3 Déballage du module Liste de contrôle de livraison Assurez-vous que toutes les pièces et matériels ont été livrés avec le module. La liste de contrôle de livraison est reproduite ci-après. Pour connaître la désignation des pièces, consultez les tableaux et les illustrations à la section «Pièces pour la maintenance», page 205 Signalez toute pièce manquante ou détériorée à votre service commercial/après-vente Agilent Technologies. Tableau 7 Liste de contrôle Détecteur Description Quantité Détecteur 1 Câble d'alimentation 1 Câble CAN 1 Cuve à circulation Cuve à circulation/cuvette optionnelle Manuel d'utilisation Kit d accessoires (voir la section «Kit d accessoires standard», page 208) selon commande selon commande sur le CD Documentation (expédié avec la livraison ; commun à plusieurs modules) 1 Manuel d utilisation du FLD Agilent

54 3 Installation du module Optimisation de la configuration de la pile de modules Optimisation de la configuration de la pile de modules Si votre module fait partie d'un chromatographe en phase liquide complet Agilent 1260 Infinity, vous pourrez obtenir une performance optimale en installant les configurations suivantes. Ces configurations optimisent le circuit du système garantissant ainsi un volume de retard minimal. 54 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

55 Installation du module 3 Optimisation de la configuration de la pile de modules Configuration en une seule pile Une performance optimale est garantie en installant les modules du système Agilent 1260 Infinity LC dans la configuration suivante (voir Figure 18, page 55 et Figure 19, page 56). Cette configuration optimise le trajet de liquide, pour un volume mort minimum et une réduction de l'encombrement requis. Compartiment à solvants Dégazeur à vide Pompe Instant Pilot Échantillonneur automatique Compartiment à colonnes Détecteur Figure 18 Configuration de pile recommandée pour le système 1260 Infinity (vue avant) Manuel d utilisation du FLD Agilent

56 3 Installation du module Optimisation de la configuration de la pile de modules Figure 19 Configuration de pile recommandée pour le système 1260 Infinity (vue arrière) 56 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

57 Installation du module 3 Optimisation de la configuration de la pile de modules Configuration en deux piles Pour éviter une hauteur excessive de la pile lorsque le thermostat de l'échantillonneur automatique est ajouté au système, il est recommandé de former deux piles. Certains utilisateurs préfèrent la plus faible hauteur de cette disposition, même sans le thermostat de l'échantillonneur automatique. Un capillaire légèrement plus long est nécessaire entre la pompe et l'échantillonneur automatique. (Voir Figure 20, page 57 et Figure 21, page 58). Figure 20 Configuration deux piles recommandée pour le système 1260 Infinity (vue avant) Manuel d utilisation du FLD Agilent

58 3 Installation du module Optimisation de la configuration de la pile de modules Figure 21 Configuration deux piles recommandée pour le système 1260 Infinity (vue arrière) 58 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

59 Installation du module 3 Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets Les instruments Agilent Infinity série 1200 ont été conçus pour permettre une évacuation sans danger des fuites et des déchets. Il importe que tous les principes de sécurité soient bien compris et les consignes respectées. AVERTISSEMENT Solvants, échantillons et réactifs toxiques, inflammables et dangereux La manipulation de solvants, d'échantillons et de réactifs peuvent comporter des risques pour la santé et la sécurité. Lors de la manipulation de ces produits, respectez les règles de sécurité (lunettes, gants et vêtements de protection) telles qu elles figurent dans la fiche de sécurité fournie par le fournisseur, et respectez les bonnes pratiques de laboratoire. Le volume des substances doit être réduit au minimum requis pour l'analyse. Ne dépassez jamais le volume maximal de solvants autorisé (6 L) dans le cabinet à solvants. N'utilisez pas de flacons dépassant le volume maximal autorisé défini dans les recommandations d'utilisation des cabinet à solvants Agilent Infinity série Organisez les flacons comme indiqué dans les recommandations d'utilisation du cabinet à solvants. Une copie imprimée des recommandations est expédiée avec le cabinet à solvants et des copies électroniques sont accessibles via Internet. REMARQUE Recommandations concernant le cabinet à solvants Pour plus d'informations, consultez les recommandations d'utilisation des cabinets à solvants Agilent Infinity série Manuel d utilisation du FLD Agilent

60 3 Installation du module Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets Figure 22 Évacuation des fuites et des déchets (vue d'ensemble, exemple d'une configuration en pile classique) 60 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

61 Installation du module 3 Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets 1 Compartiment à solvants 2 Bac de récupération 3 Port de sortie du bac de récupération (A), entonnoir de fuites (B) et tuyau d'évacuation souple (C) 4 Tuyau d'évacuation du lavage de l'aiguille de l'échantillonneur 5 Sortie du tuyau d'évacuation de condensation du refroidisseur de l'échantillonneur automatique 6 Tuyau d évacuation de la vanne de purge 7 Tuyau d'évacuation 1 Empilez les modules selon la configuration de pile appropriée. La sortie du bac de récupération du module supérieur doit être positionnée verticalement au-dessus du collecteur de fuites du module inférieur (voir Figure 22, page 60). 2 Branchez les câbles de données et d'alimentation aux modules reportez-vous à la section Installation du module ci-dessous. 3 Connectez les capillaires et les tuyaux sur les modules, reportez-vous à la section Raccordement du circuit de liquides au module ci-dessous ou le manuel d'utilisation du système approprié. AVERTISSEMENT Solvants, échantillons et réactifs toxiques, inflammables et dangereux Évitez toute obstruction du circuit des solvants. Maintenez le circuit fermé (si la pompe du système est dotée d'une vanne d'entrée passive, la pression hydrostatique peut entraîner des fuites de solvant, même lorsque votre instrument est hors tension). Évitez de créer des boucles. Les tuyaux ne doivent pas pendre. Ne pliez pas les tuyaux. N'immergez pas l'extrémité du tuyau dans les déchets liquides. Ne raccordez pas les tuyaux en les enfonçant les uns dans les autres. Suivez les consignes sur l'étiquette du module pour installer le circuit correctement. Manuel d utilisation du FLD Agilent

62 3 Installation du module Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets Figure 23 Étiquette d'avertissement (avec illustration pour la bonne installation du tuyau d'évacuation) 62 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

63 Installation du module 3 Installation du module Installation du module Pièces nécessaires Description Câble d alimentation Pour les autres câbles, voir «Présentation générale des câbles», page 212. Logiciel nécessaire Préparations AVERTISSEMENT Système de données Agilent et/ou Instant Pilot G4208A Déterminez l emplacement sur la paillasse Prévoyez les branchements d alimentation Déballez le détecteur Le module est partiellement activé lorsqu il est éteint, tant que le cordon d alimentation reste branché. Certaines réparations sur le module peuvent occasionner des blessures, par exemple une électrocution, si le capot est ouvert et le module branché. Assurez-vous que la prise d alimentation électrique est toujours accessible. Débranchez le câble d alimentation de l instrument avant d ouvrir le capot de l instrument. Ne rebranchez pas le câble tant que les capots n ont pas été remis en place. 1 Installez la carte d'interface LAN dans le détecteur (si nécessaire), voir «Remplacement de la carte d'interface», page Placez le détecteur en position horizontale dans la pile de modules ou sur la paillasse. Manuel d utilisation du FLD Agilent

64 3 Installation du module Installation du module 3 Assurez-vous que l'interrupteur d'alimentation à l'avant de l'appareil est en position Arrêt. Figure 24 Vue avant du détecteur 4 Raccordez le câble d alimentation à l embase d alimentation située à l arrière du détecteur. 5 Branchez le câble du bus CAN aux autres modules. 6 Si une ChemStation Agilent est utilisée pour piloter les instruments, branchez le câble réseau à la carte d interface LAN du détecteur. REMARQUE Le détecteur (DAD/MWD/FLD/VWD/RID) est le point d'accès préféré lorsque les instruments sont pilotés via le LAN (en raison du chargement de données plus élevé). 7 Connectez le ou les câbles analogiques (en option). 8 Branchez le câble de commande à distance CAG (facultatif) pour des instruments autres qu'agilent. 64 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

65 Installation du module 3 Installation du module 9 Mettez sous tension en appuyant sur le bouton situé dans l'angle inférieur gauche du détecteur. Le voyant d'état doit être vert. Figure 25 Vue arrière du détecteur REMARQUE Quand le détecteur est sous tension, l'interrupteur est enfoncé et son voyant vert allumé. Quand l'interrupteur n'est pas enfoncé et que le voyant vert est éteint, le détecteur est hors tension. REMARQUE Le détecteur est livré avec des paramètres de configuration par défaut. REMARQUE L'interface GPIB a été retirée avec l'introduction des modules Infinity Manuel d utilisation du FLD Agilent

66 3 Installation du module Raccordements des liquides au module Raccordements des liquides au module Pour les modules Bio-Inert, utilisez exclusivement des pièces Bio-Inert! Outils nécessaires Description Clé, 1/4 5/16 inch (pour raccordements des capillaires) Pièces nécessaires Référence Description G Kit d'accessoires Préparations AVERTISSEMENT Le détecteur est installé dans le système CPL. Solvants, échantillons et réactifs toxiques, inflammables et dangereux La manipulation de solvants, d'échantillons et de réactifs peuvent comporter des risques pour la santé et la sécurité. Lors de la manipulation de ces produits, respectez les règles de sécurité (lunettes, gants et vêtements de protection) telles qu elles figurent dans la fiche de sécurité fournie par le fournisseur, et respectez les bonnes pratiques de laboratoire. Le volume des substances doit être réduit au minimum requis pour l'analyse. L'instrument ne doit pas fonctionner dans une atmosphère explosive. REMARQUE La cuve à circulation est livrée remplie d'isopropanol (remplissez-la de même avant tout déplacement de l'instrument et/ou de la cuve). Le but est d'éviter qu'elle ne soit endommagée sous l'effet de conditions inhabituelles (températures, pressions trop basses). 66 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

67 Installation du module 3 Raccordements des liquides au module 1 Appuyez sur les boutons de libération et retirez le capot avant pour accéder à la zone de la cuve à circulation. 2 Identifiez la cuve à circulation. Manuel d utilisation du FLD Agilent

68 3 Installation du module Raccordements des liquides au module 3 Assemblez le capillaire colonne-détecteur du kit d'accessoires. Un côté est déjà assemblé en usine. 4 Assemblez le tuyau d'évacuation fourni dans le kit d'accessoires. REMARQUE Le détecteur à fluorescence doit être en dernière position dans le système. Tout détecteur supplémentaire doit être installé avant le détecteur à fluorescence pour éviter toute surpression au niveau de la cuve (maximum de 20 bar). Si vous utilisez (à vos risques et périls) un détecteur situé après le détecteur à fluorescence, déterminez la contre-pression due à ce détecteur - en retirant la colonne et le dernier détecteur, puis en mesurant la pression du système au débit de l application, - en connectant le dernier détecteur (sans colonne ni détecteur) et en mesurant la pression du système au débit de l application, - la différence entre les pressions mesurées est égale à la contre-pression due au dernier détecteur ; c est la pression à laquelle est soumise le détecteur. 68 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

69 Installation du module 3 Raccordements des liquides au module 5 Insérez la cuve à circulation et installez les capillaires sur leur support (entrée en haut, sortie en bas). 6 Connectez le tuyau d évacuation au raccord d évacuation inférieur. 7 Établissez un débit et vérifiez qu il n y a pas de fuites. 8 Remettez le capot avant en place. L'installation du détecteur est terminée. REMARQUE Le détecteur doit être utilisé avec le capot avant en place pour protéger la zone de la cuve à circulation des courants d air violents provenant de l extérieur. Manuel d utilisation du FLD Agilent

70 3 Installation du module Raccordements des liquides au module 70 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

71 Manuel d utilisation du FLD Agilent Utilisation du détecteur à fluorescence Gestion des fuites et déchets 72 Avant de commencer 73 Mise en service et vérification des performances du détecteur 74 Mise en route du détecteur 74 Définition des conditions chromatographiques 75 Détermination des maxima à l aide du tracé d isoabsorbance 77 Développement de méthodes 78 Opération 1 : Recherche d'impuretés dans le système CPL 79 Opération 2 : Optimisation des limites de détection et de la sélectivité 81 Opération 3 : Paramétrage des méthodes de routine 92 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 97 Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPEC- TRES APEX UNIQUEMENT 107 Informations sur les solvants 111 Ce chapitre vous explique comment utiliser le détecteur. Agilent Technologies 71

72 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Gestion des fuites et déchets Gestion des fuites et déchets AVERTISSEMENT Solvants, échantillons et réactifs toxiques, inflammables et dangereux La manipulation de solvants, d'échantillons et de réactifs peuvent comporter des risques pour la santé et la sécurité. Lors de la manipulation de ces produits, respectez les règles de sécurité (lunettes, gants et vêtements de protection) telles qu elles figurent dans la fiche de sécurité fournie par le fournisseur, et respectez les bonnes pratiques de laboratoire. Le volume des substances doit être réduit au minimum requis pour l'analyse. L'instrument ne doit pas fonctionner dans une atmosphère explosive. Ne dépassez jamais le volume maximal de solvants autorisé (6 L) dans le cabinet à solvants. N'utilisez pas de flacons dépassant le volume maximal autorisé défini dans les recommandations d'utilisation des cabinet à solvants Agilent Infinity série Organisez les flacons comme indiqué dans les recommandations d'utilisation du cabinet à solvants. Une copie imprimée des recommandations est expédiée avec le cabinet à solvants et des copies électroniques sont accessibles via Internet. Le volume disponible restant dans le récipient à déchets approprié doit être suffisant pour recueillir les déchets liquides. Vérifiez le niveau de remplissage du récipient à déchets de manière régulière. Pour une sécurité maximale, contrôlez régulièrement la bonne installation de l'ensemble. REMARQUE Recommandations concernant le cabinet à solvants Pour plus d'informations, consultez les recommandations d'utilisation des cabinets à solvants Agilent Infinity série Pour plus d informations concernant l'installation, voir «Informations sur l'évacuation des fuites et des déchets», page Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

73 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Avant de commencer Avant de commencer Dans la majorité des cas, les solvants de qualité CPL donnent de bons résultats. Cependant, l expérience a montré que le bruit de la ligne de base peut être élevé (rapport signal/bruit faible) lorsque les solvants contiennent des impuretés. Rincez votre système de distribution de solvant pendant au moins 15 minutes avant de vérifier la sensibilité. Si votre pompe comporte plusieurs voies, rincez également les voies non utilisées. Pour optimiser vos résultats, consultez la section «Optimisation du détecteur», page 115. REMARQUE Certaines fonctionnalités (p. ex. l'acquisition de spectres, la détection multi-canal) décrites dans ce chapitre ne sont pas disponibles sur le FLD G1321C. Manuel d utilisation du FLD Agilent

74 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Mise en service et vérification des performances du détecteur Mise en service et vérification des performances du détecteur Ce chapitre explique comment vérifier les performances du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 à l aide de l échantillon de vérification isocratique Agilent. Mise en route du détecteur Quand Si vous voulez vérifier les performances du détecteur Pièces nécessaires Quantité Référence Description Kit de démarrage, comprenant 1 Colonne CPL et les pièces énumérées ci-dessous Échantillon de vérification isocratique Agilent Cette 0,5 ml ampoule contient 0,15 wt.% phtalate de diméthyle, 0,15 wt.% phtalate de diéthyle, 0,01 wt.% biphényle, 0,03 wt.% o-terphényle dans du méthanol Raccords Capillaire ST 0,17 mm x 150 mm Matériel nécessaire Système CPL avec FLD 1 Mettez le détecteur en marche. 2 Allumez la lampe. Lorsque la lampe est mise sous tension pour la première fois, l instrument effectue des vérifications internes et une vérification de l étalonnage qui prennent environ 5 minutes. 3 Vous êtes maintenant prêt à modifier les paramètres de votre détecteur. 74 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

75 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Mise en service et vérification des performances du détecteur Définition des conditions chromatographiques 1 Configurez les conditions chromatographiques suivantes et attendez que la ligne de base se stabilise. Tableau 8 Conditions chromatographiques Phases mobiles A = eau = 35 % B = Acétonitrile = 65 % Colonne Colonne OSD-Hypersil, 125 mm x 4 mm d.i. avec particules de 5 µm Echantillon Étalon isocratique, dilué dans du méthanol (1:10) Débit 1,5 ml/min Compressibilité A (eau) 46 Compressibilité B (Acétonitrile) 115 Courses A et B Temps avant arrêt auto 4 min Volume d injection 5 µl Température du four (1200) 30 C Longueurs d onde d excitation/émission du FLD EX = 246 nm, EM = 317 nm Gain PMT du FLD PMT = 10 Temps de réponse du FLD 4 secondes 2 Définir les points de consigne du FLD selon la Figure 26, page 76. Manuel d utilisation du FLD Agilent

76 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Mise en service et vérification des performances du détecteur Dans cet exemple des longueurs d'onde d'excitation supplémentaires (B, C, D) sont utilisées. Cela augmente la durée de balayage et peut baisser les performances. Figure 26 Paramètres FLD 3 Lancez l'analyse. Les chromatogrammes obtenus sont présentés ci-après : Figure 27 Pic du biphényle avec différentes longueurs d'onde d'excitation La longueur d onde d excitation maximum est d environ 250 nm. 76 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

77 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Mise en service et vérification des performances du détecteur Détermination des maxima à l aide du tracé d isoabsorbance 1 Chargez le fichier de données (λ EX = 246 nm, λ EM = 317 nm) et ouvrez le tracé d'isoabsorbance. 2 La λ EX maximum se trouve à environ 250 nm. Figure 28 Tracé d'isoabsorbance Manuel d utilisation du FLD Agilent

78 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Développement de méthodes Les détecteurs à fluorescence sont utilisés en chromatographie en phase liquide lorsque des limites de détection et une sélectivité excellentes sont nécessaires. Le développement complet de méthodes, notamment de méthodes d acquisition de spectres, est fondamental pour obtenir de bons résultats. Ce chapitre décrit trois opérations distinctes pouvant être réalisées avec le détecteur à fluorescence Agilent. Tableau 9, page 78 présente une vue d'ensemble des avantages des différentes modes de fonctionnement pendant ces opérations. Tableau 9 Etapes impliquées dans le développement complet de méthodes Etape 1 : Vérification du système Etape 2 : Optimisation des limites de détection et de la sélectivité Etape 3 : Paramétrage des méthodes de routine Balayage fluorimétrique Recherche des impuretés (par exemple, dans les solvants et les réactifs) Détermination simultanée des spectres d excitation et d émission d un composé pur Mode signal Mode spectral/détection à longueur d onde multiple Commutation de longueur d onde Détermination des spectres Ex/Em de tous les composés séparés en une analyse unique Utilisation simultanée de jusqu à quatre longueurs d onde Pour obtenir les limites de détection les plus basses Collecte des spectres en ligne, recherche en bibliothèque et détermination de la pureté des pics Désactivation de la commutation de longueur d onde 78 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

79 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Opération 1 : Recherche d'impuretés dans le système CPL Pour la détection de fluorescence à l'état de traces, il est indispensable que le système CPL soit dépourvu de contamination fluorescente. La plupart des contaminants proviennent de solvants impurs. Un balayage fluorimétrique permet de vérifier la qualité d un solvant en quelques minutes. Pour ce faire, vous pouvez, par exemple, remplir directement la cuvette du FLD avec le solvant pour effectuer une mesure hors ligne, même avant une analyse chromatographique. Le résultat peut être affiché sous forme d un tracé d isofluorescence tridimensionnel. Les différentes couleurs traduisent les différentes intensités. Figure 29, page 79 montre un échantillon d eau légèrement impure destiné à être utilisé comme phase mobile. La zone où apparaît la fluorescence de l échantillon d eau contaminé se situe entre les raies de lumière parasite : la lumière parasite de Raleigh dans le 1er et 2ème ordre et la lumière parasite de Raman. Un échantillon d'eau pure a été introduit dans la cuve à circulation. Les spectres ont été acquis par pas de 5nm. Figure 29 Tracé d isofluorescence d une phase mobile Les longueurs d onde d "excitation" et d "émission" étant les mêmes pour la lumière parasite Raleigh, la raie de lumière parasite Raleigh dans le premier ordre apparaît en haut à gauche du graphique. Les raies Raman de l eau se trouvent au-dessous de la lumière parasite Raleigh dans le premier ordre. Comme le filtre passe-bande élimine les longueurs d onde inférieures à 280 nm, la lumière parasite Raleigh dans le second ordre apparaît au-dessus de 560 nm. Manuel d utilisation du FLD Agilent

80 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes La lumière parasite a le même effet que les impuretés, à savoir qu elle simule un bruit de fond. Dans les deux cas, le niveau de bruit est plus élevé, les limites de détection sont de ce fait plus élevées. Cela signifie que des mesures très sensibles sont à effectuer à des longueurs d onde éloignées des points de consigne qui présentent un fond de lumière parasité élevé. 80 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

81 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Opération 2 : Optimisation des limites de détection et de la sélectivité Pour obtenir les limites de détection et la sélectivité optimales, les analystes doivent déterminer les propriétés fluorescentes des composés d intérêt. Pour obtenir des limites de détection et une sélectivité optimales, les longueurs d onde d excitation et d émission peuvent être sélectionnées. En général, les spectres de fluorescence obtenus avec des instruments différents présentent des différences considérables liées au matériel et aux logiciels utilisés. L approche classique consiste à extraire une longueur d onde d excitation appropriée à partir du spectre UV, qui est similaire au spectre d excitation de fluorescence (voir Figure 30, page 81), puis à enregistrer le spectre d émission. Ensuite, lorsque la longueur d'onde d émission optimale est déterminée, le spectre d excitation est acquis. Spectre d'excitation avec une émission à 440 nm, spectre d'émission avec une excitation à 250 nm pour la quinidine à 1µg/ml. Paramètres de détection : Pas de 5 nm, PMT de 12, temps de réponse de 4 s. Figure 30 Spectres d excitation et d émission de la quinidine Vous devez répéter cette opération pour chaque composé à l aide d un spectrophotomètre à fluorescence ou sur un système CPL sans circulation. Chaque composé doit normalement être analysé séparément. Ainsi, un ensemble de spectres d excitation et d émission est obtenu (Figure 29, page 79) pour cha- Manuel d utilisation du FLD Agilent

82 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes que composé. Cette procédure étant fastidieuse, elle n est appliquée que lorsque le nombre de composés d intérêt est limité. Le système CPL Agilent Infinity série 1200 offre trois moyens différents d obtenir des informations complètes sur la fluorescence d un composé : Procédure I - Effectuer un balayage fluorimétrique hors ligne pour un composé unique comme indiqué ci-dessus pour la phase mobile. Pour cela, on utilise de préférence une cuvette à FLD manuelle lorsque des composés purs sont disponibles. Procédure II - Effectuer deux analyses par CPL avec le détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 pour séparer le mélange de composés dans des conditions connues et acquérir séparément les spectres d émission et d excitation. Procédure III - Utiliser un couplage FLD /DAD Agilent Infinity série 1200 et acquérir les spectres UV-Visible (équivalents aux spectres d excitation) avec le DAD et des spectres d émission avec le FLD, le tout en une seule analyse. Procédure I - Balayage fluorimétrique Par le passé, l'acquisition des spectres de fluorescence avec les précédentes générations de détecteurs à fluorescence pour CPL était relativement complexe. Les spectrophotomètres à fluorescence standard servaient donc à acquérir des informations spectrales sur des composés inconnus. Malheureusement, cette approche limite les possibilités d optimisation du fait des différences de conception optique qui existent entre un détecteur pour CPL et un spectrophotomètre à fluorescence dédié, ou même entre deux détecteurs. Ces différences peuvent causer des variations des longueurs d onde d excitation et d émission optimales obtenues. Le détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 permet d effectuer un balayage fluorimétrique qui fournit toutes les informations spectrales jusque là obtenues à l aide d un spectrophotomètre à fluorescence standard indépendant du détecteur à fluorescence pour CPL. Figure 31, page 84 présente l ensemble des informations concernant la quinidine obtenues à l aide du détecteur à fluorescence Agilent Infinity 1260 et d une cuvette manuelle en une seule mesure hors ligne. Les longueurs d onde d excitation et d émission optimales correspondent aux coordonnées des maxima du tracé tridimensionnel. L un des trois maxima au centre du tracé peut être utilisé pour définir la longueur d onde d excitation. Le choix dépend des composés supplémentaires à analyser par chromatographie et du bruit de fond, qui peut varier en fonc- 82 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

83 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes tion de la longueur d'onde d excitation (250 nm, 315 nm ou 350 nm). L émission maximale observée est à 440 nm. Détails concernant la Figure 31, page 84 : Ce graphique fait apparaître tous les spectres d excitation et d émission de la quinidine (1 µg/ml). L intensité fluorescente est tracée en fonction des longueurs d onde d excitation et d émission. Paramètres du détecteur : pas de 5 nm, PMT de 12, temps de réponse de 4 s Manuel d utilisation du FLD Agilent

84 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Figure 31 Caractérisation d un composé pur à l aide d un balayage fluorimétrique 84 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

85 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Procédure II - Deux analyses par CPL avec le FLD Les conditions de séparation de composés organiques tels que les hydrocarbures aromatiques polynucléaires (HAP) sont bien décrites dans diverses méthodes standard, notamment dans les méthodes EPA et DIN couramment utilisées. Pour obtenir les meilleures limites de détection, vous devez déterminer les longueurs d onde d excitation et d émission optimales pour tous les composés. Cependant, il est fastidieux d effectuer des balayages fluorimétriques individuels. Il est préférable d'acquérir les spectres en ligne pour tous les composés au cours d une analyse. Cette approche accélère considérablement le développement de méthodes. Deux analyses suffisent pour l optimisation. Au cours de la première analyse, on sélectionne une longueur d onde d excitation dans la région basse de l UV et une longueur d onde d émission dans le domaine spectral des longueurs d onde d émission. La plupart des fluorophores absorbent fortement à ces longueurs d onde et le rendement quantique est élevé. L excitation est suffisante pour acquérir des spectres d émission. Tableau, page 87 montre tous les spectres d émission obtenus en une analyse unique d un mélange de 15 aromatiques polynucléaires. Cet ensemble de spectres sert à établir un tableau de chronoprogrammation des longueurs d onde d émission optimales pour tous les composés. Le tracé d isoabsorbance des spectres des composés individuels montre que trois longueurs d onde d émission au moins sont nécessaires pour détecter correctement les 15 aromatiques polynucléaires : Tableau 10 Tableau de chronoprogrammation pour l analyse des aromatiques polynucléaires 0 min : 350 nm du naphtalène au phénanthrène 8,2 min : 420 nm de l anthracène au benzo(g,h,i)pérylène 19,0 min : 500 nm pour l indéno(1,2,3-cd)pyrène Lors de la deuxième analyse, trois points de consigne pour les longueurs d'onde d'émission sont entrés dans le tableau de chronoprogrammation et les spectres d'excitation sont enregistrés, comme illustré dans la Figure 33, page 88. La zone d'intensité élevée (rouge) est due à de la lumière parasite lors du chevauchement des spectres d'émission et de la longueur d'onde d'excitation. Ce problème peut être évité en ajustant automatiquement le domaine spectral. Une longueur d onde d excitation de 260 nm convient particulièrement bien à tous les aromatiques polynucléaires. Manuel d utilisation du FLD Agilent

86 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Tableau 11 Conditions d'optimisation de l'analyse des aromatiques polynucléaires pour les figures ci-après Colonne Vydac, 2,1 x 200 mm, aromatique polynucléaire, 5 µm Phase mobile A = eau ; B = acétonitrile (50 : 50) Gradient 3 minutes, 60% 14 minutes, 90% 22 minutes, 100% Débit 0,4 ml/min Température de la colonne 18 C Volume d injection 5 µl Paramètres FLD PMT 12, temps de réponse 4 s. pas de 5 nm 86 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

87 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Tracé d'isoabsorbance des spectres d'émission pour 15 aromatiques polynucléaires (5 µg/ml) avec une longueur d'onde d'excitation fixe (260 nm). Figure 32 Optimisation de la chronoprogrammation pour la longueur d onde d émission Manuel d utilisation du FLD Agilent

88 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Figure 33 Optimisation de la chronoprogrammation pour la longueur d onde d excitation Les données obtenues sont combinées pour établir le tableau de chronoprogrammation des longueurs d onde d excitation offrant les meilleures limites de détection et la meilleure sélectivité. Les événements de commutation optimisés pour cet exemple sont résumés dans le Tableau 12, page 88. Tableau 12 Tableau de chronoprogrammation pour l analyse de 15 aromatiques polynucléaires Temps [min] Longueur d'onde d excitation [nm] Longueur d'onde d émission [nm] Ce tableau de chronoprogrammation donne les conditions de détection optimales basées sur les résultats des deux analyses chromatographiques. 88 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

89 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Procédure III - une seule analyse avec un couplage DAD/FLD Les spectres UV obtenus à l aide de détecteurs à barrette de diodes sont presque identiques aux spectres d excitation de fluorescence de la plupart des composés organiques. Des différences spectrales découlent des caractéristiques spécifiques des détecteurs, comme la résolution spectrale ou la nature des sources lumineuses. En pratique, la combinaison d un détecteur à barrette de diodes et d un détecteur à fluorescence en série permet d obtenir l ensemble des données nécessaires pour déterminer les longueurs d onde d excitation et d émission optimales pour une série de composés en une seule analyse. Le détecteur à barrette de diodes est configuré pour acquérir des spectres UV-Visible/d excitation, et le détecteur à fluorescence, des spectres d émission à une longueur d onde d excitation fixe dans la région basse de l UV. Cet exemple est tiré d une application de contrôle de la qualité des carbamates. Des échantillons sont analysés pour rechercher les impuretés comme la diamino-2,3 phénazine (DAP) et l amino2- hydroxy-3 phénazine (AHP). Des échantillons de référence de DAP et de AHP sont analysés avec un détecteur à barrette de diodes et un détecteur à fluorescence. Tableau, page 90 montre les spectres obtenus avec les deux détecteurs pour le DAP. Le spectre d excitation du DAP est très similaire au spectre d absorption UV obtenu à l aide du détecteur à barrette de diodes. Tableau, page 91 montre le résultat de l application de cette méthode à un échantillon de carbamate et à un mélange pur de DAP et de AHP servant de référence. La colonne a été surchargée avec les carbamates non fluorescents (méthyle benzimidazole-2 carbamate) pour rechercher les impuretés connues, AHP et DAP. Manuel d utilisation du FLD Agilent

90 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Il s'agit d'une impureté des carbamates. Le spectre d'excitation d'une deuxième analyse montre l'équivalence des spectres UV et des spectres d'excitation de fluorescence. Une longueur d'onde d'excitation de 265 nm a été utilisée pour acquérir le spectre d'émission et une longueur d'onde d'émission de 540 nm a été utilisée pour acquérir le spectre d'excitation. Figure 34 Spectres UV et spectres de fluorescence de la diamino-2,3 phénazine (DAP) 90 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

91 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Les deux tracés supérieurs sont obtenus en utilisant deux longueurs d'onde d'excitation différentes. Le tracé inférieur est le standard pur des impuretés connues. Figure 35 Analyses quantitatives du MBC (méthyle benzimidazole-2 carbamate) et de ses impuretés Tableau 13 Colonne Conditions d'analyse des DAP et MBC pour les figures ci-après Zorbax SB, 2 x 50 mm, aromatique polynucléaire, 5 µm Phase mobile A = eau ; B = acétonitrile Gradient 0 minutes, 5% 10 minutes, 15% Débit 0,4 ml/min Température de la colonne 35 C Volume d injection 5 µl Paramètres FLD PMT 12, temps de réponse 4 s. pas de 5 nm Ex 265 nm et 430 nm Em 540 nm Manuel d utilisation du FLD Agilent

92 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Opération 3 : Paramétrage des méthodes de routine Dans les analyses de routine, la matrice des échantillons peut avoir une influence considérable sur les temps de rétention. Pour obtenir des résultats fiables, la préparation de l échantillon doit être rigoureuse afin d éviter les interférences ou la méthode CPL utilisée doit être suffisamment robuste. Avec les matrices complexes, la détection multi-canal simultanée est plus fiable que la commutation de longueur d onde chronoprogrammée. En outre, le FLD peut acquérir des spectres de fluorescence tout en enregistrant les signaux du détecteur pour l analyse quantitative. On dispose ainsi de données qualitatives pour la confirmation des pics et les vérifications de pureté de routine. Détection multi-canal La commutation de longueur d onde chronoprogrammée est généralement utilisée pour obtenir des limites de détection basses et une sélectivité élevée pour les analyses quantitatives de routine. Cette commutation est difficile à réaliser si l'élution de certains composés est rapprochée et s il est nécessaire de changer la longueur d onde d excitation ou d émission. Les pics peuvent être déformés et la quantification peut être impossible si la commutation de longueur d onde intervient lors de l élution d un composé. Cela se produit très souvent avec les matrices complexes qui influencent la rétention des composés. En mode spectral, le FLD peut acquérir simultanément jusqu à quatre signaux différents. Ces signaux peuvent tous être utilisés pour l analyse quantitative. En dehors des matrices complexes, ceci s avère avantageux lorsque l on recherche des impuretés à des longueurs d onde supplémentaires. Ceci présente également l avantage d abaisser les limites de détection ou d accroître la sélectivité du fait de l optimisation continuelle des longueurs d onde. Le nombre de points de données acquis par signal est réduit et les limites de détection peuvent donc être plus élevées qu en mode mono-canal, suivant les paramètres du détecteur. Une analyse de PNA peut être effectuée, par exemple, en utilisant la détection multi-canal simultanée au lieu de la commutation de longueur d onde. Avec quatre longueurs d onde d émission différentes, les 15 PNA peuvent être détectés (Tableau, page 94). 92 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

93 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes Tableau 14 Conditions de détection multi-canal simultanée pour l analyse de PNA (voir figure ci-après) Colonne Vydac, 2,1 x 250 mm, PNA, 5 µm Phase mobile A = eau ; B = acétonitrile (50 : 50 ) Gradient 3 min, 60 % 14,5 min, 90 % 22,5 min, 95 % Débit 0,4 ml/min Température de la colonne 22 C Volume d injection 2 µl Paramètres FLD PMT 12, temps de réponse 4 s Manuel d utilisation du FLD Agilent

94 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Le tracé supérieur a été obtenu avec une commutation de longueur d'onde classique. Figure 36 Détection multi-canal simultanée pour l analyse de PNA Jusqu'à présent, seuls les détecteurs à barrette de diodes et les spectromètres de masse pouvaient fournir des informations spectrales en ligne permettant de confirmer l identité des pics déterminée en fonction du temps de rétention. Les détecteurs à fluorescence sont désormais dotés d un nouvel outil pour la confirmation automatique des pics et le contrôle de la pureté. Aucune analyse supplémentaire n est nécessaire après l analyse quantitative. Au cours du développement de méthodes, les spectres d excitation et d émission d étalons de référence sont acquis et entrés dans une bibliothèque, la sélection étant effectuée par le développeur de méthodes. On peut alors comparer automatiquement aux données de la bibliothèque toutes les données spectrales concernant des échantillons inconnus. Tableau 15, page 95 illustre ce principe pour une analyse de PNA. Le facteur de concordance fourni dans le rapport pour chaque pic indique le degré de similitude entre le spectre de 94 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

95 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Développement de méthodes référence et les spectres d un pic. Un facteur de concordance égal à signifie que les spectres sont identiques. En outre, on peut évaluer la pureté d un pic en comparant les spectres d un même pic. Lorsqu on détermine par le calcul qu un pic se situe dans les limites de pureté définies par l utilisateur, le facteur de pureté est égal à la pureté moyenne de tous les spectres qui se situent dans ces limites. La fiabilité de la pureté et du facteur de concordance dépendent de la qualité des spectres enregistrés. Le nombre de points de données fourni par le détecteur à fluorescence étant en général restreint, les facteurs de concordance et les données de pureté obtenus présentent des déviations plus importantes que les données obtenues à l aide du détecteur à barrette de diodes, même si les composés sont identiques. Tableau 15, page 95 présente une recherche automatique de la bibliothèque basée sur les spectres d émission d un échantillon de PNA de référence. Tableau 15 Confirmation de pic à l aide de la bibliothèque de spectres de fluorescence Temps de rét. mesuré/ Bibliothèque/ Table d étalonnage Signal Quantité Pureté # Facteur de Nom de la bibliothèque [min] [min] [min] [ng] concordance 4,859 4,800 5, ,47986e ,764 7,000 7, ,16156e ,137 7,100 7, ,14864e ,005 8,000 8, ,56635e ,841 8,800 9, ,76064e ,838 10,000 10, ,15360e ,439 10,400 10, ,00754e ,826 12,800 13, ,40764e ,340 13,300 14, ,14082e ,274 15,200 16, ,90434e ,187 16,200 17, ,61791e Manuel d utilisation du FLD Agilent

96 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Développement de méthodes Tableau 15 Confirmation de pic à l aide de la bibliothèque de spectres de fluorescence Temps de rét. mesuré/ Bibliothèque/ Table d étalonnage Signal Quantité Pureté # Facteur de Nom de la bibliothèque [min] [min] [min] [ng] concordance 16,865 16,900 17, ,58070e ,586 18,600 19, ,17430e ,200 19,100 20, ,03334e ,106 20,000 21, ,13648e Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

97 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Dans cet exemple, un échantillon de PNA a été utilisé ainsi que les fonctions de balayage du détecteur. Manuel d utilisation du FLD Agilent

98 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Définition des conditions chromatographiques Cet exemple utilise les conditions chromatographiques suivantes (les paramètres du détecteur sont indiqués sur la Figure 37, page 99). Tableau 16 Conditions chromatographiques Phases mobiles A = eau = 50 % B = Acétonitrile = 50 % Colonne Echantillon Débit Vydac-C18-PNA, 250 mm x 2,1 mm d.i., granulométrie de 5 µm PAH 0,5 ng 0,4 ml/min Compressibilité A (eau) 46 Compressibilité B (Acétonitrile) 115 Courses A et B Tableau de chronoprogrammation auto à 0 minute %B=50 à 3 minutes %B=60 à 14,5 minutes %B=90 à 22,5 minutes %B=95 Temps avant arrêt Temps postanalyse 26 min 8 min Volume d injection 1 µl Température du four (1200) 30 C Gain PMT du FLD PMT = 15 Temps de réponse du FLD 4 secondes 98 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

99 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Sélectionnez une longueur d'onde d'excitation dans les UV basses (230 à 260 nm). Cela couvre pratiquement toute la fluorescence de votre échantillon. NE sélectionnez PAS de longueurs d'onde d'émission supplémentaires (B, C, D). Cela augmenterait le temps d'acquisition et baisserait les performances. Figure 37 Paramètres du détecteur pour un balayage des longueurs d onde d émission 1 Attendez que la ligne de base se stabilise. Réalisez l'analyse. Manuel d utilisation du FLD Agilent

100 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 2 Chargez le signal (dans cet exemple, seule la plage de 0 à 13 minutes est représentée). 100 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

101 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Figure 38 Chromatogramme du balayage des longueurs d onde d émission 3 Utilisez le tracé d isoabsorbance pour évaluer les longueurs d onde d émission optimales reportées dans le tableau ci-dessous. Figure 39 Tracé d'isoabsorbance obtenu à partir du balayage de longueur d onde d émission Tableau 17 N de pic Temps Longueur d'onde d émission 1 5,3 min 330 nm 2 7,2 min 330 nm 3 7,6 min 310 nm 4 8,6 min 360 nm 5 10,6 min 445 nm 6 11,23 min 385 nm Manuel d utilisation du FLD Agilent

102 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 4 Utilisez les paramètres et le tableau de chronoprogrammation (page précédente), effectuez une deuxième analyse pour l évaluation de la longueur d onde d excitation optimale. Voir Figure 40, page 102. NE sélectionnez PAS de longueurs d'onde d'excitation supplémentaires (B, C, D). Cela augmenterait le temps d'acquisition et baisserait les performances. Figure 40 Paramètres du détecteur pour un balayage des longueurs d onde d excitation 5 Attendez que la ligne de base se stabilise. Lancez l'analyse. 102 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

103 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 6 Chargez le signal. Figure 41 Chromatogramme - balayage des longueurs d onde d excitation à la longueur d onde de référence de 260/330 nm 7 Utilisez le tracé d isoabsorbance et évaluez les longueurs d onde d excitation optimales (dans cet exemple, dans la plage de 0 à 13 minutes). Figure 42 Tracé d isoabsorbance - Excitation Le tableau ci-dessous présente l ensemble des informations concernant les maxima d émission (voir la Figure 39, page 101) et d excitation. Manuel d utilisation du FLD Agilent

104 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Tableau 18 N de pic Temps Longueur d'onde d émission Longueur d onde d excitation 1 5,3 min 330 nm 220 / 280 nm 2 7,3 min 330 nm 225 / 285 nm 3 7,7 min 310 nm 265 nm 4 8,5 min 360 nm 245 nm 5 10,7 min 445 nm 280 nm 6 11,3 min 385 nm 270 / 330 nm 104 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

105 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Exemple : Optimisation pour plusieurs composés Évaluation du bruit de fond du système Dans l exemple ci-après, on utilise de l eau. 1 Pompez du solvant à travers le système. 2 Définissez la gamme de balayage fluorimétrique dans l écran «FLD special setpoints» (points de consignes spéciaux du FLD) selon vos besoins. REMARQUE Le temps de balayage s accroît si la gamme de balayage est élargie. Avec les valeurs par défaut, le balayage prend environ 2 minutes. 3 Réglez le gain PMT sur 16. La plage de longueurs d'onde et le nombre de pas définissent la durée. En utilisant la plage la plus grande, le balayage dure environ 10 minutes. Figure 43 Paramètres spéciaux du FLD Manuel d utilisation du FLD Agilent

106 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Exemple : Optimisation pour plusieurs composés 4 Définissez un nom de fichier de données et effectuez un balayage fluorimétrique. Une fois le balayage terminé, les résultats apparaissent sous forme de tracé d isoabsorbance (voir Figure 44, page 106). REMARQUE Un bruit de fond faible améliore le rapport signal/bruit (voir également «Réduction de la lumière parasite», page 134). Figure 44 Balayage fluorimétrique de l'eau 106 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

107 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT Cette section décrit comment surmonter un problème de fonctionnement de la version actuelle de la ChemStation Agilent avec le détecteur à fluorescence (G1321A/B). Avec ces modes, il arrive parfois que les spectres ne sont pas acquis dans le fichier de données. L'acquisition de spectres déclenchée par un pic est contrôlée par le biais de 2 paramètres du FLD : THRS (seuil) et PDPW (largeur de pic du détecteur de pics). De plus, l'effet du paramètre PKWD (Largeur de pic du détecteur) concerne uniquement le filtrage du chromatogramme. 1 Réglez les paramètres THRS, PDPW et PKWD en fonction du chromatogramme en cours. Des résultats optimaux sont obtenus pour l'acquisition de spectres déclenchée par un pic lorsque le PDPW est réglé sur 2 pas en dessous du PKWD (voir «Paramètres de largeur de pic», page 133). Manuel d utilisation du FLD Agilent

108 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT 2 Il existe 2 champs sur l'écran de configuration du FLD pour entrer le PKWD Peakwidth (Responsetime) et le THRS Threshold (visible lorsque Multi-EX ou Multi-EM est sélectionné). Les valeurs par défaut sont : PKWD = 6 (0,2 min) ; THRS = 5,000 LU. 108 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

109 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT Les valeurs sélectionnées restent constantes pendant l'analyse. Le paramètre PDPW peut être modifié seulement à l'aide du champ Peakwidth du tableau de chronoprogrammation (visible lorsque Multi-EX ou Multi-EM est sélectionné). REMARQUE Le paramètre PDPW doit être modifié en cas de changement du paramètre PKWD. À 0,0 min dans le tableau de chronoprogrammation, entrez un PDPW = PKWD - 2 (e.g. PKWD = 0,2 min, PDPW = 0,05 min). Dans le cas d'un chromatogramme plus long avec un élargissement de pic ultérieur, vous pouvez augmenter la valeur PDPW par 1 pas en créant une entrée supplémentaire dans le Timetable. Les paramètres THRS et PDPW ont un effet sur l'acquisition de spectres déclenchée par un pic. Vous pouvez modifier le paramètre THRS sur l'écran de configuration du FLD. Le paramètre PDPW n'est modifiable que par le biais du champ Peakwidth dans le Timetable. Manuel d utilisation du FLD Agilent

110 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Acquisition de spectres en modes TOUS LES SPECTRES DU PIC et SPECTRES APEX UNIQUEMENT Notes : L'algorithme de détection de pics fonctionne de manière optimale lorsqu'un pic est réduit à 8 16 points de données. Le FLD acquiert les points de données avec une fréquence d'acquisition interne de 74,08 Hz (= 13,50 ms) (un signal seulement). La réduction des données est influencée par le paramètre PDPW. Lorsque PDPW est trop faible, le détecteur de pics ne détecte aucun pic et assimile le pic à une montée et puis une descente de la ligne de base. Lorsque PDPW est trop important, le détecteur de pics assimile le pic à du bruit. Le détecteur de pics fonctionne en ligne sur le chromatogramme en cours. Cela signifie que le début/sommet/fin du pic est reconnu avec un temps de retard. De plus, les points des spectres sont acquis de manière séquentielle. Cela signifie que l'acquisition de spectres à plage large dure beaucoup plus longtemps que celle de d'un spectre à plage réduite. En cas de chromatographie rapide, il est pratiquement impossible d'acquérir des spectres APEX "propres" : les premiers et derniers points sont acquis avant ou après que la concentration la plus élevée ait pénétré dans la cuve du détecteur. La durée d'acquisition des spectres individuelles est montrée sur l'écran de configuration du FLD. 110 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

111 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Informations sur les solvants Informations sur les solvants Observez les recommandations suivantes lors de l'utilisation de solvants. Observez les recommandations afin d'éviter le développement d'algues, voir les manuels de la pompe. Les petites particules peuvent obstruer les capillaires et les vannes de manière irréversible. Il faut donc toujours filtrer les solvants avec des filtres de 0,4 µm. L'utilisation de solvants qui pourrait avoir un effet corrosif sur les pièces du circuit est à éviter ou à minimiser. Consultez les spécifications relatives à la plage de ph fournies pour les différentes pièces comme les cuves à circulation, les matériaux des vannes etc. ainsi que les recommandations fournies dans les prochains chapitres. Informations sur les solvants pour les pièces du système CPL 1260 Infinity Bio-Inert Pour le système CPL Agilent Infinity Bio-Inert série 1260, Agilent Technologies utilise des matériaux de qualité optimale (voir «Matériaux Bio-Inert», page 32) dans le circuit (également appelés pièces mouillées), qui sont largement acceptés par les biologistes car ils sont réputés pour leur inertie optimale par rapport aux échantillons biologiques et ils garantissent la meilleure compatibilité avec les échantillons communs et les solvants sur une large plage de ph. En clair, le circuit tout entier est dépourvu d'acier inoxydable et d'autres alliages contenant des métaux tels que le fer, le nickel, le cobalt, le chrome, le molybdène ou le cuivre, susceptibles d'interférer avec les échantillons biologiques. Le circuit en aval de l'introduction des échantillons ne contient aucun métal quel qu'il soit. Pour autant, il n'existe aucun matériau qui soit compatible à la fois avec les instruments HPLC polyvalents (vannes, capillaires, ressorts, têtes de pompe, cuves à circulation, etc.) et avec tous les produits chimiques et conditions d'application possibles. Cette section recommande les solvants les plus adaptés. Les produits chimiques connus pour leur dangerosité ne doivent pas être utilisés, ou l'exposition à de tels produits doit être limitée, par exemple pour Manuel d utilisation du FLD Agilent

112 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Informations sur les solvants des procédures de nettoyage de courte durée. Après utilisation de produits chimiques potentiellement agressifs, vous devez nettoyer le système avec des solvants HPLC standard compatibles. PEEK Le PEEK (polyétheréthercétone) associe d'excellentes propriétés en termes de biocompatibilité, résistance chimique, stabilité mécanique et thermique, il est donc le matériau idéal pour les instruments biochimiques. Il est stable dans la plage de ph spécifiée et inerte dans bon nombre de solvants courants. Il existe toujours plusieurs incompatibilités connues avec des produits chimiques tels que le chloroforme, le chlorure de méthylène, le tétrahydrofurane, le diméthylsulfoxyde, les acides forts (acide nitrique > 10 %, acide sulfurique > 10 %, acides sulfoniques, acide trichloroacétique), les halogènes ou solutions halogènes aqueuses, le phénol et ses dérivés (crésols, acide salicylique, etc.). Lorsqu'il est utilisé au-dessus de la température ambiante, le PEEK est sensible aux bases et à divers solvants organiques, ce qui peut le faire gonfler. Puisque les capillaires en PEEK normaux sont très sensibles à une pression élevée, notamment dans de telles conditions, Agilent utilise des capillaires en PEEK recouverts d'acier inoxydable pour maintenir le circuit à l'abri de l'acier et assurer la stabilité de la pression jusqu'à 600 bar. En cas de doute, consultez la documentation disponible sur la compatibilité chimique du PEEK. Titane Le titane est très résistant aux acides oxydants (par exemple acide nitrique, perchlorique et hypochloreux) sur une grande plage de concentrations et de températures. Ceci est dû à une fine couche d'oxyde à la surface, stabilisée par des composés oxydants. Les acides réducteurs (par exemple l'acide chlorhydrique, sulfurique et phosphorique) peuvent provoquer une légère corrosion, qui augmente avec la concentration de l'acide et la température. Par exemple, le taux de corrosion avec 3 % HCl (ph à 0,1 environ) à température ambiante est d'environ 13 µm/an. À température ambiante, le titane résiste à des concentrations d'environ 5 % d'acide sulfurique (ph à 0,3 environ). L'ajout d'acide nitrique aux acides chlorhydriques ou sulfuriques réduit nettement les taux de corrosion. Le titane est sujet à la corrosion dans le méthanol anhydre, ce qui peut être évité en ajoutant une petite quantité d'eau (environ 3 %). Une légère corrosion est possible avec l'ammoniaque > 10 %. 112 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

113 Utilisation du détecteur à fluorescence 4 Informations sur les solvants Silice fondue La silice fondue est inerte à tous les solvants et acides courants, à l'exception de l'acide hydrofluorique. Il est corrodé par des bases fortes et ne doit pas être utilisé à un ph supérieur à 12 à température ambiante. La corrosion des fenêtres de cuve à circulation peut avoir un effet négatif sur les résultats de mesure. Pour un ph supérieur à 12, l'utilisation de cuves à circulation avec des fenêtres en saphir est recommandée. Or L'or est inerte à tous les solvants CPL courants, les acides et les bases dans la plage de ph spécifiée. Il peut être corrodé par les cyanures complexants et les acides concentrés comme l'eau régale (un mélange d'acide chlorhydrique et nitrique concentré). Oxyde de zirconium L'oxyde de zirconium (ZrO 2 ) est inerte à la plupart des acides, bases et solvants courants. Il n'existe aucune incompatibilité documentée pour les applications CPL. Platine/iridium Le platine/l'iridium est inerte à la plupart des acides, bases et solvants courants. Il n'existe aucune incompatibilité documentée pour les applications CPL. PTFE Le PTFE (polytétrafluoroéthylène) est inerte à la plupart des acides, bases et solvants courants. Il n'existe aucune incompatibilité documentée pour les applications CPL. Saphir, rubis et céramiques Al 2 O 3 Le saphir, le rubis et les céramiques à base d'al 2 O 3 sont inertes à presque tous les acides, bases et solvants courants. Il n'existe aucune incompatibilité documentée pour les applications CPL. Les données ci-dessus ont été rassemblées auprès de sources externes et servent de référence. Agilent ne peut garantir ni leur exhaustivité ni leur exacti- Manuel d utilisation du FLD Agilent

114 4 Utilisation du détecteur à fluorescence Informations sur les solvants tude. Ces informations ne peuvent pas non plus être généralisées en raison des effets catalytiques des impuretés telles que les ions métalliques, les agents complexants, l'oxygène, etc. La plupart des données disponibles sont relatives à la température ambiante (généralement C, F). Si une corrosion est possible, elle augmente généralement à des températures plus élevées. En cas de doute, consultez des ressources supplémentaires. 114 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

115 5 Optimisation du détecteur Optimisation du détecteur 5 Informations sur les solvants Généralités sur l optimisation 116 Les caractéristiques de conception facilitent l optimisation. 119 Vérification des performances avant de commencer 119 Détermination des meilleures longueurs d onde 120 Un exemple réel 121 Détermination de la meilleure amplification du signal 122 Échelle et conditions de fonctionnement du FLD 124 Changement de la fréquence de la lampe-éclair au xénon 129 Allongement de la durée de vie de la lampe 130 Sélection du meilleur temps de réponse 131 Réduction de la lumière parasite 134 Ce chapitre fournit des informations concernant l'optimisation du détecteur. Manuel d utilisation du FLD Agilent

116 5 Optimisation du détecteur Généralités sur l optimisation Généralités sur l optimisation REMARQUE Certaines fonctionnalités (p. ex. l'acquisition de spectres, la détection multi-canal) décrites dans ce chapitre ne sont pas disponibles sur le détecteur à fluorescence Infinity 1260 G1321C. 1 Réglage du gain PMT Pour la plupart des applications, un gain de 10 est suffisant (voir «Détermination de la meilleure amplification du signal», page 122). Le convertisseur A/N du FLD est doté d'une plage linéaire étendue, c est pourquoi il n est généralement pas nécessaire de modifier le gain PMT. Par exemple, si le pic d un composé très concentré est étêté, diminuez le gain PMT. N oubliez pas qu un gain PMT faible diminue le rapport signal/bruit. Le test intégré du gain PMT utilise les paramètres du détecteur. Lors du test du gain PMT, le réglage de longueur d onde et le mode d'économie de lampe (options Mode multi-canal et Économie de la lampe) influent sur le calcul du gain PMT. REMARQUE Si vous avez modifié un ou plusieurs paramètres, vous devez appuyer sur 'OK' pour enregistrer les nouveaux paramètres du FLD. Ensuite, lancez le test du gain PMT à partir de l écran 'FLD-Signals'. 2 Sélection du temps de réponse Pour la plupart des applications, un temps de réponse de 4 secondes est suffisant (voir «Sélection du meilleur temps de réponse», page 131). Un réglage inférieur est recommandé seulement pour les analyses à haute vitesse (colonnes courtes et débits importants). N oubliez pas que même si la valeur du temps de réponse est trop élevée, les pics rapides apparaissent un peu plus petits et un peu plus larges mais les temps de rétention et les aires des pics sont néanmoins corrects et reproductibles. 3 Détermination de la longueur d'onde de détection optimale La plupart des molécules fluorescentes absorbent à 230 nm (voir «Détermination des meilleures longueurs d onde», page 120). Réglez la longueur d onde d excitation sur 230 nm et effectuez un balayage en ligne des spectres d émission (en mode multi-émission). Réglez ensuite la longueur 116 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

117 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260 d onde sur la longueur d onde d émission déterminée et effectuez un balayage des spectres d excitation (en mode multi-excitation) pour déterminer la meilleure longueur d onde d excitation. 4 Évaluation des spectres de fluorescence À la différence des détecteurs UV basés sur la technologie de la barrette de diodes qui évaluent les spectres UV en prenant un spectre au sommet du pic et un spectre de référence sur la ligne de base, les spectres de fluorescence sont obtenus en sélectionnant un spectre au sommet du pic et un spectre de référence au niveau des points d inflexion. Il est inutile de sélectionner des spectres de référence sur la ligne de base en raison du bruit important sur la ligne de base (pas de lumière!). 5 Mise sous tension de la lampe seulement pendant les analyses Bien que la sensibilité maximum soit nécessaire, la durée de vie de la lampe peut être augmentée considérablement si elle n'est allumée que pendant les analyses. À la différence d autres détecteurs pour CPL, le détecteur à fluorescence s équilibre en quelques secondes après la mise sous tension de la lampe. REMARQUE Pour obtenir la meilleure reproductibilité et la meilleure linéarité, réglez la lampe pour qu elle reste allumée en continu (par défaut, la lampe est réglée pour ne fonctionner que pendant les analyses). À la première mise en service, il est recommandé de laisser chauffer l instrument pendant une heure. 6 Ne soumettez pas la cuve à circulation du détecteur à une pression trop forte. Lors du rajout de dispositifs supplémentaires comme d'autres détecteurs ou un collecteur de fractions, veillez à ce que les pertes de charge en aval de la cuve à circulation ne dépassent pas 20 bar. Il est préférable de placer un détecteur UV en amont du détecteur à fluorescence. Agilent Technologies 117

118 5 Optimisation du détecteur Généralités sur l optimisation REMARQUE Lorsque vous comparez des spectres d excitation de fluorescence directement à des spectres DAD ou à des spectres d absorbance de la littérature, vous devez prendre en compte les différences importantes de la bande passante optique utilisée (FLD = 20 nm) qui aboutissent à un décalage systématique du maximum de la longueur d onde en fonction du spectre d absorbance du composé à analyser. 118 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

119 Optimisation du détecteur 5 Les caractéristiques de conception facilitent l optimisation. Les caractéristiques de conception facilitent l optimisation. Le module présente plusieurs caractéristiques qui vous permettent d optimiser la détection : GAIN PMT LAMPE TEMPS DE RÉPONSE Facteur d amplification Fréquence des éclairs Intervalle de réduction de données Vérification des performances avant de commencer Avant de commencer, vous devez vérifier que votre détecteur est conforme aux spécifications publiées par Agilent Technologies. Dans la majorité des cas, les solvants de qualité CLP donnent de bons résultats. L expérience montre toutefois que le bruit de la ligne de base est plus élevé avec des solvants de qualité CPL qu avec des solvants de qualité fluorimétrique. Rincez votre système de distribution de solvant pendant au moins 15 minutes avant de vérifier la sensibilité. Si votre pompe comporte plusieurs voies, rincez également les voies non utilisées. Manuel d utilisation du FLD Agilent

120 5 Optimisation du détecteur Détermination des meilleures longueurs d onde Détermination des meilleures longueurs d onde Les longueurs d onde d excitation et d émission représentent les paramètres les plus importants à optimiser en détection de fluorescence. En général, il est admis que la meilleure longueur d onde d excitation peut être déterminée à partir du spectre d excitation acquis à l aide d un spectrofluorimètre. Il est en outre admis que la longueur d onde d excitation optimale déterminée pour un type d instrument particulier peut être utilisée pour d autres instruments. Ces deux postulats sont erronés. La longueur d onde d excitation optimale dépend de l absorption des composés mais également des caractéristiques de l instrument (par exemple, du type de lampe et des réseaux). Comme la plupart des molécules absorbent mieux dans le domaine ultraviolet, le module a été conçu pour un rapport signal/bruit optimal dans la plage 210 nm à 360 nm du spectre. Pour obtenir la meilleure sensibilité, la longueur d onde d absorbance de votre molécule d échantillon doit concorder avec la plage de longueur d onde pour laquelle votre instrument est optimisé. En d autres termes, une longueur d onde d excitation dans le domaine ultraviolet. Votre module offre une plage étendue de longueurs d onde d excitation. Cependant, pour obtenir une meilleure sensibilité, vous devez sélectionner une longueur d onde dans le domaine ultraviolet (proche de 250 nm). Les éléments qui limitent l efficacité dans la région basse de l ultraviolet sont la lampe-éclair au xénon et les réseaux. Les lampes de type éclair décalent la longueur d onde optimale et abaissent les plages de longueurs d onde du module avec un maximum de 250 nm. Le réseau d excitation est de type échelette pour une efficacité maximale à 300 nm. 120 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

121 Optimisation du détecteur 5 Détermination des meilleures longueurs d onde Un exemple réel Même si une longueur d'onde d'excitation de 340 nm est citée dans la littérature, le balayage avec le module de l'orthophthalaldéhyde, un dérivé de l'alanine, un acide aminé ( Figure 45, page 121), montre un maximum entre 220 nm et 240 nm. Figure 45 Balayage de l orthophthalaldéhyde, dérivé de l alanine Si vous recherchez la longueur d onde par balayage, balayez l ensemble du domaine spectral. En effet, cet exemple montre qu un maximum peut se trouver dans un domaine de longueur d onde complètement différent. REMARQUE Lorsque vous comparez des spectres d excitation de fluorescence à des spectres DAD ou à des spectres d absorbance de la littérature, vous devez prendre en compte les différences importantes de la bande passante optique (FLD = 20 nm) qui aboutissent à un décalage systématique de la longueur d onde maximum en fonction du spectre d absorbance du composé à analyser. Manuel d utilisation du FLD Agilent

122 5 Optimisation du détecteur Détermination de la meilleure amplification du signal Détermination de la meilleure amplification du signal Le fait d augmenter le gain PMT augmente l intensité du signal et du bruit. Jusqu à une certaine valeur, l augmentation de l intensité du signal est supérieure à l augmentation de l intensité du bruit. Un pas de gain correspond à un facteur de 2 (comme pour le FLD HP 1046A). Le tracé de la Figure 46, page 122 a été obtenu en augmentant graduellement le gain PMT de 4 à 11 (le pic est celui de l échantillon isocratique Agilent Technologies dilué fois). L'augmentation du gain PMT a permis d'augmenter le rapport signal/bruit, et ce jusqu'à un gain de 10. Au delà de 10, le bruit augmente proportionnellement au signal ; il n'y a donc pas d'amélioration du rapport signal/bruit. Figure 46 Détermination du meilleur gain PMT pour le biphényle Cela est dû au fait que la quantification des lignes de base (en particulier aux faibles niveaux de bruit de fond) ne suffit pas pour développer statistiquement les méthodes de filtrage. Pour déterminer le gain optimal, évaluez votre solvant dans des conditions de circulation à l aide de la fonction auto-gain. Afin 122 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

123 Optimisation du détecteur 5 Détermination de la meilleure amplification du signal d éviter l excès de signaux fluorimétriques élevés, n'utilisez pas des valeurs supérieures à celles proposées par le système si cela n est pas nécessaire. Utilisez la fonction de test PMT pour déterminer automatiquement la valeur du paramètre. Manuel d utilisation du FLD Agilent

124 5 Optimisation du détecteur Détermination de la meilleure amplification du signal Échelle et conditions de fonctionnement du FLD Lors de l'utilisation de FLD différents : La hauteur de signal d'un module FLD G1321 donné peut dépasser la plage de signal recommandée de LU. Dans certaines situations cela peut conduire à l'étêtage des pics. Les hauteurs de signal peuvent varier entre différents modules FLD G1321 pour des méthodes identiques. En général, cela n'est pas une problème mais cela peut devenir gênant si plusieurs FLD G1321 sont utilisés dans un même laboratoire. Dans les deux cas ces problèmes d'échelle peuvent être résolus. Reportez-vous à la section «Optimisation du niveau du gain PMT», page 124. Optimisation du niveau du gain PMT Lancez le test de gain PMT avec vos conditions de fonctionnement (paramètres de la méthode utilisée, longueurs d'onde d'excitation/d'émission, solvant, débit,...). La valeur PMT résultante offre le meilleur rapport signal sur bruit et la plage de signal optimale pour cette méthode et cet instrument. Pour un autre FLD, ce niveau de gain PMT peut être différent (sur la base d'un test de gain PMT spécifique). La figure ci-dessous illustre l'effet de la modification du gain PMT. 124 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

125 Optimisation du détecteur 5 Détermination de la meilleure amplification du signal Figure 47 Comportement du gain PMT Dans cet exemple la sortie maximale est d'environ 220 LU et toute augmentation supplémentaire du PMT (au delà de 9) aboutit à une saturation du signal (étêtage) et une baisse du rapport signal sur bruit. 1 Réglez le niveau du gain PMT Contrôlez à présent que votre pic le plus haut n'est pas étêté ou ne sature pas avec la valeur de la concentration la plus élevée. Si cela n'est pas le cas, vous avez terminé l'optimisation du niveau du gain PMT. Poursuivez avec le "Réglage des unités de luminescence en LU". Si au cours du contrôle vous constatez que la concentration la plus élevée ne rentre pas dans la plage sélectionnée (p. ex. les pics sont étêtés), réduisez la sensibilité de votre FLD en baissant progressivement le niveau PMT par incréments de 1, ce qui diminue la hauteur du signal de moitié environ à chaque pas. Il faut noter que cela diminue la sensibilité pour des niveaux de signal faibles (LOD). Manuel d utilisation du FLD Agilent

126 5 Optimisation du détecteur Détermination de la meilleure amplification du signal 2 Réglage des unités de luminescence en LU Si le niveau de sortie en LU du détecteur ne vous convient pas ou si vous souhaitez aligner la sortie de plusieurs instruments ayant des niveaux de sortie différents, vous pouvez ajuster l'échelle de la sortie de chaque instrument. Il est recommandé de régler le FLD G1321 sur environ 100 LU pour une hauteur de pic maximale et donc un rapport signal/bruit et une plage de signal optimaux. Des valeurs LU inférieures n'ont généralement pas d'effet sur les performances de l'instrument si le test de gain PMT a été effectué convenablement. Une sortie analogique inférieure à 100 LU est optimale pour les meilleures performances de signal analogique avec une atténuation par défaut de 100 LU/1 V. Réglez le niveau LU de manière à ce que le niveau de signal maximal avec l'atténuation par défaut soit comprise entre 50 et 80 LU (sortie analogique équivalente de 500 mv à 800 mv). Après avoir réglé le gain PMT convenablement, vous pouvez ajuster l'échelle de votre instrument pour obtenir le niveau LU désiré. Il est recommandé de ne pas dépasser 100 LU. Le paramètre à régler est appelé le "Facteur d'échelle" et est appliqué par l'unité de commande locale Instant Pilot (version B ou ultérieure). Dans le cas d'utilisation d'une version antérieure, le "Facteur d'échelle" peut être entré à l'aide de l'outil de ligne de commande : ChemStation Agilent : PRINT SENDMODULE$(LFLD,"DMUL x.xx") Instant Pilot : Mode service : FLD. Puis tapez DMUL x.xx et appuyez sur SEND. Outil de mise à jour du micrologiciel LAN/RS-232, menu Envoyer instructions : DMUL x.xx Logiciel Agilent Lab Advisor, menu Instructions : DMUL x.xx Ce paramètre est propre à l'instrument, même pour les mises à jour du micrologiciel, et est indépendant de l'environnement logiciel. Le niveau LU n'est pas une mesure de la sensibilité de l'instrument! À la limite de concentration la plus basse (limite de détection), le rapport signal/bruit (déterminé par le test S/N de Raman par exemple) est le seul 126 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

127 Optimisation du détecteur 5 Détermination de la meilleure amplification du signal paramètre permettant de comparer précisément des chromatogrammes et des résultats et de confirmer les performances de l'instrument. Pour maintenir un bruit de fond minimal et une sensibilité élevée, veillez à ce que la cuve à circulation soit propre et utilisez toujours de l'eau fraîchement préparée pour éviter tout bruit biologique dû à la fluorescence d'algues ou de bactéries. Visualisation des limites du CAN Un nouveau micrologiciel (A.06.11) a été lancé pour le détecteur à fluorescence G1321A/B qui comporte la nouvelle fonctionnalité "Visualisation des limites du CAN". Avant la version A du micrologiciel, une "saturation du CAN" n'était pas visible sur le chromatogramme pour certaines méthodes. La saturation pouvait être masquée par l'effet de lissage d'un filtre et donc invisible à l'utilisateur. Dans la ChemStation Agilent, l'événement "Saturation du CAN" était consigné dans le journal mais n'était pas visible par ailleurs. Ce problème survient uniquement si le paramètre Largeur de pic (temps de réponse) est similaire ou plus grand que la largeur réelle du pic chromatographique. Manuel d utilisation du FLD Agilent

128 5 Optimisation du détecteur Détermination de la meilleure amplification du signal Coups CAN bruts L'intensité lumineuse mesurée est limitée par la plage maximale du convertisseur A/N. Un filtre lisse le pic et masque le fait que l'intensité maximale a été atteinte. L'aire et la hauteur du pic sont également faussées ce qui aboutit à des performances linéaires médiocres. Il est à noter que le paramètre "LU max" n'a pas une valeur définie mais dépend de l'intensité du canal de référence! Nouvelle version ( micrologiciel A ou ultérieur) La valeur LU max est affichée sur le chromatogramme pour toute valeur de l'échantillon dont l'état est "Saturation du CAN", et ce sur la largeur du filtre. Il est à noter que la valeur "LU max" dépend partiellement de la dérive et du bruit de la lampe et fortement de la longueur d'onde d'excitation. Il en découle que la "Saturation du CAN" est visible sous la forme d'un pic réel et plat sur le chromatogramme. Cela avertit l'utilisateur que l'un des réglages du détecteur (gain PMT ou concentration de la solution) est trop élevé. REMARQUE Le transfert de méthodes 1:1 d'un FLD à un autre peut provoquer ce problème de "Saturation du CAN". Pour plus d'informations, voir «Échelle et conditions de fonctionnement du FLD», page 124 "Échelle et conditions de fonctionnement du FLD". 128 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

129 Optimisation du détecteur 5 Changement de la fréquence de la lampe-éclair au xénon Changement de la fréquence de la lampe-éclair au xénon Modes La fréquence des éclairs de la lampe peut être réglée sur les modes suivants : Tableau 19 Modes de fonctionnement de la lampe Position 296 Hz (en standard), 560 V 63 mjoules (18,8 W) 74 Hz (en mode «economy»), 560 V 63 mjoules (4,7 W) Rotation (Multi Ex/Em) 74 Hz (en standard), 950 V 180 mjoules (13,3 W) 74 Hz (en mode «economy»), 560 V 63 mjoules (4,7 W) La meilleure sensibilité est obtenue avec l option no economy, voir la Figure 48, page 129. Figure 48 Fréquence de la lampe-éclair au xénon Manuel d utilisation du FLD Agilent

130 5 Optimisation du détecteur Changement de la fréquence de la lampe-éclair au xénon Allongement de la durée de vie de la lampe Il existe trois façons de prolonger la vie de la lampe : activez l option «lamp on during run» (lampe allumée pendant l analyse), sans perte de sensibilité. activez l option «economy» (économie), ce qui entraîne une perte de sensibilité. utilisez une combinaison des deux options ci-dessus. 130 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

131 Sélection du meilleur temps de réponse Optimisation du détecteur 5 Sélection du meilleur temps de réponse Sélection du meilleur temps de réponse La réduction des données à l aide de la fonction Temps de réponse accroît le rapport signal/bruit. Pour illustration, voir la Figure 49, page 131. Figure 49 Détermination du meilleur temps de réponse Le temps de réponse des détecteurs à fluorescence pour CLP est généralement réglé sur 2 ou 4 s. La valeur par défaut du module est 4 secondes. Il est important de savoir qu'un temps de réponse identique doit être utilisé pour comparer des sensibilités. Un temps de réponse de 4 s (par défaut) est équivalent à une constante de temps de 1,8 s et convient dans les conditions chromatographiques standard. Manuel d utilisation du FLD Agilent

132 5 Optimisation du détecteur Sélection du meilleur temps de réponse Figure 50 Séparation de pics à l aide de la fonction Temps de réponse 132 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

133 Optimisation du détecteur 5 Sélection du meilleur temps de réponse Paramètres de largeur de pic REMARQUE N utilisez pas une largeur de pic trop étroite. Le paramètre Largeur de pic vous permet de choisir la largeur de pic (temps de réponse) de votre analyse. Il s'agit de la largeur d'un pic, en minutes, à mi-hauteur de ce dernier. Définissez la largeur de pic sur le pic le plus étroit attendu de votre chromatogramme. La largeur du pic détermine le temps de réponse optimal du détecteur. Le détecteur de pics ignore les pics dont la largeur est sensiblement plus étroite ou plus importante que la valeur choisie. Le temps de réponse correspond au délai compris entre 10 % et 90 % du signal de sortie, en réponse à une fonction échelon d'entrée. Limites : Lorsque vous configurez la largeur du pic (en minutes), le temps de réponse correspondant est automatiquement défini et la fréquence d'acquisition appropriée pour les signaux et les spectres est sélectionnée dans le tableau ci-dessous. Tableau 20 Paramètres de largeur de pic Largeur de pic Fréquence d'acquisition À mi-hauteur [min] Réponse [s] Hz ms > 0,0016 0, ,93 6,9 G1321B, K1321B (avec micrologiciel A ou supérieur) < 0,003 0,03 74,07 13,5 G1321B/C, K1321B > 0,003 0,06 37,04 27,0 > 0,005 0,12 37,04 27,0 > 0,01 0,25 37,04 27,0 > 0,025 0,5 18,52 54,0 > 0,05 1,0 9,26 108,0 G1321A/B/C, K1321B > 0,1 2,0 4,63 216,0 > 0,2 4,0 2,31 432,0 > 0,4 8,0 1,16 864,0 Manuel d utilisation du FLD Agilent

134 5 Optimisation du détecteur Réduction de la lumière parasite Réduction de la lumière parasite Des filtres passe-bande sont utilisés pour éliminer la lumière parasite et la lumière parasite dans le 2 ème ordre ou supérieur en permettant une transmission complète de la lumière au-dessus du seuil et peu ou pas de transmission au-dessous. Ils sont utilisés entre les réseaux d émission et d excitation pour protéger le tube photomultiplicateur contre la lumière d excitation parasite lors des mesures de spectres d émission. Lorsque les longueurs d onde d émission et d excitation sont proches, la distorsion due à la diffusion limite considérablement la sensibilité. Quand la longueur d onde d émission est égale à deux fois la longueur d excitation, la lumière dans le 2 ème ordre est le facteur limitant. Pour comprendre l effet de la lumière dans un tel ordre, imaginez que le détecteur fonctionne mais qu aucun échantillon n est en train d'être élué à travers la cuve à circulation. La lampe envoie 1 million de photons vers la cuve à circulation, par exemple à 280 nm. La diffusion à la surface de la cuve à circulation et la diffusion due aux molécules de solvant permet à 0,1 % de cette lumière de sortir de la cuve par la fenêtre située à angle droit avec la lumière incidente. Sans filtre passe-bande, ces photons restants atteindraient le réseau d émission. 90 % de ces photons seraient réfléchis totalement, sans dispersion, vers le photomultiplicateur. Les autres 10 % se disperseraient à 280 nm (1 er ordre) et à 560 nm (2 ème ordre). Pour éliminer cette lumière parasite, il faut appliquer un filtre passe-bande à environ 280 nm. Sur la base des applications principales connues, un filtre passe-bande à 295 nm est incorporé pour un fonctionnement sans problème jusqu à 560 nm (voir Figure 51, page 135). 134 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

135 Optimisation du détecteur 5 Réduction de la lumière parasite Figure 51 Réduction de la lumière parasite Manuel d utilisation du FLD Agilent

136 5 Optimisation du détecteur Réduction de la lumière parasite 136 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

137 Manuel d utilisation du FLD Agilent Dépannage et diagnostic Présentation des voyants et des fonctions de test du module 138 Voyants d'état 139 Voyant d état de l alimentation électrique 139 Témoin d'état du module 140 Interfaces utilisateur 141 Logiciel Agilent Lab Advisor 142 Ce chapitre donne un aperçu des fonctions de dépannage et de diagnostic et des différentes interfaces utilisateur. Agilent Technologies 137

138 6 Dépannage et diagnostic Présentation des voyants et des fonctions de test du module Présentation des voyants et des fonctions de test du module Voyants d état Le module est équipé de deux voyants qui indiquent l état opérationnel (préanalyse, analyse et erreur) du module. Ces voyants d état permettent un contrôle visuel rapide du fonctionnement du module. Messages d erreur En cas de défaillance électronique, mécanique ou hydraulique, le module génère un message d erreur au niveau de l interface utilisateur. Pour chaque message, vous trouverez une description succincte de la défaillance, la liste des causes probables du problème et la liste des actions correctives pour y remédier (consulter le chapitre Informations sur les erreurs). Fonctions de test Une suite de fonctions de test est disponible pour la détection des anomalies/pannes et la vérification opérationnelle après le remplacement d éléments internes (consultez le chapitre Fonctions de tests et étalonnages). Recalibration en longueur d'onde La recalibration en longueur d'onde est recommandée après la réparation de composants internes pour vous assurer du bon état de fonctionnement du détecteur. Le détecteur utilise les propriétés spécifiques des caractéristiques de la lumière d'excitation et d'émission (voir «Procédure de calibration en longueur d'onde», page 181). 138 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

139 Dépannage et diagnostic 6 Voyants d'état Voyants d'état Deux voyants d'état sont situés à l'avant du module. Le voyant d'état situé en bas à gauche indique l'état de l'alimentation électrique, et celui en haut à droite indique l'état du module. Figure 52 Emplacement des voyants d'état Voyant d état de l alimentation électrique Le voyant d état de l alimentation électrique est intégré dans l interrupteur d alimentation principal. Si le voyant est allumé (en vert) l appareil est sous tension. Manuel d utilisation du FLD Agilent

140 6 Dépannage et diagnostic Voyants d'état Témoin d'état du module Le témoin d'état du module indique l'un des six états possibles : Lorsque le témoin d'état est ÉTEINT (et si le témoin d'alimentation est allumé), le module est en état de préanalyse, c'est-à-dire prêt à commencer une analyse. Un témoin d'état vert indique que le module est en train d'effectuer une analyse (mode analyse). La couleur jaune indique un état non prêt. Le module se trouve en état non prêt en attendant qu'un état spécifique soit atteint ou achevé (par exemple, aussitôt après la modification d'un point de consigne) ou pendant une procédure d'autotest. Un témoin d'état rouge signale une erreur. Une situation d'erreur indique que le module a détecté un problème interne qui l'empêche de fonctionner correctement. Généralement, une situation d'erreur nécessite une intervention (par exemple, fuite, éléments internes défectueux). Une situation d'erreur interrompt toujours l'analyse. Si l'erreur se produit au cours d'une analyse, elle se propage au sein du système CPL, c.-à-d. qu'une DEL rouge peut correspondre à un problème sur un autre module. Utilisez l'affichage des états de l'interface utilisateur pour déterminer l'origine (raison/module) de l'erreur. Si le témoin clignote, le module est en mode résident (p. ex., pendant la mise à jour du micrologiciel principal). Un témoin clignotant rapidement indique que le module est dans un mode d'erreur de bas niveau. Dans ce cas, essayez un redémarrage du module ou un démarrage à froid (voir «Réglages spéciaux», page 246. Essayez ensuite une mise à jour du micrologiciel (voir «Remplacement du micrologiciel du module», page 202). Si ceci ne résout pas le problème, il est nécessaire de remplacer la carte mère. 140 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

141 Dépannage et diagnostic 6 Interfaces utilisateur Interfaces utilisateur Les tests disponibles dépendent de l'interface utilisateur. Toutes les descriptions de tests sont basées sur l'utilisation du logiciel Agilent ChemStation comme interface utilisateur. Certaines descriptions ne sont fournies que dans le manuel d'entretien. Tableau 21 Fonctions de test disponibles pour chaque interface Test ChemStation Instant Pilot G4208A Lab Advisor Convertisseur A/N Non Non Oui Chromatogramme de test Calibration en longueur d onde Oui (C) Non Oui Oui Oui (M) Oui Intensité de la lampe Oui Non Oui Courant d'obscurité Oui Non Oui C M D via une commande section Maintenance section Diagnostic Manuel d utilisation du FLD Agilent

142 6 Dépannage et diagnostic Logiciel Agilent Lab Advisor Logiciel Agilent Lab Advisor Le logiciel Agilent Lab Advisor est un produit autonome qui peut être utilisé avec ou sans système de gestion de données. Le logiciel Agilent Lab Advisor facilite la gestion du laboratoire afin d'obtenir des résultats chromatographiques de haute qualité et permet de surveiller en temps réel un seul système CPL Agilent ou tous les systèmes CPG et CPL Agilent configurés sur l'intranet du laboratoire. Le logiciel Agilent Lab Advisor comporte des fonctions de diagnostic pour tous les modules Agilent Infinity série Celles-ci comprennent des outils de diagnostic, des procédures de calibration et des opérations de maintenance pour effectuer toute la maintenance de routine. Le logiciel Agilent Lab Advisor permet également aux utilisateurs de surveiller l'état de leurs instruments CPL. Une fonction de maintenance préventive (EMF) est également disponible. L'utilisateur peut, en outre, créer un rapport d'état pour chaque instrument CPL. Les fonctions de test et de diagnostic du logiciel Agilent Lab Advisor peuvent différer des descriptions du manuel. Pour plus d'informations, consultez les fichiers d'aide du logiciel Agilent Lab Advisor. L'utilitaire de l'instrument correspond à une version basique de Lab Advisor avec les fonctionnalités de base nécessaires à l'installation, l'utilisation et la maintenance. Il comporte aucune fonction avancée de réparation, de diagnostic ou de surveillance. 142 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

143 Manuel d utilisation du FLD Agilent Informations concernant les erreurs Qu'est-ce qu'un message d'erreur? 144 Messages d'erreur généraux 145 Timeout 145 Shutdown 146 Remote Timeout 147 Lost CAN Partner 148 Leak 149 Leak Sensor Open 150 Leak Sensor Short 151 Compensation Sensor Open 151 Compensation Sensor Short 152 Fan Failed 153 Messages d erreur du détecteur 154 Lamp Cover Open 154 FLF Board not found 154 ADC Not Calibrated 155 A/D Overflow 156 Flash Lamp Current Overflow 157 No light at reference diode despite lamp is on 157 Flash Trigger Lost 158 Wavelength Calibration Failed 158 Wavelength Calibration Lost 159 Flow Cell Removed 159 Messages d'erreur du moteur 160 Le chapitre suivant explique la signification des messages d'erreur et fournit des informations sur les causes probables et les actions recommandées pour revenir à un état de fonctionnement normal. Agilent Technologies 143

144 7 Informations concernant les erreurs Qu'est-ce qu'un message d'erreur? Qu'est-ce qu'un message d'erreur? Les messages d'erreur s'affichent dans l'interface utilisateur en cas de défaillance électronique, mécanique ou hydraulique (circuit CLHP) qui nécessite une intervention avant de poursuivre l'analyse (par exemple, réparation, échange de fournitures consommables). Lorsqu'une défaillance de ce type se produit, le voyant d'état rouge situé à l'avant du module s'allume, et une entrée d'erreur est consignée dans le journal du module. Si une erreur se produit en dehors d'une analyse, les autres modules n'en seront pas informés. Si elle se produit pendant une analyse, tous les modules connectés reçoivent une notification, toutes les DEL passent au rouge et l'analyse s'arrête. En fonction du type de module, cet arrêt est effectué différemment. Pour une pompe par exemple, le flux est arrêté pour des raisons de sécurité. Pour un détecteur, le témoin reste allumé pour éviter une durée d'équilibrage. En fonction du type d'erreur, l'analyse suivante peut uniquement démarrer si l'erreur a été résolue, par exemple le liquide d'une fuite a été séché. Les erreurs d'événements probablement uniques peuvent être réparées en allumant le système dans l'interface utilisateur. Une manipulation spéciale est effectuée en cas de fuite. Une fuite représente un problème de sécurité potentiel et a pu se produire sur un autre module que celui où il a été observé, une fuite entraîne toujours un arrêt de tous les modules, même en dehors d'une analyse. Dans tous les cas, la propagation de l'erreur a via le bus CAN ou un câble de commande à distance APG (voir documentation de l'interface APG). 144 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

145 Informations concernant les erreurs 7 Messages d'erreur généraux Messages d'erreur généraux Les messages d erreur généraux sont communs à tous les modules CLHP Agilent et peuvent également apparaître sur d autres modules. Timeout Error ID: 0062 Dépassement du délai d'attente Le temps imparti a été dépassé. Cause probable 1 L analyse s est terminée correctement et la fonction timeout (dépassement du délai d'attente) a arrêté le module comme demandé. 2 Un état «non prêt» existait pendant une séquence ou une analyse à injections multiples pendant une durée supérieure au seuil prévu. Actions suggérées Recherchez dans le journal la présence et l'origine d'un état non prêt. Relancez l'analyse si nécessaire. Recherchez dans le journal la présence et l'origine d'un état non prêt. Relancez l'analyse si nécessaire. Manuel d utilisation du FLD Agilent

146 7 Informations concernant les erreurs Messages d'erreur généraux Shutdown Error ID: 0063 Arrêt du système Un instrument externe a émis un signal d'arrêt du système sur la ligne de commande à distance. Le module surveille en permanence les signaux d'état sur les connecteurs de commande à distance. Ce message d'erreur est généré par une valeur de signal BASSE sur la broche 4 du connecteur d'entrée de commande à distance. Cause probable 1 Détection d'une fuite au niveau d'un autre module relié au système par un bus CAN. 2 Détection d'une fuite au niveau d'un instrument extérieur relié au système. 3 Arrêt d'un instrument extérieur relié au système. 4 Le dégazeur n'est pas parvenu à obtenir un vide suffisant pour le dégazage du solvant. Actions suggérées Corrigez la fuite au niveau de l'instrument externe avant de redémarrer le module. Corrigez la fuite au niveau de l'instrument externe avant de redémarrer le module. Inspectez les instruments externes à la recherche d'une condition d'arrêt. Vérifiez si une situation d'erreur s'est produite au niveau du dégazeur à vide. Consultez le Manuel d'entretien du dégazeur, ou celui de la pompe 1260 avec dégazeur intégré. 146 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

147 Informations concernant les erreurs 7 Messages d'erreur généraux Remote Timeout Error ID: 0070 Dépassement de délai sur la commande à distance Il subsiste un état non-prêt sur le connecteur de commande à distance. Lorsqu'une analyse est lancée, le système s'attend à voir disparaître tous les états non prêt (comme celui qui correspond à la mise à zéro du détecteur) dans un délai d'une minute. Si au bout d'une minute, il subsiste un état non prêt sur la ligne de commande à distance, le message d'erreur est émis. Cause probable 1 État «non prêt» dans l un des instruments connectés à la ligne de commande à distance. Actions suggérées Vérifiez que l'instrument qui présente l'état «non prêt» est correctement installé et configuré pour l'analyse. 2 Câble de commande à distance défectueux. Remplacez le câble de commande à distance. 3 Composants défectueux dans l instrument montrant un état non prêt. Vérifiez que l'instrument n'est pas défectueux (voir la documentation de l'instrument). Manuel d utilisation du FLD Agilent

148 7 Informations concernant les erreurs Messages d'erreur généraux Lost CAN Partner Error ID: 0071 Perte de communication CAN Durant une analyse, un défaut de synchronisation ou de communication interne entre des modules du système s'est produit. Les processeurs du système surveillent continuellement sa configuration. Si un ou plusieurs des modules ne sont plus reconnus comme connectés au système, ce message d'erreur est généré. Cause probable Actions suggérées 1 Câble CAN déconnecté. Vérifiez que tous les câbles CAN sont correctement connectés. Vérifiez que tous les câbles CAN sont correctement installés. 2 Câble CAN défectueux. Remplacez le câble CAN. 3 Carte mère défectueuse dans un autre module. Mettez le système hors tension. Redémarrez-le et recherchez le ou les modules qu'il ne reconnaît pas. 148 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

149 Informations concernant les erreurs 7 Messages d'erreur généraux Leak Error ID: 0064 Fuite Une fuite a été détectée dans le module. Les signaux émis par les deux capteurs de température (capteur de fuites et capteur de compensation de température ambiante monté sur carte) sont utilisés par l'algorithme de détection de fuite pour déterminer si une fuite est présente. En cas de fuite, le capteur de fuites est refroidi par le solvant. La résistance du capteur de fuites varie alors et est détectée par les circuits de capteur de fuites sur la carte mère. Cause probable Actions suggérées 1 Raccords desserrés, Vérifiez que tous les raccords sont bien serrés. 2 Capillaire cassé. Remplacez les capillaires défectueux. Manuel d utilisation du FLD Agilent

150 7 Informations concernant les erreurs Messages d'erreur généraux Leak Sensor Open Error ID: 0083 Capteur de fuites ouvert Le capteur de fuites du module est défectueux (circuit ouvert). Le courant qui passe au travers du capteur de fuites dépend de la température. Une fuite est détectée quand le solvant refroidit le capteur de fuites, entraînant le changement, dans des limites définies, du courant du capteur de fuites. Si le courant tombe en deçà de la limite inférieure, ce message d'erreur est émis. Cause probable 1 Capteur de fuite non connecté à la carte mère. Actions suggérées Contactez votre technicien Agilent. 2 Capteur de fuites défectueux. Contactez votre technicien Agilent. 3 Le capteur de fuite n est pas câblé correctement ou pincé par un élément métallique. Contactez votre technicien Agilent. 150 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

151 Informations concernant les erreurs 7 Messages d'erreur généraux Leak Sensor Short Error ID: 0082 Court-circuit du capteur de fuites Le capteur de fuite du module est défectueux (court-circuit). Le courant qui passe au travers du capteur de fuites dépend de la température. Une fuite est détectée quand le solvant refroidit le capteur de fuites, entraînant le changement, dans des limites définies, du courant du capteur de fuites. Si le courant dépasse la limite supérieure, le message d'erreur est émis. Cause probable Actions suggérées 1 Capteur de fuites défectueux. Contactez votre technicien Agilent. Compensation Sensor Open Error ID: 0081 Capteur de compensation ouvert Le capteur de compensation de température (résistance CTN) situé sur la carte mère du module est défectueux (circuit ouvert). La résistance du capteur de compensation de température de la carte mère dépend de la température ambiante. La variation de la résistance est utilisée pour compenser les variations de la température ambiante. Si la résistance aux bornes du capteur dépasse la limite supérieure, ce message d'erreur est émis. Cause probable Actions suggérées 1 Carte mère défectueuse. Contactez votre technicien Agilent. Manuel d utilisation du FLD Agilent

152 7 Informations concernant les erreurs Messages d'erreur généraux Compensation Sensor Short Error ID: 0080 Court-circuit du capteur de compensation Le capteur de compensation de température (résistance CTN) situé sur la carte mère du module est défectueux (court-circuit). La résistance du capteur de compensation de température de la carte mère dépend de la température ambiante. La variation de la résistance est utilisée pour compenser les variations de la température ambiante. Si la résistance aux bornes du capteur descend au-dessous de la limite inférieure, le message d'erreur est émis. Cause probable Actions suggérées 1 Carte mère défectueuse. Contactez votre technicien Agilent. 152 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

153 Informations concernant les erreurs 7 Messages d'erreur généraux Fan Failed Error ID: 0068 Ventilateur défaillant Le ventilateur de refroidissement du module est défaillant. Le capteur placé sur l'axe du ventilateur permet à la carte mère de surveiller la vitesse du ventilateur. Si la vitesse tombe au-dessous d'une certaine limite pendant un certain laps de temps, ce message d'erreur est émis. Selon le module, certains ensembles (p. ex., la lampe du détecteur) sont éteints afin d'éviter toute surchauffe à l'intérieur du module. Cause probable Actions suggérées 1 Câble du ventilateur débranché. Contactez votre technicien Agilent. 2 Ventilateur défectueux. Contactez votre technicien Agilent. 3 Carte mère défectueuse. Contactez votre technicien Agilent. Manuel d utilisation du FLD Agilent

154 7 Informations concernant les erreurs Messages d erreur du détecteur Messages d erreur du détecteur Lamp Cover Open Error ID: 6622, 6731 Capot de la lampe ouverte Le capot de la lampe dans le compartiment optique a été retiré. La lampe ne peut pas être allumée tant que ce message est affiché. Cause probable Actions suggérées 1 Capot de la lampe retiré. Contactez votre technicien Agilent. FLF Board not found Error ID: 6620, 6730 Carte FLF introuvable La carte mère (FLM) ne trouve pas la carte FLF. Ce message est associé à un autre message généré par la carte FLF (p. ex. Fuite,...). Cause probable 1 La carte FLF n'est pas connectée à la carte FLM. Actions suggérées Contactez votre technicien Agilent. 2 Carte FLF défectueuse. Contactez votre technicien Agilent. 3 Carte FLM défectueuse. Contactez votre technicien Agilent. 154 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

155 Informations concernant les erreurs 7 Messages d erreur du détecteur ADC Not Calibrated Error ID: 6621, 6732 Convertisseur A/N non calibré Le convertisseur analogique/numérique situé sur la carte FLF ne peut pas être calibré. Cause probable 1 CAN ou autres composants électroniques défectueux. Actions suggérées Contactez votre technicien Agilent. Manuel d utilisation du FLD Agilent

156 7 Informations concernant les erreurs Messages d erreur du détecteur A/D Overflow Error ID: 6618, 6619 Saturation A/N Ce message n'est pas généré par la version A ou antérieure du micrologiciel. Il signale une saturation du convertisseur A/N (signal d'échantillon). L'interface utilisateur affiche alors un état "Non prêt" pour le FLD et un événement est enregistré dans le journal. Si le message est affiché pendant une analyse, il indique l'heure de début et de fin de l'événement FLD 1 A/D overflow (RT is 0.32 min) 16:33:24 02/11/ FLD 1 A/D overflow finished (RT is 0.67 min)16:33:46 02/11/99 Si cet événement se produit avant le début d'une analyse, le système bascule en état "Non prêt" et l'analyse ou la séquence ne pourra être démarrée. Avec les versions A ou ultérieure du micrologiciel, une saturation A/N correspond à la présence d'un pic plat (étêté) dans le chromatogramme. Pour plus d'informations, reportez-vous à la section «Visualisation des limites du CAN», page 127. Cause probable Actions suggérées 1 Réglage PMT trop élevé. Réduisez le gain PMT. 2 Réglage incorrect de la longueur d'onde. Modifiez le réglage de la longueur d'onde. 156 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

157 Informations concernant les erreurs 7 Messages d erreur du détecteur Flash Lamp Current Overflow Error ID: 6704 Saturation du courant de la lampe-éclair Le courant de la lampe-éclair au xénon est surveillé en continu. Si le courant est trop élevé, une erreur est générée et la lampe est éteinte. Cause probable 1 Court-circuit du déclencheur ou carte FLL défectueuse. Actions suggérées Contactez votre technicien Agilent. 2 Court-circuit de l'ensemble lampe-éclair. Contactez votre technicien Agilent. No light at reference diode despite lamp is on Error ID: 6721 Diode de référence éteinte alors que la lampe est allumée. Carte avant (FLF), versions A/B/C : Aucun mécanisme de rétroaction ne vérifie que la lampe est allumée! Si le chromatogramme ne présente pas de pics et que l'interface utilisateur affiche que l'état du module est Ready, effectuez d'abord un "Test d'intensité de lampe" (voir «Test d'intensité de lampe», page 164). Si le chromatogramme est plat, effectuez les étapes ci-dessous. Carte avant (FLF), version D : Les éclairs de la lampe-éclair au xénon sont surveillés en continu. Si la lampe n'a pas émis plus de 100 éclairs en série, une erreur est générée et la lampe est éteinte. Cause probable Actions suggérées 1 Matériel défectueux. Contactez votre technicien Agilent. Manuel d utilisation du FLD Agilent

158 7 Informations concernant les erreurs Messages d erreur du détecteur Flash Trigger Lost Error ID: 6722 Perte du déclencheur d'éclair Ce message est affiché lorsque le déclencheur d'éclair n'est plus généré. Cause probable Actions suggérées 1 Problème de micrologiciel. Arrêtez puis redémarrez le détecteur. 2 Mode Multi éteint Contactez votre technicien Agilent. 3 Encodeur défectueux. Contactez votre technicien Agilent. Wavelength Calibration Failed Error ID: 6703 Échec de la calibration en longueur d onde Ce message peut s'afficher pendant la calibration en longueur d'onde. Si le décalage prévu est plus important que la précision définie pour la longueur d'onde, le message "Échec de la calibration en longueur d onde" est affiché et l'instrument reste à l'état Not Ready. Cause probable 1 Lampe-éclair non allumée ou position incorrecte. Actions suggérées Contactez votre technicien Agilent. 2 Position de la cellule incorrecte. Vérifiez la position de la cellule. 3 Solvant souillé ou bulles d'air dans cuve. Rincez la cuve à circulation. 4 Position de l'ensemble monochromateur incorrecte (après remplacement). Contactez votre technicien Agilent. 158 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

159 Informations concernant les erreurs 7 Messages d erreur du détecteur Wavelength Calibration Lost Error ID: 6691 Perte de la calibration en longueur d'onde Après le remplacement d'ensembles monochromateur, les facteurs de calibration doivent être réglés sur les valeurs par défaut (une nouvelle carte FLM est fournie avec des valeurs par défaut). Dans ce cas, la message "Perte de la calibration en longueur d'onde" s'affiche et l'instrument reste à l'état Not Ready. Cause probable 1 Réglage des paramètres du monochromateur après remplacement. Actions suggérées Effectuez une calibration en longueur d'onde. 2 Remplacement de la carte FLM. Effectuez une calibration en longueur d'onde. Flow Cell Removed Error ID: 6616, 6702, 6760 Cuve à circulation retirée Le détecteur est doté d'un système de reconnaissance de cuve automatique. Lorsque la cuve à circulation est retirée, la lampe est éteinte et l'instrument bascule à l'état NOT READY. Si la cuve à circulation est retirée pendant une analyse, l'instrument commence à s'shut DOWN. Cause probable 1 La cuve à circulation a été retirée pendant une analyse. Actions suggérées Introduisez la cuve à circulation et allumez la lampe. Manuel d utilisation du FLD Agilent

160 7 Informations concernant les erreurs Messages d erreur du détecteur Messages d'erreur du moteur REMARQUE Des messages d'erreur concernant le moteur du monochromateur peuvent s'afficher pendant l'initialisation ou le fonctionnement du détecteur. Des messages spécifiques existent pour la partie excitation et la partie émission. Si une erreur se produit, allumez la lampe. Cela permet d'effacer l'erreur et de réinitialiser les moteurs. Contactez votre technicien Agilent si des messages concernant le moteur apparaissent. 160 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

161 Manuel d utilisation du FLD Agilent Fonctions de test Introduction 162 Schéma du trajet de la lumière 163 Test d'intensité de lampe 164 Historique de la lampe 165 Test de signal sur bruit Raman ASTM 166 À l'aide de Lab Advisor Agilent 169 Interprétation des résultats 169 Utilisation du chromatogramme de test intégré 170 Procédure avec Agilent Lab Advisor 170 Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration 172 Test de précision de la longueur d onde 175 À l'aide de Lab Advisor Agilent 175 Interprétation des résultats 177 À l'aide de ChemStation Agilent (manuellement) 178 Procédure de calibration en longueur d'onde 181 Ce chapitre décrit les fonctions de test intégrées du détecteur. Agilent Technologies 161

162 8 Fonctions de test Introduction Introduction Tous les tests sont décrits pour le logiciel Agilent Lab Advisor B Il est possible que d'autres interfaces utilisateur ne fournissent aucun test ou seulement quelques uns. Tableau 22 Interfaces et fonctions de tests disponibles Interface Remarque Fonction disponible Utilitaires de l instrument Agilent Des tests de maintenance sont disponibles Intensité Calibration en longueur d onde Agilent Lab Advisor Tous les tests sont disponibles Intensité Dérive et bruit ASTM Courant d'obscurité Convertisseur A/N Précision de la longueur d'onde Calibration en longueur d onde Chromatogramme de test (Outils) Balayage des spectres (Outils) Informations sur le module (Outils) Diagnostic (Outils) ChemStation Agilent Certains tests peuvent être disponibles Ajout de la température Certains tests Lab Advisor Agilent Instant Pilot Certains tests sont disponibles Intensité Calibration en longueur d onde Balayage des spectres (Outils) Informations sur le module (Outils) Diagnostic Pour obtenir des informations supplémentaires sur l utilisation de l interface, consultez la documentation de l interface. 162 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

163 Fonctions de test 8 Schéma du trajet de la lumière Schéma du trajet de la lumière Le trajet de la lumière est présenté dans la Figure 53, page 163. Figure 53 Schéma du trajet de la lumière Manuel d utilisation du FLD Agilent

164 8 Fonctions de test Test d'intensité de lampe Test d'intensité de lampe Le test d intensité balaie un spectre d intensité à l aide de la diode de référence (200 à 1200 nm par pas de 1 nm) et le stocke dans un tampon de diagnostic. Le résultat du balayage est affiché dans une fenêtre graphique. Aucune évaluation supplémentaire n'a lieu. Les résultats de ce test sont enregistrés dans l historique de la lampe (code de date, intensité). Figure 54 Test d'intensité de lampe (Agilent Lab Advisor) REMARQUE Le profil peut varier d un instrument à un autre. Il dépend de l ancienneté de la lampe et du contenu de la cuve à circulation (utilisez de l eau fraîchement préparée). La dégradation des UV (en particulier en dessous de 250 nm) est considérablement plus élevée que dans le domaine visible. En général, l utilisation de l'option "LAMP ON during run" ou du "economy mode" prolonge la vie de la lampe d un ordre de grandeur. 164 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

165 Fonctions de test 8 Test d'intensité de lampe Historique de la lampe Les résultats du test d intensité de lampe (si le dernier remonte à plus d une semaine) sont enregistrés dans l historique de la lampe (code de date, intensité à quatre longueurs d onde différentes : 250, 350, 450 et 600 nm). Les données/tracés peuvent être récupérés à l aide de la fonction de diagnostic et permettent de voir le profil d intensité dans le temps. Figure 55 Historique d'intensité de lampe (sous Module Info dans Agilent Lab Advisor) Manuel d utilisation du FLD Agilent

166 8 Fonctions de test Test de signal sur bruit Raman ASTM Test de signal sur bruit Raman ASTM Ce test contrôle le rapport signal/bruit Raman ASTM pour les détecteurs FLD G1321. Figure 56 Test de signal sur bruit Raman ASTM (Lab Advisor) Selon la version du détecteur, les spécifications ont été modifiées. Tableau 23 Spécifications du test de signal sur bruit Raman ASTM Instrument Spécification S/B Raman/obscurité Spécification S/B Deux canaux Remarque G1321C (1260) 500 / 3000 Carte FLF, version D et supérieure G1321B (1260) 500 / Carte FLF, version D et supérieure G1321A (1200) Carte FLF, version D et supérieure G1321A (1100) 400 Carte FLF, version B et supérieure G1321A (1100) 200 Carte FLF, version A Conditions : Cuve à circulation standard (G , G ), débit de 0,25 ml/min d'eau. REMARQUE Les valeurs Dark et Dual WL sont des spécifications supplémentaires. La valeur Raman est utilisée pour le contrôle normal de l'instrument. 166 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

167 Fonctions de test 8 Test de signal sur bruit Raman ASTM REMARQUE La valeur "mono-canal au signal" peut être mesurée avec Agilent Lab Advisor. Toutes les autres spécifications (qui ne sont pas utilisées pour un contrôle normal) doivent être configurées manuellement à partir des informations du Tableau 26, page 167 et du Tableau 27, page 168. Tableau 24 Durée Conditions de test de signal sur bruit Raman environ 23 minutes Cuve à circulation standard G , G Solvant Débit Eau de qualité CPL, dégazée 0,25 ml/min Spécification (mono-canal au signal) > 500 (d'après les paramètres du Tableau 25, page 167) Spécification (mono-canal pour le bruit) > 3000 (d'après les paramètres du Tableau 26, page 167) Spécification (deux canaux) > 300 (d'après les paramètres du Tableau 27, page 168) Tableau 25 Paramètres pour les spécifications mono-canal (au signal) Temps EX EM PMT Ligne de base Libre 20, Libre Tableau 26 Paramètres pour les spécifications mono-canal (pour le bruit) Temps EX EM PMT Ligne de base Libre 20, Libre Manuel d utilisation du FLD Agilent

168 8 Fonctions de test Test de signal sur bruit Raman ASTM Tableau 27 Paramètres pour les spécifications à deux canaux (balayage multi-em) Temps EX EM_A EM_B Spectres De À Pas PMT Ligne de base Ajuster spectre 00, Aucun Libre Éteint 20, Aucun Libre Éteint Formules pour la valeur signal/bruit Raman ASTM (pour plus d'informations, voir la Figure 57, page 168) : mean_raman (ex 350, em 397) mean_background (ex 350, em 450) SNR_Raman noise_raman (ex 350, em 397) mean_raman (ex 350, em 397) mean_background (ex 350, em 450) SNR_Dark noise_background (ex 350, em 450) Figure 57 Calcul du rapport signal/bruit Raman ASTM 168 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

169 Fonctions de test 8 Test de signal sur bruit Raman ASTM À l'aide de Lab Advisor Agilent 1 Configurez le système HPLC et Lab Advisor. 2 Rincez la cuve à circulation à l eau bidistillée. 3 Lancez le test avec le logiciel Agilent Lab Advisor. Figure 58 Test de signal sur bruit Raman ASTM (Agilent Lab Advisor) Si ce test échoue (comme illustré ci-dessus), reportez-vous à la section «Interprétation des résultats», page 169. Interprétation des résultats Si les valeurs Raman obtenues avec le test sont faibles, vérifiez que : la cuve à circulation est positionnée correctement, la cuve à circulation est propre (rincez avec de l'eau bidistillée), la cuve ne contient pas de bulles d'air (utilisez le balayage fluorimétrique ou contrôlez visuellement la cuve/cuvette), le filtre d'entrée de solvant fonctionne correctement (peut créer des bulles d'air dans la cuve à circulation). Manuel d utilisation du FLD Agilent

170 8 Fonctions de test Utilisation du chromatogramme de test intégré Utilisation du chromatogramme de test intégré Cette fonction est disponible dans les logiciels Agilent ChemStation, Lab Advisor et Instant Pilot. Le chromatogramme de test intégré peut être utilisé pour vérifier le trajet du signal entre le détecteur et le système de données et l'analyse des données ou depuis la sortie analogique jusqu'à l'intégrateur ou au système de données. Le chromatogramme est répété en continu jusqu'à être interrompu manuellement ou après un délai d'exécution maximal. REMARQUE La hauteur de pic est constante mais l'aire du pic et le temps de rétention dépendent de la largeur de pic définie (voir l'exemple ci-dessous). Procédure avec Agilent Lab Advisor Cette procédure d'exécution convient à tous les détecteurs Agilent 1200 Infinity (DAD, MWD, VWD, FLD et RID). L'exemple présenté dans la figure est pour un détecteur à indice de réfraction (RID). 1 Assurez-vous que la méthode CPL par défaut est chargée à l'aide du logiciel de commande. 2 Lancez le Logiciel Agilent LabAdvisor (version B SP4 ou ultérieure) et ouvrez la sélection Tools pour le détecteur. 3 Ouvrez l'écran du chromatogramme de test 4 Lancez le Test Chromatogram. 5 Allez au Module Service Center du détecteur et ajoutez le signal du détecteur à la fenêtre de tracé du signal. 170 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

171 Fonctions de test 8 Utilisation du chromatogramme de test intégré 6 Pour démarrer un chromatogramme de test, saisissez la ligne de commande : STRT Figure 59 Chromatogramme de test avec Agilent LabAdvisor 7 Pour arrêter le chromatogramme de test, saisissez la ligne de commande : STOP REMARQUE Le chromatogramme de test est arrêté automatiquement à la fin de l'analyse. Manuel d utilisation du FLD Agilent

172 8 Fonctions de test Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration La calibration en longueur d onde s effectue avec une solution de glycogène à forte activité de diffusion élastique (selon la méthode ASTM E "Spectral Bandwidth and Wavelength Accuracy of Fluorescence Spectrometers"). La solution de glycogène est introduite dans la cuve à circulation, puis la fonction intégrée de calibration en longueur d onde est utilisée. L algorithme repose sur l évaluation de différents ordres de réseau et sur le calcul des échelles de longueurs d onde des monochromateurs d excitation et d émission à l aide de l équation fondamentale des réseaux. REMARQUE Une calibration en longueur d'onde complète n'est pas toujours nécessaire. Dans la plupart des cas, une vérification rapide de la précision de la longueur d'onde est suffisante (voir le Tableau 28, page 172). Tableau 28 Raisons principales pour effectuer une vérification ou une calibration Vérification Calibration en longueur d onde intérêt conformité aux BPL X X remplacement de cuve X ( X ) remplacement de lampe X ( X ) replacement de monochromateur remplacement de carte mère remplacement d'unité optique X X X ( X ) requis uniquement si le décalage est trop important. REMARQUE Avant la calibration en longueur d'onde, il convient de procéder à la vérification de la précision de la longueur d onde (voir le «Test de précision de la longueur d onde», page 175). Si le décalage est supérieur à ±3 nm, il faut effectuer la calibration en longueur d'onde comme décrit dans la «Procédure de calibration en longueur d'onde», page Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

173 Fonctions de test 8 Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration REMARQUE La calibration en longueur d onde prend environ 15 minutes plus le temps de préparation de l échantillon étalon et du système. Le gain PMT est modifié automatiquement en fonction de l intensité maximum détectée au cours du balayage, ce qui prend une minute de plus par balayage. Tableau 29, page 174 montre les étapes de la calibration en longueur d'onde. Les réseaux d excitation et d émission sont calibrés à l aide de la lumière parasite Rayleigh provenant de la cuve à circulation ou de la cuvette et mesurée à l aide du tube photomultiplicateur. Figure 60 Calibration en longueur d'onde (Agilent Lab Advisor) Manuel d utilisation du FLD Agilent

174 8 Fonctions de test Vérification de la précision des longueurs d onde et calibration Tableau 29 Étapes de la calibration en longueur d'onde Étape Description Durée 1 Préparation 30 s maximum 2 Balayage rotationnel d'excitation, cercle complet 60 s 3 Balayage rotationnel d'excitation, haute résolution 44 s 4 Balayage de position d'excitation, basse résolution 55 s variable 5 Balayage de position d'excitation, haute résolution 260 s variable 6.n Balayage rotationnel d'émission, cercle complet (le nombre de balayages dépend du gain PMT requis, 1 min par balayage) 61 s variable 6.n Balayage rotationnel d'émission, cercle complet (profil de l'instrument) 9 s 6.n Balayage rotationnel d'émission, cercle complet (profil de l'instrument) 9 s 6.n Balayage rotationnel d'émission, cercle complet (profil de l'instrument) 9 s 6.n Balayage rotationnel d'émission, cercle complet (profil de l'instrument) 9 s 7 Balayage rotationnel d'émission, haute résolution, partie I 44 s 8 Balayage rotationnel d'émission, haute résolution, partie II 44 s 9 Balayage de position d'émission, basse résolution 50 s variable 10 Balayage de position d'émission, haute résolution 250 s variable REMARQUE Les durées marquées "variables" peuvent être un peu plus longues. Quand la lampe est hors tension, la procédure de calibration s arrête au cours de l une des deux premières étapes et le message "Échec de la calibration en longueur d'onde" apparaît (voir «Wavelength Calibration Failed», page 158). 174 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

175 Test de précision de la longueur d onde Fonctions de test 8 Test de précision de la longueur d onde À l'aide de Lab Advisor Agilent 1 Configurez le système HPLC et Agilent Lab Advisor. 2 Rincez la cuve à circulation à l eau bidistillée. 3 Allumez la lampe du FLD. 4 Exécutez le test de précision de la longueur d'onde. 5 Le FLD bascule en mode multi-excitation avec une longueur d'onde d'émission à 397 nm et effectue un balayage autour du maximum attendu, soit 350 nm±20 nm. Par conséquent, le maximum doit se situer à 350 nm ±3 nm (voir Figure 61, page 175). Le FLD bascule en mode multi-émission avec une longueur d'onde d'excitation à 350 nm et effectue un balayage autour du maximum attendu, soit 397 nm±20 nm. Par conséquent, le maximum doit se situer à 397 nm ±3 nm (voir Figure 61, page 175). Figure 61 Spectres d'excitation et d'émission (résultats attendus) Manuel d utilisation du FLD Agilent

176 8 Fonctions de test Test de précision de la longueur d onde REMARQUE Le test échoue si les maxima des tracés ne sont pas EM =397 nm et EX =350 nm (±3 nm) (voir la figure ci-dessous). Reportez-vous à la section «Interprétation des résultats», page 177. Figure 62 Test de précision de la longueur d'onde avec Lab Advisor Si le test échoue, observez les maxima des côtés EX et EM sous l'onglet Signals. Figure 63 Exemple d'un bon maximum EX Le test échoue si les maxima des tracés ne sont pas EM =397 nm et EX =350 nm (±3 nm) (voir la figure ci-dessous). Reportez-vous à la section «Interprétation des résultats», page Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

177 Fonctions de test 8 Test de précision de la longueur d onde Figure 64 Exemple de mauvais maxima EX et EM (aucun maximum détecté) Interprétation des résultats Si le test échoue, vérifiez que : la cuve à circulation est positionnée correctement, la cuve à circulation est propre (rincez avec de l'eau bidistillée), la cuve ne contient pas de bulles d'air (utilisez le balayage fluorimétrique ou contrôlez visuellement la cuve/cuvette), le filtre d'entrée de solvant fonctionne correctement (peut créer des bulles d'air dans la cuve à circulation), aucune contamination n'est présente sur le trajet optique (entretien), l'alignement de la lampe et du déclencheur est correct (entretien). Effectuez une calibration en longueur d'onde. Manuel d utilisation du FLD Agilent

178 8 Fonctions de test Test de précision de la longueur d onde À l'aide de ChemStation Agilent (manuellement) 1 Créez les méthodes WLEMTEST et WLEXTEST comme indiqué dans le Tableau 30, page 178. Tableau 30 Paramètres des méthodes Paramètre Vérif. de la long. d'onde EM à 397 nm WLEMTEST Vérif. de la long. d'onde EX à 350 nm WLEXTEST Largeur de pic > 0,2 min (4 s, standard) > 0,2 min (4 s, standard) Ajuster plage spectrale Éteint Éteint Gain PMT Lampe-éclair Allumée Allumée Plage de spectre EM : 367 à 417 nm, pas de 1 nm EX : 330 à 380 nm, pas de 1 nm Enregistrement des spectres Tous, sans signal Tous, sans signal Long. d'onde EX 350 nm, allumée 350 nm, éteinte Long. d'onde EM 397 nm, éteinte 397 nm, allumée Paramètres multi-canaux Multi EM Multi EX Figure 65 Réglages des points de consigne spéciaux 178 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

179 Fonctions de test 8 Test de précision de la longueur d onde Figure 66 Réglages pour le balayage EM / EX 2 Chargez la méthode WLEXTEST. Le FLD bascule en mode multi-émission et effectue un balayage autour du maximum attendu, soit 397 nm ± 20 nm. Manuel d utilisation du FLD Agilent

180 8 Fonctions de test Test de précision de la longueur d onde 3 Démarrez la pompe et rincez la cuve avec de l'eau pendant quelques minutes pour vous assurer que la cuve à circulation est bien propre. Le débit doit être entre 0,5 et 1 ml/min et la ligne de base doit être stable. REMARQUE Vous pouvez retirer la cuve à circulation pour vérifier qu'elle ne contienne pas de bulles d'air. Après avoir remis en place la cuve, allumez la lampe. 4 Ouvrez le tracé de spectre en ligne et observez le maximum comme illustré à la Figure 61, page 175 (gauche). 5 Chargez la méthode WLEMTEST. Le FLD bascule en mode multi-excitation et effectue un balayage autour du maximum attendu, soit 350 nm ± 20 nm. 6 Ouvrez le tracé de spectre en ligne et observez le maximum comme illustré à la Figure 61, page 175 (droite). 180 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

181 Fonctions de test 8 Procédure de calibration en longueur d'onde Procédure de calibration en longueur d'onde Quand Lorsque demandé par l'application, ou selon le Tableau 29, page 174. Outils nécessaires Description Balance de laboratoire Pièces nécessaires Référence Description Échantillon d'étalonnage, glycogène Seringue Aiguille de seringue Filtre pour seringue, 0,45 µm, 100/pqt Raccords 1 Préparation de l échantillon étalon de glycogène. a Pour préparer 10 ml de solution étalon, il vous faut 10 mg de l échantillon de glycogène (une tolérance de ± 20 % est admise). b Introduisez la quantité d échantillon préparée dans un flacon adapté. c Ajoutez 10 ml d eau distillée dans le flacon et agitez. d Attendez 5 minutes puis agitez à nouveau. Au bout de 10 minutes, la solution est prête. 2 Préparation de la cuve à circulation. a Rincez la cuve à circulation à l eau. b Retirez le capillaire d entrée de la cuve à circulation. c Placez l aiguille sur l adaptateur de la seringue. d Aspirez environ 1,0 ml de l échantillon étalon dans la seringue. e Maintenez la seringue en position horizontale. f Retirez l aiguille. Manuel d utilisation du FLD Agilent

182 8 Fonctions de test Procédure de calibration en longueur d'onde g Mettez le filtre en place sur la seringue, puis ajustez l aiguille sur le filtre. Figure 67 Seringue avec filtre à échantillon h i Relevez la pointe de l aiguille, expulsez avec précaution environ 0,5 ml pour éliminer l air contenu dans la seringue et pour rincer l aiguille. Placez le raccord PEEK sur l extrémité de l aiguille et raccordez-le à l entrée de la cuve à circulation. REMARQUE N injectez pas la solution étalon sans le filtre à échantillon. j Injectez doucement environ 0,2 ml puis attendez environ 10 secondes et injectez encore 0,1 ml. Ceci garantit un remplissage correct de la cuve. 3 Calibration en longueur d'onde. a Lancez la calibration en longueur d onde du FLD à partir de l interface utilisateur (voir Figure 70, page 184). Agilent Lab Advisor : Calibrations ChemStation Agilent : Diagnosis > Maintenance > FLD Calibration Instant Pilot (G4208A) : Maintenance > FLD > Calibration REMARQUE En cas d'échec de la procédure de calibration en longueur d'onde, reportez-vous à la section «Wavelength Calibration Failed», page Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

183 Fonctions de test 8 Procédure de calibration en longueur d'onde b En cas de décalage, appuyez sur Yes (Lab Advisor) pour ajuster d'après les nouvelles valeurs ou Adjust et OK (ChemStation, page suivante). Cette action met l'historique à jour. Figure 68 Calibration en longueur d'onde (Agilent Lab Advisor) Manuel d utilisation du FLD Agilent

184 8 Fonctions de test Procédure de calibration en longueur d'onde Figure 69 Historique de calibration (sous Infos module dans Agilent Lab Advisor) Figure 70 Calibration en longueur d'onde (ChemStation Agilent) REMARQUE Pour consulter l historique (ChemStation), lancez une calibration en longueur d onde et abandonnez-le immédiatement. À ce stade, aucun changement n intervient au niveau de la calibration. 184 Manuel d utilisation du FLD Agilent 1260

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