ED Biologie moléculaire. E. Turpin J. Lehmann-Che 5-6 novembre 2007

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1 ED Biologie moléculaire E. Turpin J. Lehmann-Che 5-6 novembre 2007

2 PCR 1983: Kary Mullis Amplification in vitro par une méthode enzymatique d'un fragmentd'adn en présence de deux oligonucléotides spécifiques de la séquence à amplifier. Succession de 20 à 40 cycles thermiques: 1/dénaturation 2/hybridation des oligonucléotides 3/extension par une Taq DNA polymérase

3 Dénaturation (95 C) ADN cible :1 copie

4 Hybridation (50 à 60 C) Amorces ' 5' picomoles de chaque amorce: 10x10-12 x6.02x10 23 = 6.02x10 12 molécules de chaque primer

5 Extension (68 à72 C) ADN cible :2 copies : ADN Polymérase A C G T: 4 désoxyribonucléotides

6 5 3 Cycle 2 4 copies Amplicon Cycle 3 8 copies 3 5

7 Exercice: dessiner des amorces de PCR La séquence présentée est celle d une partie du gène de la β globine humaine comprenant le promoteur, l exon 1 et une partie de l intron 1. Sur cette séquence de 315 pb (paires de bases), le n 100 (A s ur le brin codant) correspond au début de la transcription, de 150 à 153 est l ATG initiateur de la traduction et le n 241 est le G de fin de l exo n 1. On veut amplifier par PCR le fragment commençant à 36 et se terminant à 302 suivant la numérotation indiquée au dessus du brin codant ) Quelles amorces seront utilisées? 2) Quels sont les différents constituants nécessaires à la réaction de PCR? 3) Quelles sont les différentes étapes d une réaction de PCR? A quoi serventelles? 4) Comment peut-on mettre en évidence le produit de PCR? 5) Quelle est la taille attendue pour le produit de PCR?

8 Région 5 du gène de la β globine humaine GTGGAGCCAC ACCCTAGGGT TGGCCAATCT ACTCCCAGGA GCAGGGAGGG CAGGAGCCAG GGCTGGGCAT AAAAGTCAGG GCAGAGCCAT CTATTGCTTA CATTTGCTTC TGACACAACT GTGTTCACTA GCAACCTCAA ACAGACACCA TGGTGCACCT GACTCCTGAG GAGAGGTCTG CCGTTACTGC CCTGTGGGGC AAGGTGAACG TGGATGAAGT TGGTGGTGAG GCCCTGGGCA GGTTGGTATC AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCATGTGGAG 310 ACAGAGAAGA CTCTT - 3

9 Correction 1/ Oligonucléotides à commander: Sens: 5 AGGA GCAGGGAGGG CAGGAG 3 Anti sens: 5 GTCTCCACATGCCCAGTTTC 3 5 -AGGA GCAGGGAGGG CAGGAGCCAG 3 -TCCT CGTCCCTCCC GTCCTCGGTC GGCTGGGCAT AAAAGTCAGG GCAGAGCCAT CTATTGCTTA CATTTGCTTC TGACACAACT CCGACCCGTA TTTTCAGTCC CGTCTCGGTA GATAACGAAT GTAAACGAAG ACTGTGTTGA GTGTTCACTA GCAACCTCAA ACAGACACCA TGGTGCACCT GACTCCTGAG GAGAGGTCTG CACAAGTGAT CGTTGGAGTT TGTCTGTGGT ACCACGTGGA CTGAGGACTC CTCTTCAGAC CCGTTACTGC CCTGTGGGGC AAGGTGAACG TGGATGAAGT TGGTGGTGAG GCCCTGGGCA GGCAATGACG GGACACCCCG TTCCACTTGC ACCTACTTCA ACCACCACTC CGGGACCCGT GGTTGGTATC AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCATGTGGAG CCAACCATAG TTCCAATGTT CTGTCCAAAT TCCTCTGGTT ATCTTTGACC CGTACACCTC AC - 3 TG - 5

10 Cinétique de la PCR Comparaison PCR en point final/ QPCR

11 Modes de détection du produit d amplification SYBR Green Sondes marquées Sondes TaqMan (sondes d hydrolyse) Sondes d hybridation

12 Principe du FRET Sonde intacte: Q absorbe l énergie de R qui n émet pas de fluorescence Lors élongation, activité 5 exonucléasique de la Taq hydrolyse la sonde Q ne peut plus absorber l énergie de R qui émet une fluorescence, proportionnelle à la quantité d ADN nouvellement synthétisée.

13 Comment passer d une fluorescence à un résultat? (1) 1/ Détermination des Ct Ct= intersection entre la courbe d amplification et la barre de seuil Bruit de fond Barre de seuil

14 Comment passer d une fluorescence à un résultat? (2) 2/ Comparaison des Ct Quantification absolue Quantification relative Résultat en nombre de copies Nécessite une courbe standard Résultat: rapport entre Ct ou par rapport au calibrateur Pas de standards mais -un contrôle endogène -un calibrateur

15 Quantification absolue (1) Y= (1+E) n X Qté de produits de PCR Qté initiale de la cible Nbre de cycles Y= 2 n X Doublement à chaque cycle

16 Quantification absolue (2)

17 Quantification relative (1) Contrôle endogène: reflet de la qté de matrice par puit doit être identique pour tous les échantillons analysés permet de normaliser les qtés de matrice indroduites Si on met 2x plus de matériel qu au départ?

18 Quantification relative (2) Les pentes des 2 gènes ne sont pas équivalentes Ici, le CT n est pas constant quelque soit la quantité de cdna À retenir: les PCR des 2 gènes (d intérêt et endogène) doivent avoir une efficience proche (donc une pente équivalente) pour pouvoir calculer des CT

19 Erreur en fonction de l Efficacité de la réaction PCR Efficacité 99% 95% 90% 85% 80% 75% 70% 1 1% 3% 5% 8% 11% 14% 18% 2 1% 5% 11% 17% 23% 31% 38% 3 2% 8% 17% 26% 37% 49% 63% 3,32 2% 9% 19% 30% 42% 56% 72% 4 2% 11% 23% 37% 52% 71% 92% ξ Ct 5 3% 13% 29% 48% 69% 95% 125% 6 3% 16% 36% 60% 88% 123% 165% 7 4% 19% 43% 73% 109% 155% 212% 8 4% 22% 51% 87% 132% 191% 267% 9 5% 26% 59% 102% 158% 233% 332% 10 5% 29% 67% 118% 187% 280% 408% Efficience de 85% pour une différence de 1 CT, l erreur est de 8%

20 Quantification de l ARNm d un gène: Q-RT-PCR Transcription Traduction ADN Gène ARN messager protéine Amplifications géniques Q PCR Amorces- sondes modifications d expression Q RT-PCR analyse du transcriptome (microarray) Présence et localisation Immunohistochimie Tissue array Anticorps Reverse transcription des ARNm cdna

21 Reverse trancription d'un ARN messager en ADN complémentaire 5 ARNm AAAAAA Hybride ARNm/ADNc 5 3 AAAAAA : Reverse transciptase Oligonucléotide: spécifique hexamers oligo(dt) 12-20

22 PCR après RT Hybride ARNm/ADNc 5 3 AAAAAA 3' 5 Dénaturation 5 3 AAAAAA Hybridation 3' 5 Extension 3' 5 PCR classique

23 Exemples d application de la Q PCR ou Q-RTPCR Détermination de la charge virale ex: HIV-1 en suivi du SIDA Détermination de l amplification d un gène QPCR ex: HER-2 dans le cancer du sein Détermination de la surexpression d un gène Q RT-PCR ex: ERα dans le cancer du sein

24 Exemples Exemple 1: -1/ Quel est l échantillon de cdna le plus concentré et combien de fois? - 2/ Quel organe exprime le plus d IL10 et combien de fois plus?

25 Correction 1 Question 1: -Le CT du gène endogène est un reflet de la quantité de cdna dans l échantillons Ici le 18S rrna est le gène endogène ou gène de ménage L échantillon le plus concentré est celui qui a le CT le plus petit donc le cerveau. -Il existe une différence de = 2 cycles entre les 2 échantillons 2 2 = 4 donc l échantillon du cerveau est 4 fois plus concentré que celui du foie Question 2: On compare les CT des 2 échantillons : l IL10 est plus exprimé dans le foie que dans le cerveau Il existe une différence de 6 CT entre les 2 échantillons donc l IL-10 est exprimé 64 fois plus dans le foie

26 Exemples Exemple 2: Une culture cellulaire subit un traitement par une drogue. On compare l expression d un gène au cours du temps après traitement. Quelle est l action de la drogue sur l expression du gène d intérêt, en fonction du temps? Expression en 2 - CT

27 Correction 2 On calcule les CT pour chaque temps: CTt 0 = =20 CTt 12 = =15 CTt 24 = 24-9 =15 CTt 48 = =20 On compare par rapport au temps T0: T12= CTt 12 - CTt 0 = =32 T24= 15-20= -5 T48= 20-20=0 Conclusion: la drogue active l expression du gène d intérêt d un facteur 32 entre 12 et 24h après administration. On constate un retour à l expression basale 48h après traitement.