CYTOMETRIE EN FLUX. BD FACSVerse. BD FACSAria III. Journée de Formation et Information 17/11/2014

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1 CYTOMETRIE EN FLUX BD FACSVerse BD FACSAria III Journée de Formation et Information 17/11/2014

2 CYTOMETRIE EN FLUX Principe Applications Tri

3 Qu est que ce la cytométrie en flux? Individuelle Quantitative Qualitative Particules en suspension Flux liquide Source lumineuse

4 CYTOMETRIE EN FLUX: Principe Fluidique Electronique Optique

5 Fluidique Injecteur Liquide de gaine Centrage hydrodynamique «Flow Laminar» Faisceau Laser

6 Paramètres CYTOMETRIE EN FLUX: Analyses Multiparamétrique SSC Fluorescence LASER FSC FSC: Forward Scatter lumière diffractée Dépend de la taille et de la surface cellulaire SSC: Side Scatter lumière réfléchie et réfractée Dépend de la granularité et de la complexité cellulaire Fluorescence : auto fluorescence, marquages avec des anticorps ou sondes spécifiques

7 Optique Collection Optics Detector arrays Fiber optics Laser Laser Laser Collection lens Lens Flow cell FSC diode Excitation optics Sample core

8 Signaux d émission du laser bleu Structure de collecte du signal: Heptagones 507 LP 527/32 FITC Blank 665 LP 700/54 PerCP-Cy LP 783/56 PE-Cy7 560 LP 586/42 PE 488/15 Side scatter

9 Fluorochromes Lasers Position PMT Fluorochromes Autres sondes (nm) et filtres (nm) 488 (bleu) A (750 à 810 nm) PE-Cy7 B (>670 nm) PerCP, PerCPCy5.5 IP, PE-Cy5.5, 7-AAD D (564 à 606 nm) PE (IP) E (515 à 545 nm) FITC GFP, Alexa 488, CFSE F (483 à 493 nm) Side Scatter (SSC) 633 (rouge) A (750 à 810 nm) APC-Cy7 APC-H7 C (650 à 670 nm) APC Alexa 633, Alexa (violet) A (502 à 535 nm) AmCyan, V500 Pacific orange B (425 à 475 nm) Pacific blue, V450 DAPI, Cascade Blue Alexa 405

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11 Système Electronique Conversion signaux optiques en signaux digitaux proportionnels Photon In Signal Out Analog to Digital Conversion Digital data to memory Voltage In PMT Power Supply Levels Volts Digitize the pulse Sample the pulse

12 Height PE Système Electronique Analyse digitale Digital data in memory Field Programmable Gate Arrays Digital Signal Processor Computer Area FITC width

13 Applications de la CMF Analyse morphologique Immunophénotypage antigènes membranaires antigènes intracellulaires Analyse du contenu en ADN Cycle cellulaire Viabilité Prolifération cellulaire Suivi de l activité génétique par l expression d un gène rapporteur (GFP) Mesure de l apoptose Phagocytose Stress Oxydative Flux ioniques Signalisation cellulaire

14 Forward Scatter: taille Analyse morphologique Granulocytes Monocytes Lymphocytes Side Scatter: granularité

15 Immunophénotypage ACM anti-cd3 ACM anti-cd4 ACM anti-cd19 ACM anti-cd14 PE FITC APC PE-Cy5 PE FITC CD3? CD19? Leucocyte FITC + PE + APC - PECy5 - CD4 + CD3 + CD19 - CD14 - CD # : Cluster de différenciation

16 Immunophénotypage CD19+ CD3- CD19+CD3+ CD19-CD3- CD19- CD3+ Lymphocytes

17 Marquage intracellulaire Perméabilisation des cellules FITC Leucocyte Production Signalisation

18 Signalisation cellulaire 1 2 Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications Peter O. Krutzik a, b, c, Jonathan M. Irish b, c, Garry P. Nolan b, c Clinical Immunology, 2004, (110) ,

19 Viabilité Cellules THP1 + Thalidomide ( # conc.) Incubation 48 HS + Iodure de Propidium Intercalant Imperméant 2.4 % 3.8 % 9.5 % 99.7 %

20 Apoptose: Mise en évidence des différentes étapes Induction: T0 Condensation T2h Fragmentation T6h Chute du potentiel membranaire mitochondrial (DiOC6) Altérations de la membrane plasmique (Annexine V) Expression des caspases, famille Bcl-2 Fragmentation DNA (TUNEL)

21 Apoptose: DiOC6 Détection des altérations de potentiel de membrane DiOC6: carbocyanines La fluorescence est modifiée selon l environnement électrique Cellules JURKAT + Camptothecin (18 HS)

22 Apoptose: Annexine V Détection des altérations de la membrane plasmique Extériorisation des phosphatidyl-sérines (PS) Annexine V: forte affinité pour résidues PS Annexine V - APC Cellules JURKAT Cellules JURKAT + camptothecin (4 HS)

23 FITC Phagocytose FITC-Labeled beads Neutrophile

24 Cycle Cellulaire Les Fluorochromes: DAPI Hoechst Chromomycine A3 Iodure de Propidium Bromure d éthidium Acridine Orange 7-ADD TO-PRO-3 Vybrant Dye Cycle Caractéristiques: Spectre de fluorescence Mode de liaison aux acides nucléiques Hydrosolubilité - Liposolubilité

25 Flux calcique : Différentiation des sous populations lymphocytaires Th 2 Th1 Sonde: Fluo-3/AM Ex-max: 506 nm Em-max: 526 nm Gergely T et al., Immunology 2012

26 Avantages de la CMF Analyse quantitative Sensibilité de détection Rapidité Analyse multiparamétrique Tri

27 TRI : Principe

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29 TRI: Principe Déflection électrostatique de gouttes chargées - Les cellules sont aspirées de l'échantillon - injectées une à une par une buse dans un courant continu (formation du jet) - Le jet se rompre pour donner des gouttes à un point précis appelé «break of point» - Chargement de goutes - Les goutes sont déviées du côté de la plaque de polarité opposée et collectée En appliquant différent niveau de charge à gauche et à droite, il est possible de trier quatre populations simultanément sur le BD FACSAria III.

30 TRI: Principe Optimisation de paramètres Taille de la buse Pression Liquide de gaine Fréquence Viabilité cellulaire Taille de la buse (µm) Pression Liquide de gaine (psi) Fréquence (KHZ) Type cellulaire Lymphocytes T non activés, Lymphocytes B, Bactéries, Levures Lymphocytes T activés, cellules plasmatiques, NK, NK-T, Monocytes, mdc, pdc, cellules souches Cellules tissulaires, Neurones, Macrophages,

31 TRI: Principe Précisions Pureté Rendement «Single Cell»

32 BD FACSAria III

33 BD FACSAria III Système Optique Lasers 375 nm 405 nm 488 nm 561 nm 633 nm

34 BD FACSAria III Système de collection Le module ACDU (automated cell deposition unit)

35 Quelques exemples Tri des lymphocytes T (CD3 +) et monocytes (CD14 +) à partir de CMN de sang périphérique Avant Tri 8.6 % 99.7 % Après Tri 54.1 % 98.0 % Après Tri

36 Quelques exemples Tri des cellules GFP + à partir de lignée transfectée Avant Tri 97 % Après Tri 31.7 % 67.9 % Après Tri 99.3 %

37 Le BD FACSAria III permet: Trier sur des microplaques de 24, 96 puits ou 384 puits, des lames ou des tubes. Trier dans des conditions de température contrôlée (4, 20, 37 et 42 C) et dans des conditions aseptiques. Trier à différentes pressions (5 à 75 psi) et avec quatre tailles de buses (70, 85, 100 et 130 µm) pour trier divers types des particules. l analyse simultanée de 18 paramètres (FSC, SSC et 16 fluorescences). l acquisition à une vitesse maximale de évènements/sec. Trier avec un maximum de pureté ou un maximum de rendement (pour une petite et précieuse population) ou un maximum de précision pour un clonage. Récupérer des cellules viables

38 Et après tri. Cellules viables Mise en culture, Etudes fonctionnelles, analyses de biologie moléculaire, protéinique, génomique, Clonage, Observation en microscopie confocal

39 Qualité des résultats optimiser, calibrer et contrôler le cytomètre Préparation de l échantillon choisir la bonne combinaison des fluorochromes inclure des contrôles appropriés Optimiser les conditions d acquisition Analyses des données Interprétation des résultats

40 CYTOMETRIE EN FLUX Informations pratiques.. Responsables et contacts Localisation Matériel Adriana Delwail Tél: Mail: Adriana. PBS secteur α Niveau 1 Salle MS Q24 Cytomètre analyseur BD FACSVerse Jean-François Jégou Tél: Mail: jean-francois.jegou@univ-poitiers.fr Cytomètre trieur BD FACSAria III