Nouveautés dans le diagnostic biologique de la tuberculose
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- Didier Sylvain
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1 Nouveautés dans le diagnostic biologique de la tuberculose Philippe Lanotte Service de Bactériologie-Virologie Pôle de Microbiologie-Infectiologie Hôpital Bretonneau CHRU de Tours Journées de Formation Médicale Continue, Faculté de Médecine, Tours - 10 septembre 2008 Absence de conflit d intérêt
2 Nombre de cas de tuberculose maladie déclarés par région, France,
3 Diagnostic tuberculose Clinique Radiologique Anatomo-pathologique Bactériologique Immunologique Intra-Dermo Reaction à la tuberculine Interféron gamma
4 Genre Mycobacterium Mycobactéries du groupe de la tuberculose -M. tuberculosis (BK, bacille de Koch) -M. africanum -M. bovis -. -M. bovis BCG M. ulcerans -ulcère de Buruli- M. leprae (bacille de Hansen) Mycobactéries non tuberculeuses (M. atypiques) - M. xenopi - M. terrae - M. kansasii - M. gordonae - M. marinum - M. abscessus - M. chelonae - M. fortuitum
5 JO Prélèvements (fluidifié/décontaminé) Culture Examen Direct (Ziehl-Neelsen) Milieu solide (Löwenstein-Jensen) J15 Milieu liquide (Middlebrook) Culture + (8-10 j) Culture + (15-21 j) M1 M2 M3 Diagnostic bactériologique
6 JO Prélèvements (fluidifié/décontaminé) Culture Test d amplification génique J15 M1 Culture + (15-21 j) Antibiogramme (1 mois) Antibiogramme (< 14 J) INH, RIF, ETH, SM, PZA Sonde moléculaire + identification d espèce par biologie moléculaire M2 M3 +/- Recherche de résistance par biologie moléculaire Diagnostic bactériologique
7 Techniques d amplification génique AVANTAGES grande sensibilité théor. grande spécificité Rapidité (4-6 heures) Identification fiable mise en évidence de mutations (résistance) LIMITES Prise d essai faible (5-10% du vol. / culture) Hétérogénéité prélèvements Sensibilité < culture Validé pour le respiratoire pas de prédiction / viabilité des bactéries faux négatifs/ faux positifs coût (B 250) Diagnostic bactériologique
8 Hypersensibilité retardée à la tuberculine Réponse Mémoire aux antigènes mycobactériens - La tuberculine : le plus vieux des antigènes mycobactériens - Koch s old tuberculine, 1891 concentré de culture inactivé par la chaleur - Tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) concentré de culture en milieu sans protéines, soniqué, filtré, lots non standardisés >200 Ag partagés entre M. tuberculosis, M. bovis, BCG, certaines M. atypiques Présentation d ag mycobactériens Mesure inflammation et induration - IDR : peu sensible chez enfants < 5 ans, immunodéprimés ) - interprétation difficile chez le sujet vacciné Diagnostic immunologique
9 Hypothèse phylogénique de l évolution des mycobactéries du complexe de la tuberculose RD = Régions de Différence (Brosch et al, PNAS, 2002)
10 Génomique comparative Gènes absents chez des souches atténuées, comme le BCG RD6 PPEPPE PPE kb RD8 eph Rv3618 lpq kb A G RD1 Rv3871PE/PPERv3874esat6Rv3876 Rv3877 Rv kb alr Rv3424 IS15 32 RD12 moe cys3 Rv3120/21/22/23 Rv kb B A ssecmoa E RD11 (phirv2) RD5 (mpt40) Rv3430 Rv 2345 IS kb Rv 2346/47/48plcC plcb plca PPE PPE Rv3616 gly cys val Rv2645/46/ IS6110 T 2969 T U kb 2 Rv2644valT Rv2650/51Rv2652/53/54Rv2655/56/57/58/59/60/61 Rv3619/20PPE PE oric Mycobacterium bovis BCG Pasteur 1173 P2 RD10 Rv0221echA kb Rv0223Rv0224 RD13 dea Rv kb D 4 Rv12 55 RD4 RD3 (phirv1) Rv3879 Rv3880/81 Rv1256 Rv1257 Rv1258 Rv1509Rv1510gmdA epia Rv1513 Rv kb Rv1505/06/07 Rv1508 Rv1514/15 Rv1516 bio Rv1573/74/75 biob kb D 1778Rv1571 RD9 Rv kb cobmcoblrv2073 Rv2075/76 Régions de différence RD7 RD2 REP Rv1576/77/78Rv1579/80/81 Rv1582/83/84/85 / 86 REP Rv1766/ PE_PG Rv176 Rv177 Rv177 Rv177 Rv kb 67 RS Rv176 5 IS9 RD14 Rv177 3 Rv1964Rv1965mce3 Rv1967Rv1968Rv1969lprM Rv1971/72/73/74/75 Rv1977 Rv1978 PE-PGRS Rv1986Rv1987/ kb Rv1963 Rv1976 Rv1979mpt64 nrdfrv1982 Rv1984 Rv1985 Rv1989 Mahairas et al., 1996, J. Bact. Gordon SV et al., 1999, Mol. Microbiol. Behr M et al., 1999, Science
11 Région RD1 RD1 mic RD1 BCG Rv3860 Rv3866Rv3868 Rv3869 PE/PPE Rv3876 Rv3864/65 esx Rv3861Rv3863 Rv3867 Rv3870 Rv3871 Rv3874 Rv3877Rv Rv3862 Rv3879 Rv3884 Rv3885 Rv3880 Rv3882 Rv3886 Rv3881 Rv3883 Rv3887 Brodin P et al., 2002, Infect Immun. ESAT-6 CFP-10 Culture Filtrate Protein from M tuberculosis Early Secreted Antigenic Target from M tuberculosis = Antigènes immunodominants pour lymphocytes T
12 Les nouveaux tests immunologiques de la tuberculose Alternatives in vitro à l IDR : mesure de l IFNγ secrété par les cellules T en réponse à une stimulation par des antigènes spécifiques Sang total ou CMNS Incubation O/N ou 48h Ag M. tuberculosis ESAT 6, CFP10 4 indications retenues actuellement par l HAS : - Enquête autour d un cas - Embauche et suivi des professionnels de santé - Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de tuberculose maladie complexes - Avant mise sous traitement par anti-tnfα ELISA Sécrétion IFNγ T mémoires mesure IFNγ ELISpot IFNγ pg/ml SFC/10 6
13 Les nouveaux tests immunologiques de la tuberculose disponibles dans le commerce, approuvés par la FDA, marquage CE Antigènes : ESAT-6, CFP10 (RD1), peptides Quanti-FERON-TB Gold in-tube (Cellestis Limited, Canergie, Australia) T SPOT-TB (Oxford Immunotech, Oxford, UK) Avantages par rapport à l IDR : - Pas de seconde visite, résultats en heures - Pas de stimulation in vivo des réponses immunes (effet «booster» IDR) - Reproductibilité test et réactifs - validité chez VIH + (adaptation à la numération lymphocytaire) - Résultat objectif - Contrôle + : mitogène (met en évidence des faux négatifs) - Spécificité +++ : populations BCG+, infectées par Mycobactéries atypiques Inconvénients -Conditions réalisations strictes -Coût (hors NABM): 75
14 Conclusion Techniques moléculaires permettent un gain de temps à partir du prélèvement ou de la culture dans l identification de la mycobactérie dans la prédiction de la résistance à certains antituberculeux Très bonne sensibilité si examen direct positif Ne pas utiliser si faible suspicion de tuberculose Culture reste indispensable en particulier pour tester la sensibilité à des tuberculeux de 1 ère et 2 ème ligne pour comparer les souches bactériennes entre elles Remplacement à terme l IDR par le dosage de l Interféron gamma? Importance du dialogue clinicien/bactériologiste Merci de votre attention
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