Apport de la cytométrie multicouleurs pour l étude des cellules. souches

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1 Apport de la cytométrie multicouleurs pour l étude des cellules souches Jérôme MOREAUX Ins2tut de Recherche en Biothérapie INSERM U 847 Pr Bernard KLEIN CHU de Montpellier

2 La cytométrie en flux - Méthode d analyse des cellules en suspension - Permet de discriminer au sein d un échantillon des sous populations homogènes par leurs: Taille, Structure et expression des antigènes membranaires, intra-cytoplasmiques et/ou intranucléaires. (anticorps monoclonaux couplés à des fluochromes )

3 La cytométrie en flux La cytométrie en flux est définie comme l étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. Elle permet une caractérisation : Individuelle, Quantitative, Qualitative de la cellule

4 La cytométrie en flux Pour fonctionner un cytométre en flux nécessite une combinaison de: Fluidique: Pour introduire et canaliser les cellules, Optique: Une source d excitation et de récupération des signaux, Electronique: Pour convertir les signaux optiques en des signaux électroniques proportionnels et les numériser pour les analyser avec un ordinateur.

5 Les cellules doivent être mises en suspension SEUIL POPULATION HETEROGENE Informatique TRAITEMENT DES DONNEES Les cellules sont conduites au centre de la buse par un système de centrage hydrodynamique LASER ANALYSES QUANTITATIVES DES SIGNAUX LUMINEUX COMPTAGE DECISION DE TRI Les cellules sont excitées une par une par le faisceau lumineux Les signaux op2ques émis par les cellules sont analysés et conver2s en signaux électriques traités par l informa2que

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9 La cytométrie en flux FORWARD SCATTER (Diffusion aux petits angles) La lumière diffractée est collectée sous un petit angle (compris entre 1 et 10 degrés), Le signal est relatif à la taille de la cellule. SIDE SCATTER (Diffusion aux grands angles) La lumière diffractée est collectée à 90 de l axe du laser, Le signal est relatif à la granularité et la complexité cellulaire.

10 MONOCYTES GRANULOCYTES LYMPHOCYTES Figure 8: Utilisation de la double diffusion de la lumière pour distinguer les diverses sous populations sanguines (FSC: diffusion aux petits angles, SSC diffusion aux grands angles).

11 La fluorescence - Le fluorochrome absorbe l énergie du Laser - Le fluorochrome réemet l énergie absorbée par: - Vibra9on et dissipa9on de chaleur - Emission de photons d une longueur d onde plus élevée

12 Laser Spectre d absorp2on Spectre d émission

13 La fluorescence

14 COLORANT LIAISON/FONCTION l EX.* l EM.@ Hoechst ADN (bases A-T) DAPI ADN (bases A-T) Iodure de Propidium ADN (intercalant) 370, Bromure dʼethidium ADN (intercalant) 370, Acridine Orange ARN/ADN 492/ /630 Alexa 430 conjugaison FITC conjugaison PE conjugaison PerCP conjugaison APC conjugaison PerCP/Cy5.5 conjugaison Cy5.5 conjugaison APC/Cy7 Protéines Rhodamine 123 potentiel mitochondrial BCECF-AM ph SNARF-1 PH/traceur /630 Cascade blue traceur Fura Red Ca INDO-1-AM Ca /480 Fluo-3 Ca Caractéristiques des principaux fluorochromes utilisés en cytométrie. (*: longueur d onde d longueur d onde d émission).

15 La fluorescence

16 La fluorescence Recouvrement entre les spectres Pourcentage de contamination d un fluorochrome par un autre.

17 La fluorescence Compensation Permet d attribuer à chaque détecteur un colorant et non une couleur en soustrayant un pourcentage du signal identifié par un PMT aux autres PMT.

18 Les cellules souches Autorenouvellement Différencia9on

19 Les cellules souches To2potence : capable de générer un être vivant mul2cellulaire Pluripotence : capable de donner naissance aux cellules issues des 3 feuillets embryonnaires Mul2potence : capable de donner naissance à plusieurs types cellulaires mais déjà engagées dans une direc2on

20 Enjeux en médecine - Médecine régénératrice : Thérapie cellulaire basée sur les cellules souches pour régénérer des tissus malades ou des organes. - Greffe : Greffe de cellules souches hématopoïétiques (HSC) - Recherche : Les cellules souches embryonnaires sont utilisée pour tester des nouvelles drogues (Toxicité) et comprendre comment les facteurs génétiques ou environnementaux interagissent pour perturber le développement normal et causer des anomalies congénitales

21 La cytométrie multi-couleurs et les cellules souches - Permet d identifier et de séparer individuellement chaque cellule - L identification et la quantification de populations différentes phénotypiquement est essentielle pour la recherche sur les cellules souches - Purification de populations rares de cellules souches à partir d une suspension cellulaire hétérogène. - Nombreuses applications en recherche : Etude du cycle cellulaire, de l apoptose, caratérisation phénotypique. - Applications cliniques

22 Tri cellulaire des cellules souches - Permet d iden2fier et d isoler les cellules souches dans une mélange de popula2ons cellulaires - Les cellules souches peuvent être purifiées pour expansion clonale, culture cellulaire, étude de l expression génique ou des expériences in vivo chez l animal - Par rapport aux techniques de sépara2on par billes magné2ques, la cytométrie permet, pour chaque cellule, une analyse de plusieurs paramètres

23 La cytométrie multi-couleurs et les cellules souches - Tri d une seule cellule par puits dans des plaques de 96 ou 364 puits. - U9lisé pour l obten9on de nouvelles lignées

24 La cytométrie multi-couleurs et les cellules souches ips

25 La cytométrie multi-couleurs et les cellules souches hes ImageStream : Technologie permettant d obtenir une image avec une résolution comparable à celle obtenue en microscopie avec un objectif 40X 60X mais par cytométrie de flux

26 La cytométrie multi-couleurs et les cellules souches Kits disponibles : - Purification des cellules souches Emb sur l expression de SSEA-3, TRA-1-81 et SSEA-1. - Analyse de l expression des facteurs de transcription pour les ES et les IPS. Expression simultanée de Nanog, Oct3/4 et Sox2

27 HSC Cellule souche lymphoïde Cellule souche myéloïde

28 HSC et autogreffe - Autogreffe : Greffe de ses propres cellules souches hématopoïétiques - Indications : - Myélome Multiple : Au diagnostic. - Lymphome avec un mauvais pronostic ou en rechute. - LAM avec mauvais pronostic sans donneurs pour allogreffe

29 HSC et autogreffe - HSC - Lymphocytes T Reconstitution hématopoïétique

30 HSC et autogreffe - Réservoir des HSC : Moelle osseuse (et sang de cordon). - Mobilisation : - Induire les HSC à circuler dans le sang périphérique : G-CSF (Granulocyte colonystimulating factor), AMD3100.

31 HSC et autogreffe Chimio intensive Aplasie et recons9tu9on Chimiothérapie de réduc2on tumorale Réinjec2on Cytaphérèse Collecte HSC Congéla2on

32 HSC et autogreffe - Contrôle qualité et numéra9on des HSC avant congéla9on Marqueur de viabilité CD45 + leucocytes CD34 + HSC Objec9f : 4 Millions de HSC / kg à réinjecter au pa9ent. Congéla9on

33 HSC et autogreffe - Méthode de référence de la société interna9onale de Thérapie cellulaire (ISCT) Marqueur de viabilité CD45 + leucocytes CD34 + HSC Des kits commerciaux validé par les agences réglementaires existent et sont distribués par BD et Beckman Coulter

34 HSC et allogreffe - Allogreffe : Greffe des cellules souches hématopoïétiques et des lymphocytes T d un donneur - Indications : - Leucémies myéloïdes - Myélome Multiple

35 HSC et allogreffe - HSC - Lymphocytes T - Reconstitution à partir des HSC du donneur - Les lymphocytes T du donneur vont détruire les cellules tumorales du receveur Donneur identique ou compatible (HLA)

36 HSC et allogreffe Chimio modérée Chimiothérapie de réduc2on tumorale Injec2on Donneur collecte

37 HSC et allogreffe - Contrôle qualité et numéra9on des HSC Marqueur de viabilité CD45 + leucocytes CD34 + HSC Objec9f : 4 Millions de HSC / kg à réinjecter au pa9ent. Réinjec9on

38 HSC et allogreffe - Contrôle qualité et numéra9on des lymphocytes T (CD3) Si assez de cellules : congélation possible de DLI (donor lymphocyte infusion)

39 DLI - Rechute après allogreffe ou absence de réponse complète : Réinjection de DLIs seuls ou associés à une chimiothérapie - Cytométrie : - Intérêt de la cytométrie multi-couleurs pour le calcul de la quantité de lymphocytes T viables à réinjecter dans le DLI

40 DLI et Myélome Multiple

41 DLI et Myélome Multiple

42 DLI et LMC

43 Side population

44 Side population le groupe de R. Mulligan a u2lisé le colorant fluorescent vital Hoechst 33342, se fixant spécifiquement aux molécules d'adn. Basé sur la rela2on existant entre niveau du cycle cellulaire et contenu en ADN d'une cellule, le colorant Hoechst permet en effet d'isoler des popula2ons cellulaires selon leur niveau de proliféra2on (Go/G1). U2lisant ceie stratégie, Goodell et al. ont mis en évidence chez la souris une popula2on de cellules appelée Side popula-on (SP), capable de recons2tuer l'hématopoïèse à long terme de souris syngéniques létalement irradiées. Ceie popula2on SP est caractérisée par une grande capacité d'efflux du colorant Hoechst

45 Side population Capable de reconstituer l'hématopoïèse à long terme de souris syngéniques létalement irradiées

46 Cellules souches mésenchymateuses Cellules souches mul9potentes

47 Cellules souches mésenchymateuses - Utilisation en thérapie cellulaire : Cellules souches mésenchymateuses et réparation tissulaire Les caractéristiques multipotentes des cellules souches mésenchymateuses ouvrent la voie au domaine de la réparation tissulaire, en orthopédie pour la reconstruction osseuse et cartilagineuse, en chirurgie plastique reconstructive pour le tissu adipocytaire, en cardiologie pour la réparation du tissu musculaire myocardique après un infarctus, en neurologie pour la réparation de tissu cérébral après une ischémie cérébrale.

48 Cellules souches mésenchymateuses - Utilisation en thérapie cellulaire : Cellules souches mésenchymateuses et greffe de cellules souches hématopoïétiques autologues et allogéniques En clinique, les cellules souches mésenchymateuses combinées à une greffe de cellules souches hématopoïétiques pourraient réduire la durée d'aplasie postgreffe en accélérant la reconstitution hématopoïétique, réduire le risque d'échec de greffe et réduire le risque de réaction aiguë du greffon contre l'hôte dans les allogreffes. Compte tenu de l'absence d'alloréactivité des cellules souches mésenchymateuses et des difficultés qu'il existe à obtenir des cellules souches mésenchymateuses autologues chez des patients antérieurement soumis à des chimiothérapies délétères pour le microenvironnement, les essais cliniques actuels se font avec des cellules souches mésenchymateuses allogéniques.

49 Cellules souches mésenchymateuses - Obtention de cellules souches mésenchymateuses : - Méthode par adhérence = Méthode de référence - Cette méthode a cependant des inconvénients qui sont la possibilité de prédifférenciation des CSM in vitro et le coût de la culture - Sélection par cytométrie en flux

50 Cellules souches mésenchymateuses Phénotype des MSC: Absence d un antigène spécifique Identification possible sur la base de plusieurs marqueurs

51 Iden9fica9on possible en u9lisant un seul tube avec 7 marqueurs CD71+, CD105+, CD184+, CD34-, CD133-, CD45- et CD44+

52 Cellules souches mésenchymateuses - Avantages de cette méthode de sélection : - Pas de prédifférenciation des CSM in vitro - Caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles originelles conservées

53 Cellules souches cancéreuses Identifier et caractériser la cellule souche cancéreuse Importance clinique: - Cellule souche cancéreuse résistante aux chimiothérapies conventionnelles - Mesure du résultat du traitement en étudiant la fréquence, la localisation et les signatures géniques des cellules souches cancéreuses Nouvelles thérapies ciblant les cellule souche cancéreuse ont un grand intérêt

54 Cellules souches cancéreuses Exemple du Myélome Multiple malignant plasma cells

55 Myélome Multiple Homing Survie et proliféra2on SDF- 1 Chimiokines CXCR4 Cellule de MM IL- 6 Facteurs de croissance Cellules stromales Lésions osseuses Vaisseaux sanguins ostéoblastes OS ostéoclastes

56 Cellules souches cancéreuses Exemple du Myélome Multiple Moelle osseuse malignant plasma cells Sang 10 plasmocytes / mm3 MAUVAIS PRONOSTIC

57 Cellules souches cancéreuses Exemple du Myélome Multiple Lien entre les cellules plasmocytaires circulantes et le pronostic: - Cellules souches myélomateuses? - Progéniteurs myélomateux? - Fonction dans la pathologie?

58 Cytométrie multi-couleurs λ light chain CD138 CD20 CD38 K light chain CD38 CD19 CD45 λ light chain λ light chain λ light chain λ light chain CD27 CD56 CD117 CD200 Identification des cellules tumorales au sein des plasmocytes normaux

59 Cellules souches cancéreuses Exemple du Myélome Multiple Lien entre les cellules plasmocytaires circulantes et le pronostic: - Phénotype des plasmocytes tumoraux circulants / plasmocytes tumoraux médullaires - GEP des plasmocytes tumoraux circulants / plasmocytes tumoraux médullaires - Compréhension de la biologie du MM

60 Cytométrie multi-couleurs en pratique Multi-couleurs ne veut pas dire «utilisez toutes les couleurs que vous pourrez» Sélection des couleurs appropriées pour vos expériences: - De quels lasers puis je disposer? - Quels fluorochromes dois je utiliser?

61 Cytométrie multi-couleurs en pratique

62 Cytométrie multi-couleurs en pratique S assurer que vous disposer des lasers corrects pour exciter vos fluorochromes et que vous disposez des filtres adéquats. Réaliser la matrice de compensation pour votre combinaison d anticorps. Attention à la superposition des spectres d émission des fluorochromes utilisés.

63 Cytométrie multi-couleurs : Perspectives Utilisation de Quantum Dots, nanocristaux au large spectre d absorption qui vont émettre à différentes longueurs d ondes en fonction de leur taille. Utilisation de Quantum Dots, nanocristaux en tant que sondes fluorescentes

64 Merci de votre attention