VIRUS DE L'HEPATITE C

VIRUS DE L'HEPATITE C Le virus de l hépatite C a été identifié à la fin des années 1980 comme l agent responsable de la plupart des hépatites " non-a, non-b ". La prévalence de l injection par le VHC dans la population générale est estimée à 1,2% en France (1). L ampleur de la population infectée et le risque d évolution grave de la maladie en 10 ou 20 ans, font du VHC un enjeu d ordre public. Structure du Virus de l Hépatite C et mode de réplication : Même si des imprécisions sont toujours présentes en ce qui concerne la structure du VHC, son mécanisme de réplication et son tropisme cellulaire, il est toutefois possible de caractériser le VHC ainsi : Structure moléculaire du Virus de l'hépatite C : Le VHC est un virus enveloppé, de 55 à 65 nm de diamètre, présentant une capside icosaédrique. Son génome est constitué par une molécule d ARN simple brin, à polarité positive, d environ 9400 nucléotides comportant un seul cadre de lecture ouvert. Ce dernier code pour un précurseur polyprotéique de 3010 à 3030 acides-aminés selon les isolats. Le cadre de lecture est précédé en 5 d une région non codante de 324 à 341 nucléotides (cette région représente la partie la plus conservée du génome dans différents isolats du VHC) et également suivi en 3, d une courte séquence non traduite de 27 à 55 nucléotides. Chez certains isolats, on peut aussi y trouver une queue poly(a) ou poly(u). (2) Le clivage du précurseur polyprotéique est effectué par des protéases d origine cellulaire ou virale. Brièvement, il est intéressant de localiser certains gènes et d en connaître leurs fonctions (figure 1). La région codante du génome comprend de l extrémité 5 à l extrémité 3 : des gènes (C, E1, E2) codant pour les protéines structurales et des gènes (NS2, NS3, NS4 a et b, NS5 a et b) codant pour des protéines non structurales. Les protéines non structurales, dont le rôle est encore imprécis, seraient impliquées dans la réplication virale, en particulier : Le gène NS5 code pour une ARN polymérase ARN dépendante, Le gène NS3 pour une hélicase et surtout une sérine-protéinase qui clive le précurseur polypeptidique au niveau des jonctions NS3/NS4 et NS4/NS5, Le gêne NS2 coderait pour une métallo-protéinase zinc-dépendante, qui cliverait le précurseur entre NS2 et NS3. Les protéases cellulaires seraient impliquées dans le clivage de l extrémité N-terminale de E1, E2 et peut être NS2. La réplication du Virus de l Hépatite C : Jusqu à lors, aucun ADN intermédiaire de la réplication, susceptible de s intégrer dans le génome de la cellule hôte, n a été détecté. Après pénétration du virus dans la cellule cible, puis décapsidation, la précurseur polyprotéique serait synthétisé par les ribosomes cellulaires, directement à partir de l ARN du VHC, puis serait clivé pour donner les différentes protéines d informations virales : les protéines de capside, les protéases (qui vont s exciser par autoclivage catalytique) et l ARN polymérase ARN dépendante. La réplication de l ARN génomique se ferait grâce à la synthèse, par l ARN polymérase, de brins à polarité négative, appelés "brins négatifs ", complémentaires de l ARN viral. Ces brins

néosynthétisés servent de matrice pour la synthèse de nouvelles molécules d ARN virales à polarité positive, qui sont à leur tour, soit traduites, soit utilisées en tant qu ARN génomique pour les particules virales nouvellement synthétisées. (2) Le tropisme du Virus de l Hépatite C : En plus du dépistage habituel du génome viral dans les hépatocytes, des séquences d ARN du VHC ont été également détectées dans les cellules mononuclées du sang périphérique. Certaines études ont montré que le virus pourrait infecter à la fois les lymphocytes T et B, ainsi que la lignée monocytaire.(3) Classification du Virus de l Hépatite C et variabilité génétique : En ce qui concerne l organisation génétique du VHC, de nombreuses analogies sont mises en évidence avec les familles de Pestivirus et de Flavivirus. C est pourquoi le VHC est classé dans le groupe des Flaviviridae, mais il représente toutefois une famille bien distincte. En tant que virus à ARN, le virus de l hépatite C a une variabilité génétique importante (environ 10-3 substitution par an). C est lors de la réplication par l ARN polymérase ARN dépendante que se font ces erreurs d incorporation. Notons cependant que l importance de cette variabilité génétique varie suivant les régions du génome viral. Ainsi, il est utile de remarquer que la région 5 est très fortement conservée parmi les différents types d ARN VHC, bien que l on puisse identifier un petit nombre de mutations dans ce domaine. (3) A un degré plus faible, la région codant pour la capside est également bien conservée parmi les différents isolats. Cependant, on note l existence d un domaine hypervariable, situé dans la région N-terminale de la protéine d enveloppe E2. Du fait du très grand nombre de séquences, une classification relativement standardisée a pu être mise en place. Les régions utilisées pour ces classifications sont essentiellement celles codant pour les protéines NS5 b, E1 et les protéines de capside. La valeur de ces classifications est basée sur l absence actuelle de données montrant une recombinaison entre différents types de VHC. Suivant le degrés de divergence des séquences nucléotidiques, on distingue des génotypes et des sous-types. Les génotypes sont caractérisés par une divergence supérieure à 30% et différente molécules d ARN VHC sont inclues dans un même génotype si leurs séquences diffèrent de moins de 15%. Actuellement, 6 types et 12 sous-types ont pu être individualisés, notamment : TYPES 1 2 3 4 SOUS-TYPES 1a, 1b 2a, 2b, 2c 3a, 3b 4a Aspects cliniques, évolution de l hépatite virale C et traitements disponibles: Avant de préciser succinctement les différents stades des lésions hépatiques observés lors d une infection au VHC, il est important de rappeler les principaux facteurs de contamination du VHC :

La contamination se fait principalement lors d un contact direct avec le sang infecté par le VHC. Les données épidémiologiques se sont accrues, surtout par la transfusion avant 1991 de produits sanguins, l usage de drogues (par voie intraveineuse ou même nasale). Les modes de contamination résultant d une exposition professionnelle ou dus à des rapports sexuels sont beaucoup plus rares. Il est aussi important de remarquer que les infections nosocomiales pourraient être à l origine de 15% des cas d hépatites C en France (1). Les aspects cliniques et l évolution de l hépatite C : Il y a, au cours des différents stades du développement des lésions hépatiques, persistance à long terme de la multiplication virale. L hépatite aiguë, le plus souvent asymptomatiques, évolue spontanément dans 20 à 30% des cas vers la guérison mais dans 70 à 80% vers la chronicité. En cas d hépatite chronique C, il y a une élévation de l activité sérique des aminotransférases ALAT et ASAT, issues de la cytolyse du foie. Remarque : alanine + " -cétoglutarate ALAT èpyruvate + glutamate aspartate + " -cétoglutarate ASAT èoxaloacétate + glutamate L évolution de l hépatite chronique C reste mal connue; cependant, elle est relativement lente : un délai de 16 ans semble requis pour développer une cirrhose ; malgré tout, ce laps de temps dépend de nombreux facteurs. De plus, il est important de souligner l existence de patients appelés " porteurs asymptomatiques " qui ne présentent ni symptômes cliniques, ni anomalies des amino-tranférases, mais qui sont effectivement porteurs de l ARN virale dans le sérum. L évolution à long terme de cette infection chronique asymptomatique reste encore inconnue. Enfin, apparaît le stade ultime de l évolution de l hépatite C : le carcinome hépatocellulaire, qui survient habituellement après 20 à 30 ans d évolution de la maladie hépatique sur une cirrhose préexistante.(4) Les facteurs influençant l évolution de l Hépatite chronique C : Une progression plus rapide de l hépatopathie, sans influence de génotypes, semble liée au sexe masculin, à la consommation d alcool et à l âge au moment de la contamination. De plus chez les malades co-infectés par le virus de l hépatite B, il y a une plus forte proportion de cirrhoses et de carcinomes hépatocellulaires. De même, chez les malades co-infectés par le VIH, il existe habituellement une forte multiplication virale C, et pour certains, une plus grande fréquence de cirrhoses. Les traitements actuels : Un seul médicament a obtenu aujourd hui une autorisation de mise sur le marché en France dans le traitement de l hépatite chronique à VHC ; il s agit de l interféron alpha. D autres traitements sont en cours d évaluation, en association avec l interféron alpha, comme par exemple : - un antiviral : la ribavirine - ou des traitements non antiviraux. Pour les raisons évoquées précédemment, il est évident que toute détection d une infection au VHC doit être effectuée dès qu une probable hépatopathie est diagnostiquée et ce, afin de prescrire un traitement dans les plus brefs délais.

Tout d abord, au laboratoire Defrance de Neufchâtel-en-Bray, le sérodiagnostic de dépistage des anticorps anti-vhc est effectué par une méthode immuno-enzymatique (ELISA), réalisée par un automate, vu le grand nombre de sérums à analyser quotidiennement. Cependant, outre le fait que ce dépistage ne soit que trois semaines après la probable contamination (temps nécessaire pour obtenir la séroconversion), cette méthode laisse apparaître de faux négatifs. C est pourquoi, afin d obtenir une sensibilité et une spécificité maximale et de détecter le plus tôt possible toute infection par le VHC, le laboratoire Defrance de Forges-les-Eaux a envisagé la mise en place du protocole de détection par PCR de l ARN du VHC, proposé par Roche Diagnostic Systems. En faisant référence au Journal Officiel de la République Française du 12 août 1997, la détection qualitative du génome viral (ARN) du VHC est limitée aux situations suivantes : 1 ) En cas de sérologie VHC positive, pour : - un bilan pré-thérapeutique et une évaluation de l efficacité de la thérapeutique, - un diagnostique de l infection chez un enfant né de mère infectée par le VHC, - une mise en évidence d une réplication virale chez des personnes ayant des transaminases normales de façon répétée, l imputabilité du VHC au cours d une hépatopathie ayant plusieurs causes possibles ; 2 ) En cas de sérologie VHC négative ou discordante, lors : - d une hépatopathie aiguë d étiologie indéterminée après élimination des causes possibles d hépatites (virales, médicamenteuses et métaboliques), - d une exploration d une maladie systémique pouvant être associée au VHC, - d un diagnostic précoce d un risque de contamination après piqûre lors d un prélèvement biologique ou d une injection (si le sujet contaminant est infecté par le VHC ou a un statut sérologique inconnu). Grâce à la sensibilité et à la spécificité de la PCR, nous pourrons donc infirmer ou confirmer les conclusions quant à la potentielle infection au VHC. RECHERCHE de L'ARN du VIRUS DE L'HEPATITE C par Virginie Saillour La mise en place au laboratoire du protocole de détection du VHC par PCR utilisant la trousse Amplicor HCV, mise au point par Roche Diagnostic Systems, a été menée à bien en respectant une organisation logique de travail établie de la manière suivante : - participer à une journée de formation pratique chez Roche Diagnostics, - établir un bilan du matériel déjà présent au laboratoire et commander celui manquant et les réactifs

nécessaires après avoir comparés les tarifs proposés par plusieurs fournisseurs, - réceptionner le matériel commandé en ayant pris soin de vérifier son bon état, - organiser les paillasses, installer le matériel et rédiger pour chaque nouvel appareil une procédure d utilisation, - collecter les sérums déterminés HCV positifs par ELISA, - exécuter le mode opératoire sur plusieurs séries d essais en optimisant celui-ci à chaque étape afin de valider les résultats, - déterminer le coût d un test pour un patient. LA MISE EN PLACE DU PROTOCOLE DANS LE LABORATOIRE Afin de mettre en place le protocole de détection du VHC par PCR utilisant les kits HCV Amplicor, une journée de formation pratique chez Roche Diagnostics a été nécessaire. Au cours de ce stage, tout d abord, le principe de la PCR a été brièvement rappelé ; ensuite, chaque stagiaire a appliqué, dans le laboratoire Roche à Neuilly sur Seine, le protocole de détection HCV Amplicor élaboré et mis au point par Roche Diagnostic System, en ayant pris soin de noter les recommandations pratiques. Ce sont ces remarques, importantes du point de vue pratique, qu il a justement fallu mettre en application avec rigueur au laboratoire Defrance, car se sont elles qui participent à la validation du test. Le test Amplicor du Virus de l Hépatite C : But : Le test Amplicor HCV est un test qualitatif de diagnostic in vitro qui permet de déceler la présence du génome HCV (ARN) dans les échantillons de sérums humains. Principe du test : Ce test met en œuvre : à une rétrotranscription de l ARN cible qui produit un ADNc à puis une amplification de cet ADNc par PCR. La détection s effectue ensuite par hybridation des produits amplifiés à des sondes spécifiques. Dans ce test, il y a donc 5 opérations principales : 1. extraction des ARN de l échantillon 2. rétrotranscription de l ARN cible en ADNc 3. amplification de l ADNc par PCR à l aide d amorces complémentaires, spécifiques du VHC 4. hybridation des produits amplifiés avec des sondes oligonucléotidiques, spécifiques de la cible 5. détection des produits amplifiés hybridés à la sonde de détection par détermination colorimétrique. Afin de détecter le moindre ARN viral dans un échantillon, on amplifie une séquence hautement conservée et spécifique du VHC (pour n importe quel isolat ) et ce, pour obtenir un grand nombre

de copies de cette séquence. On amplifie donc la partie 5 non codante de l ARN du VHC. Pour amplifier cette petite portion du génome viral (de 250 nucléotides), il est donc necessaire de transcrire tout d abord l ARN en ADNc par la rtth DNA polymérase. Pour cela, les échantillons extraits sont ajoutés au mélange d amplification dans des tubes ou s effectuent la rétrotranscription et l amplification par PCR (annexe 1). la rétrotranscription : L amorce antisens (KY 78) est biotinylée à l extrèmité 5 ; l amorce sens (KY 80) n est pas biotinylée. Le mélange réactionnel est chauffé pour permettre à l amorce antisens de s hybrider spécifiquement à l ARN cible du VHC et à l ARN cible du CI VHC. En présence d un excès de d NTPs, la rtth DNA polymérase allonge l amorce hybridée, permettant d obtenir un produit double brin hybride : ARN/ADNc. La PCR est une réaction d amplification qui ne peut se faire qu à partir d un ADN double brin. A partir de l hybride ARN/ADNc, s impose alors une nouvelle étape de dénaturation à 95 C ; ensuite lors d un refroidissement, l amorce sens KY 80 vient s hybrider avec l ADNc simple brin, puis à 60 C, s effectue la polymérisation d un nouveau brin d ADN, par la rtth DNA polymérase. Utilisant l ADNc double brin comme matériel initial afin d obtenir un grand nombre d amplicons de la partie 5 du génome du VHC, on réalise successivement : - une étape de dénaturation des 2 brins d ADNc, - une étape d hybridation entre les amorces KY 78 et KY 80 et un brin d ADNc (on a donc une hybridation ADNc simple brin/amorce), - une étape de polymérisation par la rtth DNA Polymérase.

Ces 3 étapes constituent un cycle de PCR. On effectue 38 cycles de PCR et le nombre de d amplicons est doublé à chaque cycle. C est grâce au thermocycleur que s effectue automatiquement la PCR. En effet, à chacune des étapes d un cycle de PCR correspond une température de dénaturation : 90 C d hybridation : entre 90 C et 60 C et de polymérisation : 60 C Le thermocycleur permet de programmer ces températures ainsi que la durée de ces dernières. Remarque : C est en utilisant une enzyme thermostable (la rtth DNA Polymérase) que l on peut effectuer les étapes de dénaturation (90 C) et d hybridation (90 C à 60 C) sans que cette enzyme de polymérisation soit dénaturée. La thermostabilité de cette enzyme est donc necessaire pour établir l automatisation de la méthode d'amplification et enchaîner ainsi tous les cycles de PCR. Aussi, au cours du processus d amplification, des substances inhibitrices de la rtth DNA polymérase peuvent être présentes dans l échantillon clinique, et empêcher alors toutes amplifications.un standard interne du VHC a donc été ajouté au test Amplicor HCV pour qu il assure la validité des résultats négatifs de ce test. Ce standard est un ARN produit par transcription in vitro ; il possède des sites d hybridation aux amorces identiques à ceux de l ARN du VHC, ainsi qu une séquence interne randomisée, de même longueur et de même pourcentage en CG. Enfin, il possède un site spécifique de liaison à la sonde de détection, permettant alors une détection différentielle entre les amplicons du CI et ceux du VHC. Etant introduit systématiquement dans le diluant d échantillon, l ARN du CI est co-amplifié avec l ARN cible de l échantillon clinique. Matériel et méthode : Organisation des paillasses : Afin d éviter que des amplicons ne viennent contaminer les futurs échantillons (ce qui révèlerait de faux positifs), il est indispensable de travailler par zone. Nous avons à distinguer : - la zone de préamplification (zone 1) - et la zone d amplification et de détection (zone 2), ces zones étant necessairement séparées par une cloison car les amplicons sont volatiles. Dans ce même but, il est impératif de changer de blouse et de gants lors de tout passage d une zone à l autre. De plus, dans la zone 1, se trouve deux secteurs : - un secteur de préparation des réactifs (secteur 1) - et un secteur de préparation des échantillons (secteur 2). Remarque : La zone d amplification et de détection est appelée aussi secteur 3. C est dans cette zone que l on manipule les amplicons.

Choix et commande du matériel : Choix du matériel : Il est impératif d utiliser une pipette dédiée " Témoin + ", HCV, secteur 2. En effet, cette pipette ne doit servir qu aux prélèvements concernant le " Témoin + " afin de ne pas contaminer notre " Témoin - " et les échantillons qui, dans ce cas, seraient révélés comme de faux positifs. Lors de la préparation des témoins et des échantillons, il est essentiel aussi d utiliser des tubes Sarstedt (de 2 ml). Le protocole Roche n a été validé qu en utilisant ce type de tube car il possède

un joint torique et un bouchon vissé de sécurité qui évitent les disséminations éventuelles lors de l utilisation du bain-marie à sec et de la centrifugeuse. De même, l utilisation de cônes à filtre est très importante. Elle évite les contaminations de pipetttes et ainsi, la contamination de n importe quel prélèvement. Cependant, le filtre constituant ces embouts anti-aérosols sont détruits lors d un contact avec l alcool. Donc, dans ce dernier cas, seule l utilisation de cônes non protégés s impose. De plus, lorsque l on a préparé l éthanol à 70%, il faut veiller à ne pas le stocker dans des tubes en plastique, ce composant ayant des propriétés absorbantes à 450 nm. Il faut donc utiliser des tubes en isopropylène. a. Commandes du matériel : 1. Matériel nécessaire par secteur et mode opératoire : 2. Au secteur 1, Le kit Amplicor HCV d amplification, correspondant à une solution tamponnée à la bicine, renferme <25% de glycérol, <0.001% de datp, dctp, dgtp, dutp (ces bases sont en excès), l amorce antisens biotinylée KY78 : 5 -biotine-ctcgcaagcaccctatcaggcagt, l amorce sens non biotinylée KY80 : 5 -GCAGAAAGCGTCTAGCATGGGGT, <0.01% rtth DNA polymérase, <0.01% d Ampérase et 0.05% d azide de sodium. Nous distribuons 50µL de ce mélange dans chaque microtube d amplification grâce à une pipette à déplacement positif dédiée HCV, secteur 1. Le plateau d amplification est conservé à 4 C avec les barrettes de bouchons pendant la préparation des échantillons. Au secteur 2, Le kit Amplicor HCV de préparation des échantillons. Ce kit contient : - un réactif de lyse Amplicor HCV - un diluant d échantillon Amplicor HCV - un plasma négatif (humain) - un témoin positif Amplicor HCV ; il s agit d un ARN transcrit non infectieux, présentant des séquences oligonucléotidiques du VHC, de l ARN poly-a, - un témoin négatif Amplicor HCV, contenant de l ARN poly-a - le standard interne Amplicor HCV ; A cela, il faut ajouter : - de l isopropanol, - de l éthanol ; Doit se trouver également dans ce secteur : - la microcentrifugeuse tournant à 13000g - le bain-marie à sec, chauffant jusqu à 100 C, - une pipette de 50 µl, servant seulement aux prélèvements du témoin positif, - une pipette de 10 à 100 µl, avec laquelle des cônes anti-aérosols sont utilisés, - et une pipette de 100 à 1000 µl. A chaque série de tests, correspond un témoin positif et un témoin négatif ; La préparation des échantillons et des témoins est la suivante :

Témoin positif Témoin négatif Echantillons HCV Lysis Reagent 400 µl 400 µl 400 µl Normal Human Plasma 100 µl 100 µl 100 µl Sérum homogénéisé 100 µl Témoin vortexé 50 µl 50µL VORTEXER Bain-marie à sec à 60 C ; 10 min. Isopropanol 500 µl 500 µl 500 µl HOMOGENEISATION IMMEDIATE PAR RETOURNEMENT ET VORTEXAGE RIGOUREUX Température ambiante ; 10 minutes Centrifugation à 13000g à température ambiante pendant 15 minutes Aspirer le surnageant Ethanol 70% 1 ml 1 ml 1 ml Centrifuger à 13000g à température ambiante pendant 5 minutes Aspirer le surnageant HCV Specimen Diluent + CI 1 ml 1 ml 1 ml Prise d essai à ajouter dans le Master Mix Remarque : Vortexer pendant 5 secondes Laisser décanter à température ambiante pendant 5 minutes 50 µl 50 µl 50 µl 1 ) Les sérums sont obtenus par centrifugation (à 1500g pendant 20minutes) des prélèvements sanguins effectués sur milieux secs. On conserve ces sérums à 20 C pour une conservation inférieure à 3 mois. 2 ) A 1 tube de HCV Specimen Diluent, on ajoute 50 µl de Contrôle Interne. Ce tube de HCV Specimen Diluent reconstitué est alors prévu pour 12 essais. Au secteur 3, Se trouve tout d abord : le thermocycleur (Perkin-Elmer ; GeneAmp PCR System 2400). La programmation de la méthode PCR est la suivante (schéma 5) :

Puis nous trouvons : le kit Amplicor HCV de détection comprenant : - les microcupules Amplicor HCV - une solution de dénaturation Amplicor - un tampon d'hybridation Amplicor HCV - une solution contenant le conjugué avidine-péroxydase de Raifort - un substrat A Amplicor - un substrat B Amplicor - un réactif d'arrêt Amplicor - un concentré de lavage (10X) Amplicor le kit Amplicor Contrôle Interne. De même, celui-ci comprend : - une solution de conjugué avidine-péroxydase de Raifort - un substrat A Amplicor - un substrat B Amplicor - un réactif d'arrêt Amplicor - un concentré de lavage (10X) Amplicor - et des microcupules Amplicor, spécifiques du CI. Nous avons besoin également d'une étuve à 37 C. On distingue dans ce secteur 4 étapes : La dénaturation : A la fin des cycles de PCR, nous ajoutons au plus vite 100 µl de solution de dénaturation (solution d'edta contenant 1.6% d'hydroxyde de sodium) dans chaque microtube d'amplification. L'hybridation est alors possible entre les amplicons dénaturés et les sondes contenus dans les microcupules. * L'hybridation :

Cette étape est réalisée en ajoutant 100 µl de tampon d'hybridation dans chacune des microcupules (VHC et CI). Ce tampon d'hybridation est une solution de phosphate de sodium contenant <0.2% de solubilisant et <25% d'agent chaotrope. Après avoir ajouté 25 µl d'amplicons dénaturés dans chacune des microcupules (VHC et CI), la microplaque est placée à 37 C pendant 1 heure. C'est pendant cette incubation que s'effectue l'hybridation d'une part, entre les sondes spécifiques de l'adn du VHC qui se trouvent fixées aux microcupules et les amplicons VHC dénaturés et d'autre part, entre les sondes spécifiques de l'adn du CI et les amplicons du CI dénaturés. Afin d'éliminer les amplicons non retenus dans les microcupules, une série de 5 lavages par cupule est réalisée. La solution de lavage utilisée est une solution de phosphate de sodium et de chlorure de sodium contenant de l'edta et moins de 2% en détergent ; cette solution se conserve 15 jours à température ambiante et à l'obscurité. Remarque : Roche nous propose dans les kits de détection une solution de lavage 10X. Une dilution au 10 ème est donc nécessaire pour obtenir une solution 1X. Le kit de détection du CI ne contient pas de solution d'hybridation. On se sert alors de celle appartenant au kit de détection VHC. La détection : Dans chaque microcupule, sont ajoutés 100 µl de conjugué avidine-péroxydase de Raifort. L'avidine associée à l'enzyme, ayant une grande affinité pour la biotine, se fixe alors à l'extrémité des amplicons biotinylés. L'hybridation, amplicon / conjugué, est effectuée à 37 C pendant 15 minutes. De nouveau, une série de 5 lavages est réalisée pour éliminer l'excès de conjugués. Ensuite, 100 µl de substrat "actif" de la péroxydase sont ajoutés dans chaque microcupule. Remarque : Le substrat "actif" a été préalablement préparé au secteur 2, en mélangeant, pour 8 microcupules : - 1 ml de la solution A, solution de citrate qui contient 0.01% de H 2 O 2 et - 0.25 ml de la solution B, solution contenant 0.1% de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) dans 40% de diméthylformamide (DMF). On place la microplaque à l'obscurité pendant 10 minutes afin que s'effectue la réaction colorée suivante (schéma 6) :

Après ces 10 minutes, 100 µl de la solution d'arrêt (solution à 4.9% d'acide sulfurique) sont ajoutés dans chaque microcupule. On obtient une coloration jaune. Lecture des résultats et interprétations : Pour chaque microcupule, on lit l'absorbance à 450 nm, contre de l'air. Selon Roche Diagnostics, les résultats sont à interpréter de la façon suivante : D.O VHC (450 nm) D.O CI (450 nm) Interprétations <0.250 0.600 échantillon considéré négatif <0.250 <0.600 résultat négatif non valable 0.600 n'importe quelle valeur échantillon positif Si des mesures de D.O VHC se situent dans la zone douteuse, (0.250 D.O HCV <0.600), les échantillons doivent être de nouveau analysés en double exemplaire et l'interprétation doit être la suivante : D.O VHC (450 nm) D.O CI (450 nm) Interprétations 2/3 résultats >0.4 Valeur indifférente échantillon positif 2/3 résultats <0.4 2/3 résultats >0.6 échantillon présumé négatif 2/3 résultats <0.4 2/3 résultats <0.6 échantillon indéterminé 3. Commentaires et recommandations : Afin d'éviter d'amplifier lors d'un nouveau test des amplicons contaminants issus des PCR précédentes, une enzyme : l'amperase a été ajoutée au mélange réactionnel. Cette enzyme, qui est en fait une UNG (Uracyle N-Glycosylase) va, à 50 C, catalyser la destruction des liaisons covalentes qui lient l'uracyle à l'amplicon. La fragmentation de ces amplicons contaminants est réalisée ensuite lors du premier cycle thermique. Cette étape à 50 C précède les cycles de PCR. C'est par la présence de cette enzyme que l'on amoindrit le risque de détecter de faux positifs. Aussi, la désoxythimidine triphosphate a été remplacé dans le mélange réactionnel par la désoxyuridine triphosphate. Donc, lors des différents cycles de PCR, le dutp est incorporé à la place du dttp. C'est pourquoi, lors d'une prochaine PCR, si des amplicons dernièrement synthétisés viennent contaminer les microtubes d'amplification, ils pourront être à leur tour détruits.

Donc, à la fin de toute PCR, au secteur 3, il est impératif d'ajouter le plus rapidement possible la solution de dénaturation. En effet, si on laisse le système refroidir, et donc revenir à une température inférieure à 50 C, l'amperase deviendrait de nouveau active et détruirait alors les amplicons venant d'être synthétisés. Dans le mélange réactionnel, le ph et la concentration en sels sont optimisés afin d'obtenir une bonne hybridation, c'est-à-dire, éviter toute hybridation amorce/matrice hasardeuse, et éviter d'obtenir des produits de PCR obsolètes. En ce qui concerne le mode opératoire au secteur 2, le but est d'extraire l'arn viral du sérum et de simuler cette extraction en ce qui concerne les témoins ; du plasma humain est donc ajouté dans ces deux tubes témoins pour leur donner la consistance d'un sérum. Aussi, l'étape d'incubation à 60 C est nécessaire pour favoriser la lyse virale dans les tubes tests. De plus, lors de l'ajout de l'isopropanol, les RNA carrier protein vont précipiter avec l'arn ; puis ce précipité va se retrouver dans le culot en fin de centrifugation. Un deuxième lavage est ensuite réalisé en reprenant le culot par de l'éthanol puis en effectuant de nouveau une centrifugation. Après avoir éliminé le surnageant, il faut veiller à bien aspirer l'éthanol car ce dernier est un inhibiteur de PCR. Aussi, en ce qui concerne la décantation de 5 minutes, il faut prendre soin de ne pas dépasser ce délai car le but est d'obtenir la sédimentation des protéines et de laisser les ARN en suspension. Au niveau du secteur 3, les étapes de lavages sont importantes car elles permettent d'éliminer l'excès d'amplicons puis de conjugués, avidine-péroxidase de Raifort, non fixés sur les microcupules. Ainsi, on évite de détecter de faux positifs.