Guide d utilisation des kits Perfect Master Mix SYBR Green Pour les produits AnyGenes : Cat # PMSX-F2S Cat # PMSX-F4S Cat # PMSX-F8S Cat # PMSX-F12S Cat # PMSX-F24S (* Cat # pour toutes les références Perfect Master Mix SYBR Green avec Fluorescéine compatibles avec le système SignArrays développé par AnyGenes ) Utilisation uniquement à des fins de recherche Stocker à -20 C à l abri de la lumière 2014
Sommaire I. Informations sur le produit... Error! Bookmark not defined. 1) Introduction... 3 2) Utilisation envisagée et autorisations... Error! Bookmark not defined. 3) Contenu du kit... Error! Bookmark not defined. 4) Stockage et stabilité... Error! Bookmark not defined. 5) Réactifs additionnels et équipements requis... Error! Bookmark not defined. A) Réactifs:... 4 B) Matériel:... 5 II. Protocole... 5 1) Avant de commencer...... Error! Bookmark not defined. 2) Procédure... 6 III. Informations complémentaires... 8 AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 2
I. Informations sur le produit 1) Introduction Le qpcr Perfect Master Mix SYBR Green est un prémix optimisé et pratique de composants (excepté les primers et échantillons) nécessaires à la réalisation de la PCR en temps réel (qpcr). Il contient une Taq DNA Polymerase thermo-stable ainsi que le tampon et du MgCl 2 à des concentrations optimisées pour obtenir les meilleures performances de l enzyme. Il contient également les dntps requis pour l amplification de l'adn cible, et le SYBR Green. A titre informatif, ce kit ne contient aucun colorant passif de référence tel que le ROX ou la Fluorescéine. Ce prémix idéal ne requiert que l ajout de votre échantillon (ADNc) et de vos primers afin de réaliser votre PCR. Les performances du kit qpcr Perfect Master Mix SYBR Green développé par AnyGenes ont été soigneusement conçues pour vous fournir une haute sensibilité et spécificité. Pour plus de détails, rendez-vous sur www.anygenes.com. Contrôle qualité Dans le cadre de notre programme de garantie de routine, tous les produits AnyGenes sont contrôlés pour vous assurer les plus hauts niveaux de performance et de fiabilité. 2) Utilisation envisagée et autorisations Ces kits sont uniquement dédiés à une utilisation à des fin de recherche en biologie moléculaire. Ce kit n est pas prévu pour une utilisation à des fins diagnostiques, préventives ou pour toute autre application thérapeutique. AnyGenes ne sera donc aucunement responsable de la mauvaise utilisation de ses produits. SYBR Green est une marque déposée de Molecular Probes Inc. Toutes les autres marques ou produits sont des marques déposées appartenant à leurs propriétaires respectifs. L achat des kits AnyGenes n inclut pas ni ne fournit de licence à l'égard des brevets détenus par Hoffman-La Roche ou toute autre société. 3) Contenu du kit Le Perfect Master Mix SYBR Green est fourni en concentration 2X. Ce Master Mix est optimisé pour l utilisation en présence de SYBR Green et contient: - Les composants du tampon optimisés, incluant le MgCl 2 et le SYBR Green AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 3
- Une Hot Start Taq DNA Polymerase - Des dntps Ces produits Perfect MasterMix SYBR Green sont disponibles sous différents formats compatibles avec les systèmes SignArrays : Référence Catalogue : PMSX-W2S Contenu pour le système SignArrays 96 Contenu pour le système SignArrays 384 Perfect Master Mix SYBR Green : 2 x 1mL Perfect Master Mix SYBR Green : 4 x 1mL PMSX-W4S PMSX-W8S PMSX-W12S PMSX-W24S Perfect Master Mix SYBR Green : 4 x 1mL Perfect Master Mix SYBR Green : 8 x 1mL Perfect Master Mix SYBR Green : 12 x 1mL + PCR grade H 2 O : 2mL Perfect Master Mix SYBR Green : 24 x 1mL + PCR grade H 2 O : 4 x 1mL Perfect Master Mix SYBR Green : 8 x 1mL * * * Pour plus d informations sur les produits, veuillez vous rendre sur www.anygenes.com ou nous contacter à l adresse suivante : technical@anygenes.com. 4) Stockage et stabilité Dès réception, stockez le kit Perfect Master Mix SYBR Green à -20 C jusqu à son utilisation. Ces conditions de stockage garantissent une viabilité des produits AnyGenes d au minimum 6 mois après réception. De plus, dans le but de garantir la stabilité des produits, évitez des cycles de congélation et décongélation répétées. Si de petits volumes de Perfect Master Mix SYBR Green sont fréquemment requis, nous vous recommandons de stocker des alicots à -20 C. 5) Réactifs additionnels et matériel requis A) Réactifs: - Echantillons dilués (ADNc) - SignArrays 96 puits - H 2 O Ultra-pure et stérile «nuclease, RNAse, DNAse free» (fournie avec le kit AnyGenes Perfect Master Mix SYBR Green ) Attention: Ne pas utiliser d'h 2 O DEPC!!! AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 4
B) Matériel: - Appareils de PCR quantitative en temps réel (Light Cycler 480 (Roche ), ABI 7900, ABI 7500 (Applied Biosystems / Life Technologies )...) * - Centrifugeuse pour plaques PCR - Agitateur de type vortex et Mini-centrifugeuse - Cônes et tubes «nuclease, RNase, DNase free» - Pipettes pour la préparation des mix - Réservoirs à réactifs pour préparer les mix réactionnels avec une pipette multicanaux * Les appareils de qpcr compatibles avec l utilisation de kits PMS (sans ROX ni Fluorescéine) sont listés cidessous : Société Appareils SignArrays 96 Cat # SignArrays 384 Cat # Perfect Master Mix SYBR Green Cat # Roche LightCycler 480 XXXH1-RXS XXXH2-RXS PMSX-WXS Bio-Rad Eppendorf Chromo4 XXXH1-BXS * PMSX-WXS Opticon XXXH1-BXS * PMSX-WXS Opticon2 XXXH1-BXS * PMSX-WXS CFX96 XXXH1-BXS * PMSX-WXS CFX384 * XXXH2-AXS PMSX-WXS Mastercycler ep realplex 2 XXXH1-AXS * PMSX-WXS / PMSX-RXS Mastercycler ep realplex 2S XXXH1-AXS * PMSX-WXS / PMSX-RXS Mastercycler ep realplex 4 XXXH1-AXS * PMSX-WXS / PMSX-RXS Mastercycler ep realplex 4S XXXH1-AXS * PMSX-WXS / PMSX-RXS * LightCycler 480 est une marque déposée de Roche. Chromo4, Opticon, Opticon2, CFX96, CFX384 sont des marques déposées de Bio-Rad. Mastercycler ep realplex est une marque déposée d'eppendorf. Pour plus d informations sur les produits, veuillez vous rendre sur www.anygenes.com ou nous contacter à l adresse suivante : technical@anygenes.com. II. Protocole 1) Avant de commencer... Afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles et éviter toute contamination et signaux fauxpositifs, il est important et nécessaire de suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoire. De plus, vous n avez pas besoin d ajouter du MgCl 2 dans votre mix réactionnel de PCR. La concentration de MgCl 2 contenue dans nos kits a déjà été ajustée pour améliorer l efficacité, la spécificité et la reproductibilité. AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 5
Attention: Le Perfect Master Mix SYBR Green contient du SYBR Green, un intercalent de l ADN, qui peut potentiellement avoir des effets cancérigènes. Ainsi, il est essentiel d éviter toute inhalation et contact avec la peau et les muqueuses. 2) Procédure 1) Décongeler le Perfect Master Mix SYBR Green et vos échantillons d'adnc 20 minutes avant utilisation, pour qu'ils atteignent lentement la température ambiante. Nous vous recommandons cependant de travailler avec vos échantillons dans la glace. 2) Préparer la surface de travail (hautement recommandée sous hotte) en nettoyant soigneusement tout le matériel et les paillasses avec un détergent adapté. Puis, décontaminez la hotte avec une exposition aux UV. 3) Pendant ce temps, centrifuger brièvement les tubes et réactifs, et préparer la solution dans un tube de 2 ml ou directement dans un réservoir à réactifs selon le tableau ci-dessous: Réactifs Pour le système SignArrays 96 Pour le système SignArrays 384 Volumes / réaction Volume recommandés pour 1 SignArray 96 Volumes / reaction Volume recommandés pour 1 SignArray 384 2X Perfect Master Mix SYBR Green 10 µl 1 000 µl 5 µl 500 µl H 2 0 Ultra-pure 8 µl 800 µl 4 µl 400 µl Échantillon d'adnc dilué 2 µl 200 µl 1 µl 100 µl Volume réactionnel total 20 µl par puits 2 000 µl 10 µl par puits 1 000 µl De plus, pour plus de commodité et afin d'obtenir une haute spécificité et efficacité de vos expériences, nous avons optimisé notre design de primers spécifique et la composition de nos kits afin d obtenir la meilleure spécificité et fiabilité de vos résultats de qpcr. NB: Dans le système SignArrays 96 ou 384, les primers sont déjà présents sous forme lyophilisée dans les plaques et vous n avez pas besoin d ajouter des primers dans le mix réactionnel. Pour cette application, veuillez vous référer au protocole dédié au système SignArrays. 4) Mélanger minutieusement avec une pipette ou centrifugez brièvement la solution et transférer le mix dans un réservoir à réactifs. AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 6
5) Selon le format de système SignArray, déposer 10 ou 20 µl du mix réactionnel par puits sur la plaque de qpcr. NB: Changer de cône dès que nécessaire pour éviter toute contamination. 6) Couvrir la plaque avec un film optique. Attention: Ne préparez pas votre mix réactionnel de PCR trop tôt afin d'obtenir des résultats fiables et reproductibles. Cependant, si vos plaques ont été préparées avant le démarrage de la qpcr, conservez-la sur de la glace ou à 4 C au réfrigérateur. 7) Centrifuger la plaque entre 15 à 60s à 1000 g pour éliminer les éventuelles bulles d'air. 8) Pendant ce temps, préparer et vérifier le programme de qpcr selon les conditions ci-dessous (compatibles avec la plupart des appareils de qpcr): Phase Dénaturation initiale - Activation de la HOT start Taq polymérase Nombre de cycles Temps Température Mode d Acquisition Commentaires 1 10 min 95 C / Activation de la «Hot-start DNA Taq polymérase» Amplification 40-45 5 s 95 C / Dénaturation des brins d'adnc 30 s 60 C quantification Étapes d hybridation et d élongation avec acquisition de fluorescence Courbes de fusion 1 10 s 95 C / 30 s 65 C / 0 s 95 C continu Courbes de fusion Pour plus d informations veuillez contacter le support technique d AnyGenes via technical@anygenes.com 9) Placez le SignArray dans votre appareil de qpcr. 10) Démarrez le programme de qpcr, en suivant les recommandations et protocoles du fournisseur. AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 7
III. Informations complémentaires Pour plus d informations veuillez contacter le support technique à l adresse suivante: technical@anygenes.com AnyGenes 4 rue de la chine, 75970 Paris cedex 20 T: 00 33 (0)1 43 58 88 63 F: 00 33 (0)1 56 01 64 58 www.anygenes.com AnyGenes Guide d'utilisation du Perfect Master Mix SYBR Green Page 8