Les anticorps antinucléaires ANA

Les anticorps antinucléaires ANA Nicole FABIEN Service d immunologie Hospices Civils de Lyon Joëlle GOETZ Laboratoire central d immunologie CHU Strasbourg René-Louis HUMBEL Laboratoire Luxembourgeois d Immuno-Pathologie Luxembourg

LES COMPARTIMENTS NUCLEAIRES Spector Les compartiments du noyau et antigènes cibles des ANA PORE NUCLEAIRE DOTS DOMAINE OPT Antigènes chromatiniens DOMAINE DE TRANSCRIPTION MULTIPLE DOTS Antigènes nucléaires solubles Antigènes membranaires Antigènes nucléaires solubles COMPARTIMENT PERINUCLEOLAIRE Antigènes nucléolaires NUCLEOLE HETEROCHROMATINE

CHROMOSOME CHROMATINE HMG HMG Centromère Chromodomaine HP1p25 Nucléosome NUCLEOSOME HISTONES antigènes chromatiniens Mi2 ADN ADN Topo I (Scl-70) Topo II (Ki/Si) XRCC4 DNA-Ligase IV DNA-K PMS1 Ku Poly (ADR) Tip49 II Hélicase hmyh PCNA ADN REPLICATION antigènes nucléoplasme - RNA Pol II - TF II F - P75 Act. - PML/Sp100 - OPT - hn RNP - sn RNP (RNP,Sm) - SS-A (Ro) -SPOP - SS-B (La) -SR -Coiline p80 - RNA Pol III - RNA Pol I - TF III F - UBF (Nor 90) - ASE - SLI - TTF1 Pré-mRNA Pré-tRNA Pré-r-RNA ARNm ARNt ARNr - U3 snornp (Fibrillarine./Myo22/25) - nucléoline - RNA Hélicase II (Gu) - RNAse MRP - B23 - Th/To - PMScl (PM-Scl) antigènes nucléolaires Cytoplasme ARNt-Synthétases Jo 1, PL 7, PL 12, EJ, 0J, SC, KJ Elongation factor EF1 (Fer) Cytoplasme PROTEINES RIBOSOMIQUES (PO,P1,P2,L7,L10,L12,L14,S10) Réticulum Endoplasmique Signal Recognition Particule RIBOSOME Cibles des ANA: noyau et cytoplasme D après Pr.R.L Humbel, LLIP, Luxembourg

ANA antigènes nucléaires ET cytoplasmiques 615 protéines 29 protéines 23 protéines 271 protéines 136 protéines

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques Ac anti-adndb, Sm, Ro±La, RNP,Ku LUPUS SYSTEMIQUE Ac anti-ss-a (60 kda) ±SS-B SYNDROME DE GOUGEROT-SJOGREN MAI systémiques Ac anti-t-rna synthétases, SRP, Mi2, Ku MYOPATHIES AUTO-IMMUNES SCLERODERMIES SYSTEMIQUES Ac anti-centromères, Scl-70 fibrillarine, ARNpol3 polyarthrite rhumatoïde ANA et diagnostic des hépatopathies auto-immunes

Situations cliniques avec ANA (HEp-2) Données cliniques % sujets ANA + Lupus érythémateux systémique > 95 Sclérodermie systémique 60-90 Syndrome de Gougerot-Sjögren 40-70 Dermatomyosite, polymyosite 40-70 Connectivite mixte 100 Polyarthrite rhumatoïde 15-50 Hépatopathies auto-immunes (*HAI type 1) Variable 70*% Thyroïdite auto-immune 30-50 Purpura thrombopénique idiopathique 10-30 Sclérose en plaques 25

ANA: facteurs prédictifs avant les symptômes cliniques du LES: moyenne de 3.3 ans à 9.4 ans 1 ANA + : 88% des 130 patients atteints de LES ANA (IFI) au 1/120 78% Anti-ADNdb 55% Anti-SS-A/Ro-60 29-47% Anti-SS-B/La 34% Anti-Sm 32% Anti-U1RNP 26% Anti-phospholipides 18% Arbuckle MR et al. (N Engl J Med, 2003) Heinlen LD, et al. (PLoS ONE 2010)

Recherche des ANA au laboratoire d immunologie: IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE = GOLD STANDARD Antigènes nucléaires solubles du noyau : ENA Chromatine/ADNdb/nucléosomes Antigènes nucléolaires Antigènes cytoplasmiques Auto-Ac du patient Excitation dans l UV Emission fluorescente Ac anti-igg humaines marquées par un fluorochrome Cellules HEp2 = HeLa Dépistage: première dilution: 1/80 ou 1/160 ou 1/320 Y Titre: dilution de deux en deux: 1280 B 40 : 10.80 Euros Fluorescence mouchetée Fluorescence homogène Fluorescence nucléolaire Fluorescence cytoplasmique Anti-ENA: SS-A, SS-B, Sm, U1 RNP Anti-ADN natif ou db Scl-70, fibrillarine, PM/Scl ARNt synthétase (JO1, PL7,PL12) SRP, ribosomes

Fluorescence mouchetée Recherche des ANA au laboratoire DEPISTAGE: IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE Fluorescence homogène Fluorescence nucléolaire Fluorescence cytoplasmique Anti-ENA: SS-A, SS-B, Sm, U1 RNP Anti-ADN natif ou db Scl-70, fibrillarine, PM/Scl ARNt synthétase (JO1, PL7,PL12) SRP, ribosomes IDENTIFICATION: autres techniques ELISA, fluorimétrie en flux,dot Farr, ELISA, crithidia ELISA, fluorimétrie en flux, dot Nomenclature Ac anti-ena (Extractable Nuclear Antigen) 2 ères lettres du nom du 1 er malade chez lequel l Ac a été mis en évidence Sm, Ro, La, Ku, Jo-1 Maladie associée : Scl-70, SS-A, SS-B, PM-Scl Nature de la cible :U1-RNP, PCNA, ARN-t synthétases Technique de mise en évidence: immunoprécipitation, precipitin line (PL): PL-7, PL-12

ANA positifs en Immunofluorescence indirecte identification de l antigène cible *Stratégie consensuelle des laboratoires si titre 320 avec aspect homogène Ac anti-ena + ADNdb recherchés moucheté Ac anti-ena recherchés / ADNdb Données cliniques!!! *ANA positifs quel suivi?: inutile!!! -Bilan initial ANA, anti-adndb, anti-ss-a/ss-b, anti-rnp, anti-sm, anti-phospholipides, C3, C4 -Suivi de l activité de la maladie anti-adndb, C3, C4, anti-ss-a/ss-b: avant une grossesse Recommandations de la Ligue Européenne de Lutte contre le Rhumatisme pour le suivi des patients présentant un LES en pratique clinique et dans les études observationnelles.m.mosca et col ; Ann Rheum Dis 2010 : 69 Utilité de répéter la recherche des ANA connus positifs? questionnaire: rhumatologues, internistes, dermatologues, pneumologues Autoanticorps Chaque consultation Une fois /trimestre Une fois /semestre Une fois /an Ne doit plus être prescrite Anti-nucléaires (ANA) par immunofluorescence indirecte * 55% 45% * Anti-centromères par immunofluorescence indirecte 25% 75% Anti-ADNdb* grossesse 25% 25% 50% Anti-ENA identifiés: SS-A, Sm, U1RNP, Scl-70, JO1 50% 50% * Sauf grossesse, *sauf évolution clinique

5 Valeur diagnostique des ANA positifs > si la cible antigénique est identifiée Situations cliniques avec ANA «faux positifs» le plus souvent sans antigène cible identifié Données cliniques % sujets ANA + Infections Δ, si chronique 10 50 Cancers Variable Fibromyalgie 15-25 ANA induits par médicaments 50-100 Implants mammaires en silicone 15-25 Sujets apparemment sains Population normale (titre 1/160) 5 %, F > M Apparentés de sujets avec connectivite 5-25 Grossesse 5-10 Patients âgés de plus de 60 ans 20 ANA dans une population témoin 21 à 60 ans (Tan. Arthritis Rheum 1997;40:1600) 1/40 = 31,7 % 1/80 = 13,3 % 1/160 = 5,0 % 1/320 = 3,3 % 0 5 Titre 80 160 320 Sensibilité 73 60 38 Spécificité 69 81 96 0 5 LR + 2 3 8 LR 0.7 0.5 0.4 0 PPV 51 59 79 NPV 85 82 77 5 0 1/40 1/80 1/160 1/320

ANA induits par les médicaments Anti-arythmiques: quinidine,(procainamide) Antibiotiques: minocycline, isoniazide Anti-convulsivants: carbamazépine, phénytoïnes Anti-hypertenseurs: β bloquants, (hydralazine), captopril, α méthyl-dopa Anti-inflammatoires : D pénicillamine,sulfasalazine Anti-psychotiques : chlorpromazine Antithyroïdiens: PTU Biothérapies : anti-tnf α, IL-2, IFN-α, β, γ. Hypocholestérolémiants : fénofibrate, statines Titre variable Images de fluorescence variable : homogène, nucléolaire, moucheté Les ac anti-histones ne sont plus recherchés car ils ne sont pas des marqueurs de lupus induit Disparaissent à l arrêt du traitement ANA induits par des agents infectieux Infections virales : EBV, VH C, VHA, VH B, parvovirus B19, VIH, virus Coxackie, influenza, rougeole, varicelle Maladies bactériennes : maladie de Lyme, infections à streptocoques, tuberculose, endocardites lentes Parasitoses : leishmaniose Titres généralement faibles mais cas avec titres élevés Présence transitoire

ANA et cancers Epiphénomène? Modification des antigènes lors de la cancérogénèse? Avant l apparition ou au cours de cancers (traitement?) * ANA et LMNH * Ac anti-scl-70 associé à un risque accru de cancer * Ac anti-tif1 : marqueur de DM associé au cancer (adulte) Titre et aspect de fluorescence variable mais parfois très typique Ac anti-mitotic Spindle Apparatus 2 Ac anti-centromères F Sclérodermies et cancer 50 % à 70% des sujets +: cancer hépatique, mammaire, ORL, lymphome

ANA positifs par quelle technique? Prudence dans l interprétation ANA positifs en IFI Prudence dans l interprétation ANA positifs en test d identification *ANA avec aspect non compatible en IFI *ANA négatifs en IFI Marquage granulaire dense des noyaux en interphase + chromosomes condensés /Cellules en mitose anti-scl-70 (aspect moucheté ) anti-u1 RNP anti-adndb (ELISA/fluorimétrie) anti-srp, PL anti-ss-b sans anti-ss-a Aspect de type moucheté dense Ac anti-dfs70 (dense fine speckled, 70 kda) Lens epithelium derived growth factor p75 (LEDGF/p75) = maladie non auto-immune? Étude GEAI en cours

Ac anti-smd : 10% spécificité > 95% Ac anti-ss-a (60 kda) ± SS-B : 35%!! ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques LUPUS ERYTHEMATEUX SYSTEMIQUE quelques faux négatifs en IFI ou très faibles titres ou cytoplasmiques Ac anti-ro/ss-a 52 kda (= Ac anti-trim 21) Aucune utilité diagnostique en pratique médicale, BAV? Horton, Hépatite virale, Cirrhose éthylique, LMNH (D.Lakomy, N.O.Olsson Dijon) mélange de protéines!!! SS-A60+TRIM21(SS-A52): risque de faux + SS-A 60 Ac anti-u1 RNP 70kDa («Sm/RNP») : 30% Ac anti-ku : 5-10% Ac anti-pcna: 5% spécificité? thyroïdite, PR, hépatite autoimmune, sclérodermie, rhumatisme psoriasique, fibromyalgie X. Bossuyt, Leuven, D.Lakomy Dijon

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques Ac anti-adn double brin/natif LUPUS ERYTHEMATEUX SYSTEMIQUE quelle technique? Prévalence Spécificité RIA: test de Farr 60-80% - 70-95% Crithidia 15-75% - 93-100% ELISA 90-96% - 19*-82% * certains/ag utilisés:adndb purifié, ADN plasmidique Fluorimétrie??-96%?! Syndrome de Gougerot-Sjögren Hépatites auto-immunes Médicaments : anti-tnf α, D-pénicillamine, sulfalazine, Virus : Parvovirus B19 (IgM)

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques LUPUS ERYTHEMATEUX SYSTEMIQUE Ac anti-nucléosomes Prévalence 85% 10 à 30% patients ac anti-adndb négatifs Nucléosomes purifiés ou reconstitués: tests non standardisés Ac anti-ribosomes Prévalence 12-42% Très spécifiques du lupus!! > 98% Manifestations neuropsychiatriques? Neurolupus?

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques Syndrome de Gougerot-Sjögren ANA : prévalence Anti-SS-A/SS-B 60-81% FR 60%

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques MAI systémiques MYOPATHIES AUTO-IMMUNES Ac anti-t-rna synthétases, SRP, Mi2, Ku SCLERODERMIES SYSTEMIQUES Ac anti-centromères, Scl-70, fibrillarine, ARNpol3

Sclérodermie systémique limitée: 20-57-82% Sclérodermie systémique diffuse: 5-8% Syndrome de Raynaud I: 25 % Meilleur pronostic / autres Ac survie à 5 ans(2000) 86% Valeur prédictive pour le développement d une sclérodermie Spécificité : excellente? ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques SCLERODERMIES Anticorps anti-centromères A, B, C Protéines de 19-80 - 140 kda /Attachement fuseau de mitose Basedow rares cas Cancer poumon rares cas Cancer sein 33 % CBP 9 30 % Connectivite mixte rares cas Déficit en IgA 5 % LES 2 5 % Confirmation possible: Dot/ELISA/Fluorimétrie en flux Discordance: identification positive (dot /ELISA/fluorimétrie) MAIS IFI négative: rares cas de sclérodermies (N.O Olsson, CHU Dijon et groupe du GEAI) PR PTI rares cas rares cas Sjögren 2 27 % Vitiligo rares cas Témoins sains 0 10 %

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques SCLERODERMIES Autoanticorps anti-scl-70 Topo-isomérase I, Protéine de 105 kda: produit de dégradation de 70 kda Nucléoplasme + Centre fibrillaire du nucléole Relaxation de l ADN compact/transcription de l ADN ribosomal Sclérodermie systémique diffuse: 20-50-70 % Sclérodermie systémique limitée: < 10% Association avec anti-centromères: très rare Polymyosite/sclérodermie: 12% Spécificité: 90-98% Pronostic sévère: Fibrose interstitielle diffuse, HTAP, cancers survie à 5 ans(2000) 80% Persistance des anticorps: pronostic plus sévère Identification indispensable Dot/ELISA/Immunodiffusion/ Fluorimétrie en flux/ Westernblot Antigène purifié/recombinant humain: Faux positifs

Autoanticorps anti-arn Polymerase III Sclérodermie systémique limitée: 2-6% Sclérodermie systémique diffuse: 13-23% 2 Cohortes (Paris et Lyon): 9-11% Spécificité: 98% LES Pronostic plus sévère/anti-scl-70? HTAP, fibrose pulmonaire Crise rénale sclérodermique carcinomes

Autoanticorps anti-nucléolaires Anti-nucléolaires = sclérodermies autres maladies autoimmunes: présence d aacs anti-adn db, anti-ss-b, anti-ribosomes: maladies non autoimmunes: anémies, maladies hépatiques, carcinomes Identification de l antigène cible indispensable dot/elisa/radioimmunoprécipitation

Autoanticorps anti-fibrillarine: prévalence et intérêt clinique Sclérodermie systémique limitée: 10% Sclérodermie systémique diffuse: 5-18% Spécificité: 95-97% LES, PR, Sharp, S.Sjögren Pronostic sévère survie à 5 ans (2000) 77% Atteinte pulmonaire, HTAP, fibrose Atteintes musculaire, rénale, cardiaque télangiectasie, lésions cutanées diffuses calcinose, myosite Identification : Unicap/radioimmunoprécipitation/Immnoblotting / dot Antigène recombinant humain Uniquement si marquage nucléolaire

Autoanticorps anti-pm/scl complexe macromoléculaire nucléolaire: 11 Protéines de 20 à 110 kda Principaux antigènes cibles de 75 kda et 100 kda Fonction exoribonucléase, dégradation de l ARN dans le noyau Chevauchement Sclérodermie systémique/myosite: 5-55% Sclérodermie systémique diffuse: 2-3% Polymyosites isolées: 7-8% Dermatomyosites isolées: 6-11% Spécificité 90-98% LES, S. Gougeröt-Sjögren Manif. cutanées limitées, PM, calcinose, ulcères digitaux Identification : ELISA/Dot/Immunodiffusion Uniquement si marquage nucléolaire Association avec les Ac anti-scl-70 (9-35%) Marqueur de faible évolutivité? survie à 5 ans(2000) 92% Marqueur de pronostic sévère? (manifestations pulmonaires sévères / cancers)

Autres ANA avec Images nucléolaires Anticorps Antigènes cibles Formes limitées Formes diffuses Aspect nucléolaire Th/To HTAP, Hypothyroïdie survie à 5 ans(2000) 65% Protéines nucléolaires et cytoplasmiques 40 kda ARN 7-2 Th et 8-2 To RNA 8-19% 1-11% homogène NOR-90 Protéines de 90 kda associées à l'antigène organisateur nucléolaire Upstream binding factor Nucleolar transcription factor I 2% ponctué ARN polymérase I ARN polymérase I 4% moucheté fin Identification: Radioimmunoprécipitation, dot Signification des ac anti-nor90?: lupus, sclérodermie, PR, Gougerot, CBP, hépatocarcinome, mélanome

ANA et diagnostic des maladies auto-immunes systémiques Myopathies Nouvelle classification des myopathies Consensus d experts 119th European Neuromuscular Centre International Workshop 2004, Hoogendijk 2004, Troyanov Y 2005 Place importante des ANA dans le diagnostic *Dermatomyosites *Polymyosites *Myosites de chevauchement définies par la présence d autoanticorps *Myopathie nécrosante médiée par le système immunitaire *Myosites associées aux cancers *Syndrome «des anti-synthétases» myosite : polymyosite >> dermatomyosite - et/ou pneumopathie interstitielle diffuse (50 à 100 %) - et/ou polyarthralgies (90 %) - et/ou atteinte cutanée : «mains de travailleurs», et/ou Raynaud (60%) - avec présence d autoanticorps anti-synthétase - autres maladies auto-immunes : Gougerot-Sjögren (27%), sclérodermie systémique (30%), PR, LES *Autres myopathies inflammatoires ou génétiques myosites à inclusion dystrophie musculaire des ceintures myopathies génétiques

ANA = marqueurs diagnostique et nosologique = entité clinique Marqueur de bon pronostic Marqueur de Sévérité Atteinte pulmonaire SRP Mi2 20-25% PM/Scl Jo-1 <1% Zo PL-12 3-5% <1% SC JS Ac anti-arnt-synthétase PL-7 EJ 3-10% 1-3%? K S Ha 0J <1% < 1% 1-3%?

Autoanticorps anti-jo-1 Recherche des Ac anti-jo1 uniquement si fluorescence typique: risque de faux négatif!!!! Polymyosite 19-33 % Dermatomyosite 5-16% Spécificité 95-99% (Importance du taux) Facteur de mauvais pronostic Myopathies autoimmunes avec fibrose pulmonaire Association à des cancers?

Ac anti-aminoacyl-arnt-synthétase anti-pl-7 : thréonyl-arnt-synthétase anti-pl-12 : alanyl-arnt-synthétase Ac anti-signal Recognition Particle (SRP) ARN7S+ 6 protéines (SRP9,14,19,54,68,72) passage des protéines synthétisées par les ribosomes à travers la membrane du RE épitopes localisés au niveau de l'extrémité N-terminale et du domaine central G de la sous-unité SRP54 Dépistage HEp2 Identification: Dot, Immunodiffusion, RIA HEp2 Foie Identification: Dot, RIA Estomac Anti-PL-7: 3-5% polymyosite > dermatomyosite chevauchement sclérodermie/myosite Polymyosite: 3-7% Dermatomyosite: 3% Anti-PL-12 pneumopathie interstitielle diffuse sans signe de myopathie/pm>dm Myopathie adulte : 5% myopathie nécrosante à anticorps anti-srp Atteinte musculaire sévère résistante à la corticothérapie, rhabdomyolyse, atteinte cardiaque, pas d atteinte cutanée, atteinte pulmonaire rare

Autoanticorps anti-mi2 protéine CHD4 (chromodomain hélicase DNA binding protein) complexe de 7 peptides 2 sous-unité Mi2 et Mi-2b hélicase impliquée dans l'activation de la transcription HEp2 aspect moucheté fin liseré Identification: Dot, ELISA, Immunodiffusion, Western blot aac anti-mi1 non spécifiques Dermatomyosite: adulte 5-21 % et enfant 4-16 % Spécificité: 97% (lupus en phase active) corrélation négative /néoplasies, parfois atteinte pulmonaire bon pronostic

Autres ANA d intérêt Aspect en immunofluorescence? ou à valider Cancers associés Marqueur de Sévérité Atteinte pulmonaire Dermatomyosite amyopathique: 50-73% Dermatomyosite :3-35% TIF1 Dermatomyosite juvénile +PID: 38% Risque ++ PID rapidement progressive Transcriptional Intermediary Factor 1 Dermatomyosite adulte et enfant: 17%- 21% Recherche approfondie d un cancer associé carcinomes pulmonaires > digestifs > ovariens ou mammaires IFI?: aspect finement moucheté, nucléoles négatifs, faible titre MDA-5 CADM-140 P140/MJ (NXP2) NXP2 (Nuclear matrix protein 2 ) Dermatomyosite juvénile: 18% à 28% HMGRC / Statines SAE Autoantibodies against 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase in patients with statin-associated autoimmune myopathy.mammen A.L et coll Arthritis Rheum. 2011Prévalence: 750 patients présentant une myopathie 6% IFI?: cytoplasmique? IFI?: moucheté à gros grains, nucléole négatif Dermatomyosites amyopathiques: 8.4

ANA et Polyarthrite rhumatoïde Prévalence: 15-50% Parfois titres élevés Aspect variable: homogène, moucheté Sans spécificité sauf anticorps anti-adndb au cours des biothérapies

ANA et diagnostic des hépatopathies auto-immunes Anti-mitochondrie 2 Anti-LKM1 Anti-LC1 Anti-actine ANA Titres significatifs = critère diagnostique des HAI (2 grilles de scores des HAI) Prévalence: 70% HAI -1 Ac anti-actine détectés lors de la recherche d ANA sur HEp2 Ac anti-membrane nucléaire (gp210, Nup 62) Ac anti-dots 30% CBP Ac anti-mitochondries détectés lors de la recherche d ANA Ac anti-centromères: pronostic + sévère CBP

Les anticorps antinucléaires : IFI + identification Marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques et/ou phénotypiques des maladies auto-immunes systémiques et des hépatopathies auto-immunes MAIS détectés *pathologies non auto-immunes Infections Cancers *induits par des médicaments *âge des patients > 60 ans Importance d identifier la cible des ANA Importance du dialogue clinicien-biologiste!!! * Orientation vers une recherche plus fine des autoanticorps associés/ maladies auto-immunes * Choix des meilleures techniques d identification