Nouveautés dans le diagnostic biologique de la tuberculose Philippe Lanotte Service de Bactériologie-Virologie Pôle de Microbiologie-Infectiologie Hôpital Bretonneau CHRU de Tours Journées de Formation Médicale Continue, Faculté de Médecine, Tours - 10 septembre 2008 Absence de conflit d intérêt
Nombre de cas de tuberculose maladie déclarés par région, France, 1996-2006
Diagnostic tuberculose Clinique Radiologique Anatomo-pathologique Bactériologique Immunologique Intra-Dermo Reaction à la tuberculine Interféron gamma
Genre Mycobacterium Mycobactéries du groupe de la tuberculose -M. tuberculosis (BK, bacille de Koch) -M. africanum -M. bovis -. -M. bovis BCG M. ulcerans -ulcère de Buruli- M. leprae (bacille de Hansen) Mycobactéries non tuberculeuses (M. atypiques) - M. xenopi - M. terrae - M. kansasii - M. gordonae - M. marinum - M. abscessus - M. chelonae - M. fortuitum
JO Prélèvements (fluidifié/décontaminé) Culture Examen Direct (Ziehl-Neelsen) Milieu solide (Löwenstein-Jensen) J15 Milieu liquide (Middlebrook) Culture + (8-10 j) Culture + (15-21 j) M1 M2 M3 Diagnostic bactériologique
JO Prélèvements (fluidifié/décontaminé) Culture Test d amplification génique J15 M1 Culture + (15-21 j) Antibiogramme (1 mois) Antibiogramme (< 14 J) INH, RIF, ETH, SM, PZA Sonde moléculaire + identification d espèce par biologie moléculaire M2 M3 +/- Recherche de résistance par biologie moléculaire Diagnostic bactériologique
Techniques d amplification génique AVANTAGES grande sensibilité théor. grande spécificité Rapidité (4-6 heures) Identification fiable mise en évidence de mutations (résistance) LIMITES Prise d essai faible (5-10% du vol. / culture) Hétérogénéité prélèvements Sensibilité < culture Validé pour le respiratoire pas de prédiction / viabilité des bactéries faux négatifs/ faux positifs coût (B 250) Diagnostic bactériologique
Hypersensibilité retardée à la tuberculine Réponse Mémoire aux antigènes mycobactériens - La tuberculine : le plus vieux des antigènes mycobactériens - Koch s old tuberculine, 1891 concentré de culture inactivé par la chaleur - Tuberculine Purified Protein Derivative (PPD) concentré de culture en milieu sans protéines, soniqué, filtré, lots non standardisés >200 Ag partagés entre M. tuberculosis, M. bovis, BCG, certaines M. atypiques Présentation d ag mycobactériens Mesure inflammation et induration - IDR : peu sensible chez enfants < 5 ans, immunodéprimés ) - interprétation difficile chez le sujet vacciné Diagnostic immunologique
Hypothèse phylogénique de l évolution des mycobactéries du complexe de la tuberculose RD = Régions de Différence (Brosch et al, PNAS, 2002)
Génomique comparative Gènes absents chez des souches atténuées, comme le BCG RD6 PPEPPE PPE 3841 3842 3843 3844 3845 3846 3847 3848kb RD8 eph Rv3618 lpq 4056 4057 4058 4059 4060 4061 4062 4063 kb A G RD1 Rv3871PE/PPERv3874esat6Rv3876 Rv3877 Rv3878 4349 4350 4351 4352 4353 4354 4355 4356 4357 4358 4359 4360 4361 kb alr Rv3424 IS15 32 RD12 moe cys3 Rv3120/21/22/23 Rv3124 3483 3484 3485 3486 3487 3488 3489 3490 kb B A ssecmoa E RD11 (phirv2) RD5 (mpt40) Rv3430 Rv 2345 IS6110 2624 2625 2626 2627 2628 2629 2630 2631 2632 2633 2634 2635 2636 kb Rv 2346/47/48plcC plcb plca PPE PPE Rv3616 gly cys val Rv2645/46/ IS6110 T 2969 T U2970472971 297 2973 2974 2675 2976 2977 2978 2979 2980 2981 kb 2 Rv2644valT Rv2650/51Rv2652/53/54Rv2655/56/57/58/59/60/61 Rv3619/20PPE PE oric Mycobacterium bovis BCG Pasteur 1173 P2 RD10 Rv0221echA1 0264 0265 0266 0267 0268 kb Rv0223Rv0224 RD13 dea Rv125 1401 1402 1403 1404 1405 1406 1407 kb D 4 Rv12 55 RD4 RD3 (phirv1) Rv3879 Rv3880/81 Rv1256 Rv1257 Rv1258 Rv1509Rv1510gmdA epia Rv1513 Rv1517 1696 1697 1698 1699 1700 1701 1702 1703 1704 1705 1706 1707 1708 1709 kb Rv1505/06/07 Rv1508 Rv1514/15 Rv1516 bio Rv1573/74/75 biob 1779 1780 1781 1782 1783 1784 1785 1786 1787 1788 1789 1790 kb D 1778Rv1571 RD9 Rv2074 2329 2330 2331 2332 2333kb cobmcoblrv2073 Rv2075/76 Régions de différence RD7 RD2 REP Rv1576/77/78Rv1579/80/81 Rv1582/83/84/85 / 86 REP Rv1766/ PE_PG Rv176 Rv177 Rv177 Rv177 Rv177 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 1 2006 2007 2008 2009 kb 67 RS 9 0 2 4 Rv176 5 IS9 RD14 Rv177 3 Rv1964Rv1965mce3 Rv1967Rv1968Rv1969lprM Rv1971/72/73/74/75 Rv1977 Rv1978 PE-PGRS Rv1986Rv1987/88 2207 2208 2209 2210 2211 2212 2213 2214 2215 2216 2217 2218 2219 2220 2221 2222 2223 2224 2225 2226 2227 2228 2229 2230 2231 2232 kb Rv1963 Rv1976 Rv1979mpt64 nrdfrv1982 Rv1984 Rv1985 Rv1989 Mahairas et al., 1996, J. Bact. Gordon SV et al., 1999, Mol. Microbiol. Behr M et al., 1999, Science
Région RD1 RD1 mic RD1 BCG Rv3860 Rv3866Rv3868 Rv3869 PE/PPE Rv3876 Rv3864/65 esx Rv3861Rv3863 Rv3867 Rv3870 Rv3871 Rv3874 Rv3877Rv3878 4336 4337 4338 4339 4340 4341 4342 4343 4344 4345 43464347 4348 43494350 4351 4352 4353 4354 4355 4356 4357 43584359 4360 4361 4362 4363 4364 4365 4366 4367 43684369 4370 43714372 Rv3862 Rv3879 Rv3884 Rv3885 Rv3880 Rv3882 Rv3886 Rv3881 Rv3883 Rv3887 Brodin P et al., 2002, Infect Immun. ESAT-6 CFP-10 Culture Filtrate Protein from M tuberculosis Early Secreted Antigenic Target from M tuberculosis = Antigènes immunodominants pour lymphocytes T
Les nouveaux tests immunologiques de la tuberculose Alternatives in vitro à l IDR : mesure de l IFNγ secrété par les cellules T en réponse à une stimulation par des antigènes spécifiques Sang total ou CMNS Incubation O/N ou 48h Ag M. tuberculosis ESAT 6, CFP10 4 indications retenues actuellement par l HAS : - Enquête autour d un cas - Embauche et suivi des professionnels de santé - Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de tuberculose maladie complexes - Avant mise sous traitement par anti-tnfα ELISA Sécrétion IFNγ T mémoires mesure IFNγ ELISpot IFNγ pg/ml SFC/10 6
Les nouveaux tests immunologiques de la tuberculose disponibles dans le commerce, approuvés par la FDA, marquage CE Antigènes : ESAT-6, CFP10 (RD1), peptides Quanti-FERON-TB Gold in-tube (Cellestis Limited, Canergie, Australia) T SPOT-TB (Oxford Immunotech, Oxford, UK) Avantages par rapport à l IDR : - Pas de seconde visite, résultats en 16-24 heures - Pas de stimulation in vivo des réponses immunes (effet «booster» IDR) - Reproductibilité test et réactifs - validité chez VIH + (adaptation à la numération lymphocytaire) - Résultat objectif - Contrôle + : mitogène (met en évidence des faux négatifs) - Spécificité +++ : populations BCG+, infectées par Mycobactéries atypiques Inconvénients -Conditions réalisations strictes -Coût (hors NABM): 75
Conclusion Techniques moléculaires permettent un gain de temps à partir du prélèvement ou de la culture dans l identification de la mycobactérie dans la prédiction de la résistance à certains antituberculeux Très bonne sensibilité si examen direct positif Ne pas utiliser si faible suspicion de tuberculose Culture reste indispensable en particulier pour tester la sensibilité à des tuberculeux de 1 ère et 2 ème ligne pour comparer les souches bactériennes entre elles Remplacement à terme l IDR par le dosage de l Interféron gamma? Importance du dialogue clinicien/bactériologiste Merci de votre attention