Quelques notions de génomique fonctionnelle: l exemple des puces à ADN Frédéric Devaux Laboratoire de génétique moléculaire Ecole Normale Supérieure
Le «dogme central» de la biologie moléculaire Transcription Traduction ADN ARN Protéines Génome Transcriptome Protéome Les puces à ADN sont une des techniques de génomique fonctionnelle qui permet d analyser le génome et le transcriptome des cellules.
A complémentaire de T G complémentaire de C Le principe d hybridation des acides nucléiques complémentaires Deux séquences complémentaires peuvent s apparier (hybrider). Deux séquences d ADN non complémentaires peuvent hybrider pourvu qu une partie seulement de leurs séquences soient complémentaires. La spécificité (correspondance stricte entre les séquences qui s hybrident) dépend de la stringence du milieu. La stringence dépend de la composition des séquences d ADN, de leurs longueurs, de la température, de la concentration saline et de la présence d agents déstabilisant les liaisons H (ex: formamide)).
Le principe d hybridation des acides nucléiques complémentaires Une séquence d ADN ou d ARN peut donc servir de sonde pour capturer son complémentaire dans un mélange d acides nucléiques!!
Les puces à ADN: principe général Echantillon= mélange complexe d acides nucléiques marqués par un ou plusieurs fluorochromes Scanner à fluorescence Lame de verre (microscope) contenant plusieurs milliers (jusqu à 40 000) de sondes nucléiques individualisées Deux grands types de puces: 1- Fabrication par dépôts 2- Fabrication par synthèse in situ hybridation Quantification du signal d hybridation pour chaque sonde = Détermination qualitative et quantitative de la composition de l échantillon pour plusieurs milliers d acides nucléiques
Les puces à ADN par synthèse in situ (Affimetryx): principe général Lumière + A--- Lumière + G--- Masque céramique A A A A A G G A A A A A G GG G G Etc... Groupement bloquant photolabile Population n 1 Synthèse d acides nucléiques biotinilés hybridation Lecture au scanner à fluorescence Streptavidine-Phycoérythrine PM MM Identification et semiquantification des acides nucléiques de la population n 1 Pour chaque séquence cible: 14 oligonucléotides PM: complémentarité parfaite MM: PM muté d une base=contrôle négatif
Les puces à ADN par dépôts: principe général Population test Population témoin Ratio d expression entre les deux populations Produits PCR ou oligonucléotides Cy3 Synthèse d acides nucléiques marqués Cy5 sondes Acquisition de l image Dépôt robotisé hybridation Scanner à fluorescence Eisen et Brown, Methods in Enzymology 1999
Les puces à ADN par dépots: Quelles séquences déposer??? Fragments longs: Produits de PCR: Design d oligos spécifiques et qui marchent en PCR! Pénibles à produire. Insensibles aux variations allèliques mais attention aux hybridations croisées! Hétérogénéité de tailles, de concentration et de qualité= problèmes de spotting. Double brin= grande versatilité quant au processus de marquage utilisé + meilleure couverture du génome. Séquences en vrac (BAC, cosmides, Banques d EST): pas d oligos à designer mais attention à la qualité des séquences et des hybridations! Fragments courts: Oligonucléotides (40-70 mers): Couteux et attention au design! Livrés «prêts à spotter»! Grande homogénéité de concentration et de qualité= homogénéité du spotting. Plus grande spécificité (familles multigéniques). Simple brin= attention à la méthode de marquage utilisée!
Les puces à ADN par dépots: Différents types de «spotter» (A) Ex: Microgrid (Biorobotics) (B) Ex: Rosetta
Les puces à ADN par dépots: exemple de système de dépôt sur lames
Les puces à ADN par dépots: Marquage des échantillons à étudier Marquages directs avec ou sans amplification Marquages directs sans réaction enzymatique Amorce aléatoire ou spécifique Matrice Matrice Reverse Transcription (RT) (ARN) Klenow (ADN) Interaction chimique directe entre l acide nucléique et une molécule porteuse du fluorochrome Ex: Kit Ulysis de Molecular probes 5µg ARN total Ex: Kit prompto (Corning/promega) Superscript II (Invitrogen) + Cy-dNTP (Ammersham) 10µg ARN total
Les puces à ADN par dépots: Marquage des échantillons à étudier Marquages indirects sans amplification Amorce aléatoire ou spécifique Matrice Reverse Transcription (RT) (ARN) Groupement aminoallyl Klenow (ADN) Groupement ester Fluorochrome Nucléotide Ex: Kit Ambion 1-5µg ARN total
Les puces à ADN par dépots: Marquage des échantillons à étudier Promoteur T7 Matrice Reverse Transcription (RT) (ARN) Klenow (ADN) RT Klenow Transcription in vitro (T7 polymérase) Hybridation sur la puce Révélation Ex: Kit Genisphere Couplé avec PCR= une cellule (25 copies/cellules) Ref: Chiang and Melton, Developmental Cell 2003. Hybridation sur la puce Hybridation d un oligonucléotide marqué =révélation Biotine Streptavidine Ex: Kit Ambion, puces Affimetryx 100 ng ARN total Voire une cellule Ref single cell: Tietjen et al., Neuron 2003
The labelling method used influences the results Random primed Random primed Random primed Oligo dt primed, amplification
Les puces à ADN par dépôts: Combien ca coûte Investissement de départ lourd: Spotter biorobotics: 140 000 euros Pointes: 250 euros pièces (48 pour spotter 12000 gènes en 24 heures) Scanner: 45 000 euros Logiciel d analyse (une licence): 4000 euros Materiel génétique: très variable (6000 oligos levures= 25000 euros) Coût de fonctionnement important: Entretien Spotter: 12 000 euros annuels Garantie scanner: 8000 euros annuels Une lame corning: 14 euros Heureusement de plus en plus de solutions existent pour avoir des puces sans les fabriquer!! Companies privées: Agilent, Eurogentech, MWG Biotech. Compter 400 euros pour une puce. Plate-formes académiques: SGDB de l ENS Paris, CEA Evry, etc Ex: SGDB: 70 euros pour une puce levure, 110 pour 15000 gènes de souris.
On peut tout faire avec des puces à ADN!! Quelques exemples d applications Etude de l expression des gènes dans différents contextes Etude de la dynamique de transcription Etude de la stabilité des ARN et de leur maturation Etude des interactions acides nucléiques-protéines in vivo et in vitro Etude de la localisation intracellulaire des ARN/ Traduction Etude de la dynamique de réplication Détection et identification de microorganismes et de souches CGH array
Vers une couverture intégrale du génome, les tiling array et les SNP arrays D après Johnson et al., Trends in genetics 2005
Vers une couverture intégrale du génome, les tiling array et les SNP arrays Jusqu à 780 000 sondes sur une lame!! Etude de la matière noire du génome Revue: Johnson et al. Trends in genetics 2005. Ex: Bertone et al., Science 2004. ChIP on chip haute résolution Ex: Lengronne et al., Nature 2004; Pokholok et al. Cell 2005. CGH, replication, etc
Les puces à ADN par dépôts: Combien ca coûte Investissement de départ lourd: Spotter biorobotics: 140 000 euros Pointes: 250 euros pièces (48 pour spotter 12000 gènes en 24 heures) Scanner: 45 000 euros Logiciel d analyse (une licence): 4000 euros Materiel génétique: très variable (6000 oligos levures= 25000 euros) Coût de fonctionnement important: Entretien Spotter: 12 000 euros annuels Garantie scanner: 8000 euros annuels Une lame corning: 14 euros Heureusement de plus en plus de solutions existent pour avoir des puces sans les fabriquer!! Companies privées: Agilent, Eurogentech, MWG Biotech. Compter 400 euros pour une puce. Plate-formes académiques: SGDB de l ENS Paris, CEA Evry, etc Ex: SGDB: 70 euros pour une puce levure, 110 pour 15000 gènes de souris.
Les puces distribuées par la plate-forme transcriptome Puces à ADN de levure (Saccharomyces cerevisae) 2x6500 gènes Les puces à ADN "levure" sont fabriquées à partir d oligos longs (MWG Biotech) représentant environ 6500 ORF, déposés en duplicats sur les lames. 15k : Puces à ADN de souris (Mus musculus) 15000 gènes Environ 15 000 clones ADNc «uniques» ont été réarrangés à partir de 52 374 ESTs d'embryons pré- et péri-implantés, de gonades/mesonephros de femelles E12,5 et d'ovaires de nouveaux nés.
Service de spotting «à façon» Principe: le demandeur fournit le matériel génétique à déposer et la plate-forme prend en charge le reste du processus. De 100 à 22 000 dépôts.
Participation financière Utilisateurs externes: Souris 15K: 110 HT Levure oligos: 70 HT Spotting à façon: dépend du design de la puce et de l implication de la plate-forme dans la préparation du matériel à déposer. Souris 22K (22 000 oligos) Drosophile (15000 oligos) Perspectives pour 2005
Data analysis: the underwater part of the iceberg!!! Experiment Puces commerciales Puces artisanales Experimental design Data Interpretation Base de données disponibles Microarray hybridisation Data representation and clustering Image analysis Normalisation Looking for differential expression Data Analysis
http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/ Pour: commander des puces, poser vos questions, accéder aux protocoles, réserver les appareils de la plate-forme, voir le programme des formations, accéder aux outils d analyse des puces, etc
Application à l étude de la réponse aux drogues chez la levure S. cerevisiae ABC transporters Drugs Pdr5p Snq2p Yor1p Pdr10p Pdr15p ATP ADP PDR1 PDR3 YRR1?? Zn2C6 zinc finger transcription factors Azr1p Flr1p Sng1p Tpo1p Permeases Ipt1p Pdr16p Yor049p Scs7p Plb1p
Trouver les cibles du facteur YRR1: la manip Cellules sauvages Cellules YRR1 gof (gain of function) Phase exponentielle de croissance Extraction et purification desarn totaux Le Crom et al. MCB 2002
Le matériel Puces à ADN levures du SGDB: 6000 oligonucléotides «longs» (70mers) représentant les ORF de la levure. Déposés en dupliquats par un robot biorobotics sur des lames ultragaps corning. Lames traitées aux UV. Une lame de la série testée au sybergreen.
http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/
En piste!!