Diagnostic prénatal non invasif (DPNI) Etat des lieux des applications Charles COUTTON PHU, Génétique Chromosomique Colloque Médical du Jeudi 05 Mars 2015
Pourquoi? DPN: nécessite un geste invasif pour le recueil des cellules fœtales Trophocentèse 11 13 SA Amniocentèse >16 SA Mais: Risque de perte fœtale est estimé à environ 1% Soit environ 450 FCS/an pour 4500 fœtus atteints Anxiété maternelle Morbidité maternelle Coûts importants (acte, hospitalisation, arrêt de travail..)
Objectifs Développer une méthode permettant un dépistage (diagnostic) précoce, fiable et non invasif Diminuer le risque iatrogène
Comment? Les cellules fœtales dans le sang maternel Décrites pour la première fois en 1893 Origines : Trophoblastiques, lymphocytes, érythroblastes, cellules souches hématopoïétiques Avantages : Génome entier isolé
Comment? Les cellules fœtales dans le sang maternel Pr. P. Paterlini Brechot Diagnostic de sexe, de rhésus D, des trisomies 13,18,21 des triploïdies et des maladies géniques Mouawia et al. 2012
Comment? Les cellules fœtales dans le sang maternel Mais Rares : 1 à 2 cellules/ml sang Méthodes d isolement et d enrichissement complexes et peu efficaces Pas de culture possible Micro chimérisme fœtal : persistance plusieurs années après la grossesse (jusqu à 27 ans) Analyse délicate
Comment? Les cellules fœtales dans le sang maternel Bilan après 5 ans d étude (2744 patientes) Sexe fœtal : taux de détection 41,4% faux positifs 11,1% Aneuploïdie : taux de détection 74,4% faux positifs 0,6 4,1%
Comment? ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel (cff DNA)
Comment? ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Il provient des cellules placentaires (cellules du cytotrophoblaste, cellules en apoptose) Représente environ 10% de l ADN total circulant Il est très fragmenté et de petite taille < 200 pb Il est présent dès 4 SA, 7 SA++ Sa concentration augmente au cours de la grossesse Il disparaît en quelques heures après l accouchement (t1/2: 16min) Lo et al. 1997
Comment? ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Facteurs influençant la fraction d ADN fœtal Ashoor et al. 2012 Corrélation positive avec le taux de PAPP A et fraction libre β HCG Corrélation négative avec l IMC maternel Pas de corrélation avec la CN, LCC, an. chromosomiques et autres facteurs maternels (tabac, ethnie )
Applications ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Séquences absentes du génome maternel Diagnostic de sexe fœtal Génotypage rhésus Dosage chromosomique relatif Trisomies 21, 13,18, CNVs Séquences différentes du génome maternel Maladies monogéniques
Applications ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Séquences absentes du génome maternel Diagnostic de sexe fœtal Génotypage rhésus Dosage chromosomique relatif Trisomies 21, 13,18, CNVs Séquences différentes du génome maternel Maladies monogéniques
Sexe fœtal Détection de séquences spécifiques du chromosome Y normalement absentes du génome maternel Gène SRY ou séquences DYS14 Garçons SRY+ Y X Filles SRY Costa et al. 2001
Sexe fœtal Meta analyse (Wright et al. 2012) sensibilité de 96,6% spécificité de 98,9% Faux négatifs (!) Pré analytique (Tps) Concentration cffdna SNP amorces Seuil détection Faux positifs (exept.) Contaminations (PCR nichée) Homologie DYS14 (CTC précédentes grossesses)
Sexe fœtal Sensibilité et spécificité de 100% à partir de 8 10 SA
Sexe fœtal Indications (acte à la nomenclature) Etablies (rapport HAS 2009): Maladies récessives liées à l X Hyperplasie congénitale des surrénales Discutées Anomalies OGE (Finning et al. 2008, littérature insuffisante) X fragile (Wald et al. 2003) Confirmation sexe après DPI (1% erreur) (Tachdjian et al. 2002)
Sexe fœtal Maladies récessives liées à l X Prélèvement invasif uniquement si fœtus masculins
Sexe fœtal Hyperplasie congénitale des surrénales Maladie autosomique récessive Déficit en 21 hydroxylase Production excessive d androgènes Virilisation OGE féminins Recommandations: Traitement par DEX dés le diagnostic grossesse Sexe fœtal sur sang maternel dés 5SA (double confirmation entre 7 et 10SA) Arrêt traitement si garçon
Sexe fœtal 2013 Technique non invasive plus précoce (écho 12 SA) PCR plus fiable si anomalies des OGEs
Génotypage RHD fœtal Détection du gène RHD chez une femme enceinte RhD afin d objectiver un risque incompatibilité fœto maternelle. Chr.1 >95 % d homologie de séquence entre RHD et RHCE 15% de la population européenne est RhD (Afr. 5%, Asi. 0,1%) Parmi les femmes enceintes RhD : 60% sont enceintes d un fœtus RhD+ soit environ 75 000 femmes (sources HAS 2011)
Génotypage RHD fœtal Objectifs chez les femmes RhD : Eviter une amniocentèse (FCS, immunisation) Eviter une prophylaxie anti D inutile si fœtus RhD : Diminuer l exposition aux produits dérivés du sang Stock limité Limiter le coût (?)
Génotypage RHD fœtal (1000) (120 000) (10 000)
Génotypage RHD fœtal Rapport HAS 2011 favorable Sensibilité et spécificité supérieures à 95% Remboursement à venir (2015?) A partir de 11SA Réalisation et interprétation délicate Homologie RHCE (3 cibles différentes, exons 5,7 et 10) Population africaine (pseudogène Ψ non fonctionnel, 60%)
Applications ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Séquences absentes du génome maternel Diagnostic de sexe fœtal Génotypage rhésus Dosage chromosomique relatif Trisomies 21, 13,18, CNVs Séquences différentes du génome maternel Maladies monogéniques
Trisomie 21 Trisomie 21: anomalie chromosomique la plus fréquente Principale indication de prélèvement invasif Programme national de dépistage prénatal
Dépistage de la T21 Terme Echographie 87% Biochimie 5% Risque 11SA 1/250 13SA +6 Premier trimestre Clarté nucale Risque combiné 1T Marqueurs sériques 1T PAPP A, β hcg 1/10, 000 > Risque T21 >1/10 Si > 1/250 Risque séquentiel 2T Deuxième trimestre 17SA +6 La valeur prédictive positive (VPP) du dépistage combiné du premier trimestre est faible, de l ordre de 1/30 => Marqueurs sériques 2T oudiagnostic d une trisomie 21 dans 1 casαfp, toutes β hcg les 30 procédures invasives DPN Trophocentèse Amniocentèse
Trisomie 21 Trisomie 21: anomalie chromosomique la plus fréquente Principale indication de prélèvement invasif Programme national de dépistage prénatal Objectifs du DPNI de la T21: Réduire le nombre de DPN et de FCS liées au geste invasif (Améliorer les perfomances du dépistage)
Dosage chromosomique relatif (DCR) Fœtus euploide: 2 chromosomes 21 Fœtus T21: augmentation du nombre de copies x 1.5 (3 copies /2 copies) 100 copies 105 copies 10 000 000 copies 10 500 000 copies 90 copies maternelles 90 copies maternelles 9 000 000 copies maternelles 9 000 000 copies maternelles 10 copies fœtales 15 copies fœtales 1 000 000 copies fœtales 1 500 000 copies fœtales Fœtus euploïde Fœtus T21 Fœtus euploïde Fœtus T21 Le pouvoir de discrimination augmente avec le nombre de molécules d ADN compté
Trisomie 21 Séquençage haut débit
Trisomie 21 Séquençage haut débit Préparation de l ADN Comptage du nombre de séquence par chromosome
Trisomie 21 Séquençage haut débit T21 z score >3 La valeur mesurée est distante de 3 écarts types de la valeur moyenne du groupe control Palomaki et al. 2011
Trisomie 21 Séquençage haut débit Langlois et al. 2013
Trisomie 21 Séquençage haut débit
Trisomie 21 Séquençage haut débit Limites Echec de la technique résultat non interprétable / douteux Faux positifs (0.1 0.2%) Si mosaïques confinées au placenta Vanishing twin Cause maternelle (cancer) Faux négatifs (<1/10000) taux faible d ADN fœtal (BMI élevée) Mosaïque T21 T21 Euploïde Bianchi et al; 2013 et Wang et al. 2013
Trisomie 21 Si détection d un fœtus T21 par séquençage haut débit Confirmation du résultat par la réalisation d un caryotype fœtal Le séquençage haut débit est un test de dépistage non invasif de la T21 et pas un test diagnostic Cependant, il s agit d un test de dépistage très fiable On parle aussi de dépistage prénatal avancé non invasif de la T21 (DPANI) Le caryotype fœtal reste actuellement le seul test diagnostic pour la T21
Trisomie 21 1959: diagnostic de la T21 2008: DPNI de la T21 par MPS
DPNI T21: pour qui?
DPNI T21: pour qui? Aux femmes enceintes à haut risque T21 >1/250 A toutes les femmes enceintes? A la place du RC 1T (1 T21/10 non dépistée, FPR ~5%)
DPNI T21: pour qui? Aux femmes enceintes à haut risque T21 >1/250 A toutes les femmes enceintes? A la place du RC 1T (1 T21/10 non dépistée, FPR ~5%) Coût Organisation du système de soin Consultation CG, échographie supp. (10SA?) Ethique Banalisation IMG (Eugénisme) Nécessite des évaluations médico économiques complémentaires
DPNI T21: pour qui? Aux femmes enceintes à haut risque T21 >1/250 A toutes les femmes enceintes? Risque intermédiaire (>1/1000)? 1/250 1/1000 95% 87% 12% 5% Nicolaides et al. 2013
Réflexions autour du DPNI de la T21 Avis favorable pour les femmes à risque élevé de T21 Conditions d applications à définir
Réflexions autour du DPNI de la T21 Consultations avant et après la réalisation du test + signature consentement Laboratoire prénatal agréé (pas de relation direct labo patiente) Exclusion bas risque / grossesse gémellaire: manque d études Tests positifs: confirmation par DPN invasif Tests négatifs: ne contre indique pas DPN invasif si signes échographiques T21
Qu en pensent les femmes enceintes?
Qu en pensent les femmes enceintes? Avis très favorable pour les femmes enceintes et les professionnels Yotsumoto et al. 2012
Trisomie 21 Autres techniques: méthylation de l ADN, protéomique, ARNm
Autres aneuploïdies Séquençage haut débit Actuellement, la technique est «aussi» fiable pour les trisomies 13 et 18 Initialement, problèmes liés au biais du contenu en guanine et cytosine (GC) des chr 13 et 18
Variations du nombre de copies (CNVs) DPNI et CNVs Peters et al. NEJM 2011
Variations du nombre de copies (CNVs) DPNI et CNVs Caryotype moléculaire avec une résolution de 3Mb
Applications ADN fœtal libre circulant dans le sang maternel Séquences absentes du génome maternel Diagnostic de sexe fœtal Génotypage rhésus Dosage chromosomique relatif Trisomies 21, 13,18, CNVs Séquences différentes du génome maternel Maladies monogéniques
Maladies monogéniques Mutations de novo Exemple de l achondroplasie et la mutation G380R du gène FGFR3
Maladies monogéniques Mutations paternelles Exemple de la maladie de Huntington Intérêt: Eviter l amniocentèse systématique Applications: Génotypage plaquettaire (HPA1) et Kell (K1) Maladies aut. dominantes paternelles Test de paternité
Maladies monogéniques Maladies autosomiques récessives Diagnostic d exclusion Confirmer l absence de l allèle paternel muté Condition: mutation paternelle différente de maternelle Intérêt: Limiter les prélèvements invasifs Applications: Mucoviscidose α et β thalassémie Acidémie propionique Hyperplasie congénitale des surrénales Amaurose congénitale de Leber
Maladies monogéniques Mutations maternelles (!?) Quantification par dosage «nucléotidique» relatif vs Approche très complexe Interprétation «délicate» Validation nécessaire
Perspectives DPNI et anomalies de structures équilibrées Caryotype 46,XY,t(6;8)(q13;q13)dn CGH array normale Séquençage haut débit Point de cassure de la translocation interrompt le gène CHD7 (Syndrome de CHARGE) T(6;8)(q13;q12.2) Talkowski et al. NEJM 2012
Génome entier Perspectives
DPNI en France: Etat des lieux
DPNI T21 en France: Etat des lieux 2 larges études cliniques: Projet SEHDA Projet SAFE 21 (STIC) 3 laboratoires: Cerba (Paris) Biomnis (Lyon) Hôpital Américain (Paris) 3000 DPNI T21 en 2014
A Grenoble? Recrutement femmes à risque T21 (1>250) Dépistage non invasif de la T21 Recherche Clinique (mi 2015?) Etude DigiT21 (en cours) DRCI 2014
DPNI T21 en France: Etat des lieux
DPNI T21 dans le monde USA, Chine, Allemagne, Suisse, Autriche
DPNI T21 dans le monde
DPNI T21 dans le monde Protection par brevets Tests aujourd'hui proposés à 450 dollars Smith M and Visootsak J. 2013
DPNI T21 dans le monde A ce jour au moins 300 000 tests ont été réalisés dans le monde Bianchi et al. 2013
DPNI dans le monde (PED)
DPNI et dérives
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