Anomalies de la signalisation du récepteur de l Epo et polyglobulies

Anomalies de la signalisation du récepteur de l Epo et polyglobulies François Delhommeau, Laboratoire d hématologie, Hôpital Saint Antoine, aris Valérie Ugo, Laboratoire d Hématologie, CHU Brest

lan Rappels sur l érythropoïèse normale Récepteur de l Epo Signalisation olyglobulie : définitions olyglobulies liées à des mutations du gène du récepteur de l Epo «FC» olyglobulie liées à une mutation activatrice de JAK2 olyglobulie de Vaquez

Hématopoïèse Cellules souches CFU-GEMM rogéniteurs lymphoïdes MOELLE OSSEUSE BFU-E CFU-E Tpo SANG réticulocytes érythrocytes mégacaryocyte s plaquettes monocytes neutrophiles éosinophiles basophiles B T lymphocytes macrophages

Régulation de l érythropoïèse roduction 10 11 érythrocytes par jour fer, vitamines (B12, B9), hormones (T4, androgènes, IGF-1,..) Anémie Hypoxie Equilibre olyglobulie Hyperviscosité Stroma Cytokines ++ EO ++

Erythropoïèse : Action des cytokines progéniteurs immatures progéniteurs matures érythroblastes immatures érythroblastes matures BFU-Ep BFU-Em CFU-E E EB E EA GR GM-CSF, IL6 IL3 SCF EO L érythropoïétine est la seule cytokine à agir sur l érythropoïèse terminale

Erythropoïèse: Expression de R-EO progéniteurs immatures progéniteurs matures érythroblastes immatures érythroblastes matures BFU-Ep BFU-Em CFU-E E EB E EA GR environ 1000 EpoRs Récepteur de l EO

Structure générale des récepteurs de cytokines Domaine extracellulaire N Domaine cytokine Membrane cellulaire 1 domaine transmembranaire Domaine intracellulaire C artie intracellulaire sans activité catalytique propre JAK

Transduction du signal cytokine Jak STAT Ras MA-K TK STAT STAT Transcription Noyau survie prolifération différenciation spécialisation

Récepteur de l érythropoïétine Epo N-term cloné en 1989 chromosome 19 5 kb, 8 exons JAK2 protéine 508 aa 55 à 72-78 kda exons 7 et 8 du gène : partie intracytoplasmique C-term D Andrea et al, 1989

Mécanisme d activation du récepteur de l Epo EO EO JAK2 JAK2 JAK2 JAK2 STAT5 JAK2 JAK2 I3K AKT STAT5 STAT5 MAKinase Anti-apoptose Cycle cellulaire rolifération STAT5 STAT5 Bcl-xl Anti-apoptose D après Livnah, Science 1999

Récepteur de l Epo Vav Myc IRS-2 B1 B2 association à JAK2 et activation Y 343 LVLD Y1 Stat 5 GAB 1/2 Y 401 TILD Y 429 LYLV Y 431 LVVS Y 443 SSGG Y 460 SHY Y 464 ENSL Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Stat 5, GAB 1/2 SH-2, Cis Stat 5 (+/-) SH-1 Grb2 Stat 5 (+/-) Y 479 VACS Y8 I 3-kinase

olyglobulie : définition Augmentation du volume total occupé par les GR dans le sang = augmentation du volume globulaire total Une G se traduit sur l hémogramme (ou NFS) Hématocrite augmenté Hémoglobine augmentée Augmentation de la production de GR olyglobulie

olyglobulies : physiopathologie Une polyglobulie est toujours la conséquence d une augmentation de production des GR par la moelle Mais cette augmentation peut-être Secondaire: liée à une stimulation de la moelle = augmentation de l Epo rimitive, cd survenant sans stimulus détectable Taux d Epo normal ou bas olyglobulie primitive congénitale olyglobulie de Vaquez : acquise

olyglobulie primitive à taux d Epo bas Lignée Erythroblastique «s autonomise» Cellule Souche GR Circulant Erythropoïetine Consommation O 2 Vaisseaux Rein O 2 oumons Cœur Air inspiré O 2

olyglobulies primitives Formation des colonies érythroïdes «spontanées» in vitro 100 75 50 25 EEC N FC V 0 0 0,001 0,01 0,1 0,2 0,5 1 5 EEC = endogenous erythroid colonies

ourquoi rechercher une anomalie de R-Epo dans ces pathologies?

Anomalies du récepteur de l EO Modèles expérimentaux Epo N-term R129C mutation ponctuelle : arginine cystéïne (codon 129) ==> autonomie de croissance et tumorigénicité + - C-term délétion de l'extrémité C-terminale chez la souris ==> augmentation d'activité de R-EO et hypersensibilité à l Epo Yoshimura, 1990, D'Andrea,1991

olyglobulie familiale et mutation du gène de R-EO 1ère description d'une famille avec 33 membres atteints sur 5 générations étudiées ropositus : champion du monde de ski de fond transmission autosomique dominante Espérance de vie normale, aucun symptôme Hb moyenne : H = 20,4 g/dl F = 19,1 g/dl Hypersensibilité à l'eo des progéniteurs médullaires (10-2 ) as d'autonomie vraie De La Chapelle, 1993

Découverte d une mutation du gène de R-EO Délétion de l extrémité C-terminale N-term Etude du gène de R-EO mutation G6002A (exon 8) TGG (tryptophane) en TAG (codon stop) + récepteur «tronqué» de 70 aa à l'extrémité C-term mutation présente 29 cas/29 étudiés Hétérozygotes - C-term De La Chapelle, 1993

Mutations de R-EO et polyglobulies familiales Données de la littérature Delachapelle, 1993 F G6002A perte 70 aa Sokol, 1995 F 5974insG perte 64 aa Furukawa, 1997 F C5986T perte 74 aa Arcasoy, 1997 F del 7 pb 5985-5991 perte 59 aa Kralovics, 1997 F del 7 pb 5985-5991 perte 59 aa F 5967insT perte 65 aa ercy, 1998 S G6002A perte 70 aa Kralovics, 1998 F C5964G perte 83 aa Watowich, 1999 F dupl 5968-5975 perte 79 aa Kralovics, 2001 F G5959T perte 84 aa Arcasoy, 2002 F G5881T perte 110 aa Ugo, 2004 F del 2 pb 5857-5858 perte 85 aa etersen, 2004 F del 4 pb 5938-5941 perte 58 aa

ourquoi la délétion de l extrémité C- terminale du R-Epo entraîne-t-elle une polyglobulie?

La voie du récepteur à l Epo Mécanismes d arrêt du signal EO EO JAK2 JAK2 JAK2 JAK2 STAT5 JAK2 JAK2 SOCS3 SH-1 prolifération survie différenciation

Revenons à R-Epo B1 Arcasoy, Blood, 2002 etersen et al. BJH, 2004 Y1 Y2 Y3 SH1-110 AA - 58 AA olyglobulies familiales d Andrea et al. MCB,1991 DSG Y5-40 AA : hypersensibilité à l Epo Y8

La délétion de l extrémité C-terminale entraîne la perte du site de fixation de SH-1 Transfection de R-EO tronqué dans Ba/F3 confère hypersensibilité à l'epo (De La Chapelle, 1993) JAK2 STAT5 Diminution du taux d'inactivation de Stat5 et de Jak2 (Arcasoy, 1999) SH-1

olyglobulie familiale et mutation de R-EO Modèle murin (- 83 aa) Remplacement (knock-in) du R-EO murin par le récepteur humain sauvage et muté (C5964G) C5964G récepteur amputé de 83 aa en C-term souris wt / hm polyglobuliques, Ht 55% souris hm / hm viables hypersensibilité in vitro des progéniteurs sévèrement polyglobuliques, Ht > 60% splénomégalie Divoky et al, 2001

Modèles animaux : discordances non expliquées Vav Myc IRS-2 B1 B2 Jak2 association and activation Délétion 108 aa Non polyglobuliques Délétion 83 aa olyglobuliques Zang et al, 2001 Y 343 Y1 Stat 5 GAB 1/2 Y 401 Y2 Stat 5, GAB 1/2 SH-2, CIS, SOCS3 Y 429 Y3 Stat SH-1 5 (+/-) Y 431 Y4 Stat 5 (+/-) Y 443 Y5 Y 460 Y 464 Y 479 Y6 Y7 Y8 Canonical Grb2 binding site I 3-kinase

Ce type de mutation peut-il expliquer la polyglobulie primitive acquise = maladie de Vaquez?

hysiopathologie de la polyglobulie de Vaquez Etat des connaissances Est un syndrome myéloprolifératif chronique Les progéniteurs érythroblastiques de V présentent une indépendance à l'érythropoïétine observation de colonies spontanées ou endogènes en absence d'érythropoiétine (EO) 100 75 EEC 50 25 0 0,001 0,01 0,1 0,2 0,5 1 5 Epo (UI/ml) EO 0 Les anomalies de réponse des progéniteurs ne sont pas limitées à l'eo hypersensibilité au SCF, GM-CSF, IL3, IGF-1

Recherche d une anomalie dans la transduction du signal dans la V R-Epo STAT5 STAT3 : activation constitutive dans les NN 4 cas sur 14 as d anomalies du récepteur à l'eo Bcl-xL AKT STAT3 AKT : phosphorylation augmentée dans les érythroblastes Bcl-xL : expression protéique augmentée dans les érythroblastes Mpl : expression diminuée sur les plaquettes Hypothèses 1989-2004

Recherche d'une anomalie dans la transduction du signal Utilisation d inhibiteurs biochimiques des voies de transduction AG490 JAK2 JAK2 JAK2 JAK2 STAT5 I3K STAT5 D98059 LY294002 AKT STAT5 MAKinase Anti-apoptose Cycle cellulaire rolifération STAT5 STAT5 Bcl-xl Anti-apoptose Ugo, Exp Hem 2004

Les voies JAK2-STAT5 et i3-kinase sont nécessaires à la différenciation Epo-indépendante Gpa 31% 8% 6% 29% 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC SCF AG490 50 µm (JAK2) LY294002 25 µm (I3K) D98059 20 µm (MAK) CD 36 Ugo, Exp Hem 2004

Etude du rôle de JAK2 dans la différenciation indépendante de l Epo des cellules de Vaquez ourquoi? JAK2 = protéine située la plus en amont sur la voie de signalisation de R-Epo rotéine kinase constitutivement fixée à R-Epo sous forme non phosphorylée, activée par la fixation du ligand Comment? Trois abords : Fonctionnel: inhibition de JAK2 dans les progéniteurs par stratégie ARN interférence Biochimique: recherche d une anomalie de phosphorylation par I Séquençage de la région codante

GpA Abord fonctionnel : L inhibition spécifique de JAK2 diminue la différenciation indépendante de l Epo des progéniteurs de Vaquez JAK2 beta-actin UT7/Epo sirna contrôle sirna JAK2 24% 11% Nb de CFU-E 200 150 100 50 sirna control sirna JAK2 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CD36 AC 0 CD36 SCF seul James, Nature 2005

Abord biochimique : Une phosphorylation persistante de JAK2 est détectée dans les progéniteurs de V après sevrage en Epo p-jak2 UT7 - + N - + V1 - + V2 Déprivation en cytokines (4 heures) Immunoprecipitation p-tyr Western Blot JAK2

Séquençage de JAK2 : découverte d une mutation ponctuelle située dans le domaine JH2 de JAK2 : JAK2 V617F A G A C A C A Témoin Exon 10 Exon 11 Exon 12 Exon 13 Exon 14 A G A A A C A G1849T V (NN) N-term V617F C-term A G A C A C A FERM domain SH2 JH2 JH1 V (Lympho. T) Domaine d interaction avec R-EO Domaine pseudokinase Domaine kinase James, Nature 2005

L expression de JAK2 V617F dans des lignées cellulaires entraîne une indépendance aux cytokines 3 - IL3 + IL3 7 6 Ba/F3 2 1 5 4 3 2 1 JAK2 V617F Vecteur vide 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 0 J0 J1 J2 J3 J4 JAK2 wt - Epo + Epo 3 10 8 Ba/F3 R-Epo 2 1 6 4 2 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 6 30 5 25 FDC R-Epo 4 3 2 1 20 15 10 5 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 0 J0 J1 J2 J3 J4 J5

Une activation constitutive des voies de signalisation est observée dans les cellules exprimant JAK2 V617F FDC R-Epo Control JAK2 WT JAK2 V617F Epo p-jak2 JAK2 S - + S - + - + p-stat5 STAT5 p-akt AKT p-erk ERK

Hématocrite (%) La greffe de cellules médullaires exprimant JAK2 V617F induit une polyglobulie in vivo EBV ori 65 60 LTR JAK2m IRES GF LTR 55 irradiation 50 45 40 35 30 Donneur Receveur Contrôle Vecteur vide wt JAK2 V617F La mutation JAK2 V617F représente l événement moléculaire primaire et probablement suffisant de la polyglobulie de Vaquez

JAK2 V617F induces most biological abnormalities associated with V Donor MIGR JAK2 V617F GF Infection BMT 950 rads BMT 950 rads BM cells rimary recipients Secondary recipients Low JAK2 V617F levels Thrombocytosis High JAK2 V617F levels Erythrocytosis ---> Myelofibrosis Lacout et al, Blood, 2006

Relative colony number percentage JAK2 genotype and EO-hypersensitivity 120 157 143 217 289 709 total = 1515 ET and V colonies 100 80 60 40 20 0 0 0.001 0.01 0.05 0.5 EO IU/mL Healthy control JAK2 wild-type / wild-type JAK2 V617F / V617F (homozygous) JAK2 V617F / wild-type (heterozygous)

fold expansion (day 7) JAK2 V617F / total JAK2 JAK2 genotype and erythroid lineage amplification Liquid cultures: serum free medium + 20 ng/ml SCF, 100 IU/mL IL3, 1IU/mL EO, Dexamethasone 1.0 p=0.001 0.9 V5 V6 100 80 0.8 0.7 V2 60 40 20 0 ET1 ET2 V1 V10 V2 V5 V6 N1 N2 N3 heterozygous homozygous healthy bone marrow 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 V10 V1 ET1 ET2 0.1 Day 0 Day 7 V homozygous V heterozygous ET Healthy bone marrow

olyglobulies primitives et anomalies de signalisation des voies de l érythropoïétine Conclusions et remarques olyglobulie primitive familiale et congénitale Mutation activatrice de R-Epo entraînant une «troncation» du récepteur Hypersensibilité à l Epo (uniquement) hysiopathologie pas entièrement comprise Discordance des modèles murins olyglobulie de Vaquez Maladie acquise Syndrome myéloprolifératif Mutation ponctuelle activatrice de la protéine tyrosine kinase JAK2 (JAK2 V617F) Touche d autres voies de signalisation des cytokines hysiopathologie: encore des questions car Dans d autres SM ++ Cas hétérozygotes et homozygotes