Les Protéines Fluorescentes Tounsia Aït-Slimane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine CHU Saint-Antoine
Sondes fluorescentes et méthodes d imagerie en biologie : GFP, EGFP, BFP, CFP, YFP, dsred, mrfp1, Hc Red, PA-GFP, timer, Greening, Kaede,, phluorins, PRIM, BiFC, etc FRET, FRAP, FLIP, FLIM, BRET, FLASH, FLAP, CALI, SPT, SMT, FCS, functionalized AFM, etc...)
Histoire de la révolution GFP!!! 1962 Découverte de la GFP O. Shimomura 1992 Clonage du gène codant pour la GFP D. Prasher 1994 Expression dans d autres organismes (C. elegans et E.coli) M. Chalfie
Histoire de la révolution GFP!!! 1996 Optimisation de l usage des codons. Augmentation de la thermo-stabilité. (Yang et al.) Amélioration de la maturation à 37 C. 1996 Elimination d un intron pour utilisation dans les plantes (Haseloff et al.).variants spectraux de la GFP.GFP like protein (Dsred) R. Tsien S A. Lukyanov
GFP : une protéine fluorescente par transfert d'énergie La fluorescence de la GFP dépend de la photo-protéine AEQUORIN. Isolée, cette protéine, en présence de calcium et d oxygène; émet de la lumière bleue. En complexe, elle excite la GFP, par transfert d énergie non radiatif, laquelle émet ensuite de la fluorescence verte.
GFP: La structure La GFP est une petite protéine constituée de 238 acides aminés, organisés en 11brins β antiparallèles et une hélice α centrale. On parle d une structure en «β-can». Les extrémités N-terminal et C-terminal sont accessibles pour la fusion avec d autres protéines. 11 brins β antiparallèles Structure en «β-can» Ormo M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ Yang F, Moss LG, Phillips GN Jr. Science. 1996 Sep 6;273(5280):1392-5. Nat Biotechnol. 1996 Oct;14(10):1246-51.
GFP: Formation du chromophore Le chromophore se forme après cyclisation et oxydation de trois acides aminés de l hélice centrale. Le repliement de la protéine et l oxydation du chromophore se font en 20 min.
Spectre de la GFP Le pic prédominant d excitation de la GFP sauvage est à 400 nm, avec un pic mineur à 475 nm. Dans la forme mutée EGFP, le pic prédominant d excitation est à 488. GFP wt E-GFP
GFP: Propriétés biochimiques La GFP est très stable Elle tolère: - des températures jusqu à 65 C - un ph de 5,5 à 12,2 - traitement avec 8M d urée, 1% SDS Elle est résistante à un traitement prolongé avec des protéases Elle conserve son chromophore après fixation aldéhydique Elle forme des dimères La forme monomérique n est pas fluorescente La fluorescence ne nécessite ni substrat ni co-facteur Dans le chromophore le remplacement de Ser 65 par Thr 65 conduit au mutant GFP65T excitable à 490 nm et 6 fois plus fluorescent.
Variants de la GFP et autres protéines spontanément fluorescentes
Les premiers mutants... EBFP ECFP EGFP EYFP EBFP ECFP EGFP EYFP
La «Cyan Fluorescent Protein»: CFP Excitation 433 nm Emission 476 nm RQ: 0,40
«Yellow Fluorescent Protein»: YFP Excitation 515 nm Emission 529 nm RQ: 0,61 Fluorescence relative Longueur d onde (nm)
Amélioration de la YFP (D après S. Bolte)
DsRed, une autre protéine fluorescente rouge Matz et al. Nature Biotech (1999) 17:963
DsRed, une autre protéine fluorescente rouge Fluorescence relative Excitation 556 nm Emission 583 nm RQ: 0,79 Longueur d onde (nm)
DsRed, une autre protéine fluorescente rouge The biggest difference between green fluorescent protein and it's red analog, DsRed, is that the chromophore of DsRed has an extra double bond (drawn in yellow) which extends the chromophores conjugation and causes the red-shift.
La DsRed pose problème!! Transfectée dans les cellules, la Dsred forme des oligomères, ce qui limite son utilisation comme «traceur» comme sa «rivale» GFP. De multiples mutations Forme tétramérique forme monomérique La RFP monomérique ne s agrège plus mais a un rendement quantique très faible (0,25) comparée à la forme oligomérique (0,79).
100 80 EBFP Caractéristiques spectrales des protéines autofluorescentes ECFP EGFP EYFP DsRed mrfp1 HcRed 100 80 EBFP ECFP EGFP EYFP DsRed mrfp1 HcRed 60 60 40 40 20 20 0 350 400 450 500 550 600 UV bleu vert jaune orange rouge Longueur d onde excitation (nm) 0 400 450 500 550 600 650 700 UV bleu vert jaune orange rouge IR Longueur d onde emission (nm) Ex (nm) Em (nm) ε (M -1. cm -1 ) Φ F brillance (ε. Φ; UA) pka Remarque wtgfp neutre 395 508 25-30 000 0,79 21 600 4,5 Aequorea victoria wtgfp phénolate 475 503 9,5-14 000 ~9 400 Aequorea victoria EBFP 380 440 31 000 0,18 5 600 bleu ECFP 434 477 26 000 0,40 10 000 cyan EGFP 488 509 55 000 0,60 33 000 5,5 vert EYFP 515 529 80 400 0,61 49 000 6,9 jaune Venus YFP 510 530 92 000 0,57 52 000 6,0 insensible Cl -1 DsRed ; DsRed2 558 583 57 000 0,79 45 000 4,7 Discosoma striata mrfp1 584 607 44 000 0,25 11 000 4,5 DsRed monomère HcRed1 ; HcRed-2A 588 618 faible Heteractis crispa fluorescéine 490 520 80 000 0,90 72 000 6,3
Applications utilisant la GFP et ses mutants Les vecteurs Localisation et colocalisation Quantification Localisation dynamique
Anciens et nouveaux vecteurs contenant de la GFP * Enhanced Fluorescent Protein Vectors * Promoterless Enhanced Fluorescent Protein Vectors * N-Terminal Enhanced Fluorescent Protein Vectors * C-Terminal Enhanced Fluorescent Protein Vectors * IRES Bicistronic Enhanced Fluorescent Protein Vectors * pgfp Variant Vectors * Destablized GFP Vectors * Fluorescent Timer http://www.bdbiosciences.com/clontech/
Vecteur d expression eucaryote (exemple) T1/2 > 24 h
Vecteur GFP destabilisée.. T1/2 = 2h
Ready to use GFP-tagged organelle markers
Localisation et colocalisation «simples» TATA-Box binding protein and GFP from D. Piston
Exemple de marquage avec les différentes protéines fluorescentes
Des animaux de toutes les couleurs!!!
Suivre l évolution d une tumeur grâce aux protéines fluorescentes Real-time, whole-body imaging of U87-RFP human glioma growing in the brain of a nude mouse
Variants de la GFP ayant de nouvelles propriétés «magiques» Timer DsRed Greening PA-GFP Kaede phluorins PRIM BiFC
La famille des GFP-Timer Principe Ces molécules contiennent des mutants de GFP dont le spectre d émission change en fonction du temps. Vertes (émission à 500 nm) dans les premières heures suivant leur biosynthèse, elles deviennent rouges (émission à 580nm) à des temps plus tardifs. Cette propriété est liée à des changements de conformation dus à la maturation de la protéine GFP en fonction du temps. Ce type d outil permet donc de «dater» un événement cellulaire, comme par exemple la séquence temporelle de l expression de gènes impliqués dans le développement embryonnaire
Fluorescent Timer Timer = mutant E5 de DsRed (drfp583) Val105-Ala et Ser197-Thr 2h 5h 10h Fluorescent Timer changes from green to red over time. Panel A. Freshly purified Fluorescent Timer protein fluoresces at 500 nm (green), immediately after isolation from overnight E. coli culture. 48 hr after isolation, it fluoresces at 580 nm (red). NB : excitation 280nm. Panel B. Green-red emission measured over time. Terskikh A, et al. Science (2000) 290:1585 50h Time Expression de hsp-e5 dans l embryon de C. elegans
Fluorescent Timer et trafic intracellulaire les premiers seront les derniers
PA-GFP : la GFP photo-activable La wt-gfp est présente sous deux formes : neutre (pic majeur d absorption à 397nm) et anionique (pic mineur d absorption à 475nm) La mutation T203H sur wt-gfp supprime le pic mineur d absorption Symboles pleins : avant illumination UV à 413nm Symboles vides : après illumination UV à 413nm wt-gfp PA-GFP Spectre d émission après excitation à 475nm Patterson & Lippincott-Schwartz Science (2002) 297:1873
la GFP photo-activable : applications Pre-activation 0 sec. Post-activation Cellule Cos7 transfectée par lgp120-pa-gfp colocalisation avec Lamp-2 (lysosomes) 10 sec. Post-activation 20 min. Même expérience en présence de Nocodazole lgp120-pa-gfp Rhod. albumin Merged zoom
Autres mutants de la GFP : phluorins Principe La forme monomérique de la GFP sauvage présente un pic d excitation maximale à 395 nm et un pic d excitation secondaire à 475 nm, ces deux excitations conduisant à une émission unique à 510 nm. De nombreuses variantes de phluorin existent: le rapport d émission de fluorescence à 510 nm après excitation soit à 395 nm, soit à 475 nm, change de manière proportionnelle à la concentration en ions H+. Les applications sont nombreuses et permettent par exemple de mesurer en temps réel l exocytose de vésicules synaptiques, en transfectant une chimère de la synaptobrévine (une protéine associée à la membrane des vésicules synaptiques) et d une phluorin dans des cellules neuronales. Cette chimère présentera un profil d émission différent selon que la vésicule intracellulaire (ph acide) a ou n a pas fusionné avec la membrane plasmique (ph 7,4). Les changements de profil d émission traduiront les événements de fusion à la membrane.
Autres mutants de la GFP : phluorins Wt GFP Ratiometric phluorin Ratiometric phluorin GPI-GFP cellubrevin- GFP Ecliptic phluorin TGN38- GFP Miesenbock, G., D. A. De Angelis, and J. E. Rothman. 1998. Nature. 394:192 195.
Autres mutants de la GFP : phluorins Wt GFP Ratiometric phluorin Ecliptic phluorin Action Potential firing Endocytosis reacidification VAMP Ecliptic phiuorin H + Rothman JE, Ryan TA, Bioph. J, 2000
PRIM : «proximity imaging» Principe La forme monomérique de la GFP sauvage présente un pic d excitation maximale à 395 nm et un pic d excitation secondaire à 475 nm, ces deux excitations conduisant à une émission unique à 510 nm. Lorsque la GFP passe de la forme monomérique à une forme dimérique, ou lorsque deux GFP sont en étroite interaction, le spectre d absorption de la GFP change radicalement, puisque le pic maximal d excitation est alors à 475 nm et l excitation à 395 nm devient secondaire. En effectuant des mesures ratiométriques de la fluorescence récupérée après une excitation aux deux longueurs d onde, il est possible de mesurer la «proximité», c est-à-dire en pratique l homo-oligomérisation d une molécule qui aura été couplée à la GFP sauvage. En développant cette technique, le groupe de James Rothman a pu mettre ainsi en évidence la formation de clusters de protéines dans des microdomaines lipidiques, ou la dimérisation d une protéine particulière, l immunophiline (FKBP).
PRIM : «proximity imaging» (1) - FK1012 + FK1012 Effet de FK 1012 sur les propriétés spectrales et la dimérisation de FKBP-GFP DE ANGELIS D A., MIESENBOCK G, ZEMELMAN B V., AND ROTHMAN J. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95, pp. 12312 12316, 1998 FKBP + rapamycin ----> monomer (immunophilin) FKBP + FK1012 ----> dimer
PRIM : «proximity imaging» (2) FKBP-GFP expression in HeLa cells
PRIM : «proximity imaging» (3)
BiFC :Bimolecular Fluorescence Complementation Permet d étudier les interactions entre deux protéines Deux «hemi-»molécules non fluorescentes Une molécule fluorescente spécifique efficace Hu et al. Mol. Cell (2002) 9:789-798 Pas de changement des propriétés spectrales