ÉTUDES La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? PASCAL GARRY CTSCCV, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex Laboratoire de microbiologie RÉSUMÉ Dans le cadre de cette étude, nous avons examiné l impact de la congélation sur différents germes dans du jambon cuit et de la mêlée de saucisse. Dans un premier temps, nous avons étudié l évolution de la flore naturellement présente dans les produits. Dans la chair à saucisse, nous avons observé une diminution du nombre de Pseudomonas lors de la conservation à 20 C, alors que la flore lactique ne semble pas affectée par la congélation. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l effet de la conservation de jambon cuit à +4 et 20 C sur Listeria, E. coli et Salmonella. Nous avons ainsi montré que la sensibilité des micro-organismes au froid, et plus particulièrement à la congélation, varie en fonction de l espèce. Ainsi, Listeria semble insensible au froid (positif et négatif) ; Salmonella est stressée par la congélation et E. coli est en partie détruite lors de la conservation à 20 C. Par conséquent, dans certains cas, la contamination microbienne des produits est sous-estimée quand ceux-ci sont congelés. INTRODUCTION Programme ACTIA* 99-2 "Effet de la congélation et de la décongélation sur différentes flores microbiennes dans différentes matrices alimentaires". État d'avancement des travaux Il est actuellement préconisé (norme AFNOR NF V04-501) de congeler les produits si leur analyse microbiologique ne peut pas être réalisée dans les 24 heures qui suivent leur SIGLES, ABRÉVIATIONS * ACTIA : Association de Coordination Technique pour l Industrie Agroalimentaire. réception au laboratoire ou leur prélèvement. Cependant, de nombreuses observations expérimentales révèlent l'effet négatif des opérations de congélation et de décongélation qui induisent un état de stress, voire détruisent les micro-organismes présents dans le produit. Les cellules survivant à la congélation ont alors subi un stress. On parlera de cellules viables non cultivables. Ces cellules ne seront donc pas détectables par les techniques classiques d'analyses. Cependant, elles sont capables de restaurer leur activité métabolique dans l aliment et peuvent donc être à l origine d altérations du produit ou d intoxications alimentaires. Les résultats obtenus après congélation risquent d'apporter une fausse sécurité car le respect des critères réglementaires peut s'avérer satisfaisant alors que la population microbienne est élevée. 3
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? Dans le cadre de ce programme financé par l'actia, cinq centres (ADIV, CTSCCV, ISHA, ADRIA Normandie et AGROHALL) étudient l'effet de la congélation et de la décongélation sur les flores naturellement présentes dans différentes matrices alimentaires ou sur des flores réintroduites dans le produit. Il s'agit de vérifier s'il ne vaut mieux pas conserver les produits à température positive proche de 0 C plutôt que de les congeler, afin d'éviter une sous-estimation de la contamination microbienne. Cependant dans certains cas, il n'est pas possible de s'affranchir de la congélation, comme dans le cas d'expertises où les échantillons doivent être conservés plusieurs semaines voire plusieurs mois. C'est pourquoi, dans un deuxième temps, il est envisagé de mettre en place des protocoles de congélation et décongélation, ainsi qu un protocole de revivification des germes stressés par la congélation. Cette seconde partie du programme devrait aboutir à la rédaction d'un protocole minimisant l'effet de ce mode de conservation. Il devrait par ailleurs permettre d'aboutir à un consensus sur les méthodes de revivifications à appliquer afin de récupérer les germes stressés présents dans un produit alimentaire. Cette méthode de revivification s'appuiera sur celle mise au point au cours d'un programme précédent : mise en place de recommandations pratiques de revivification de micro-organismes stressés en vue de leur détection et de leur numération (le stress étudié lors de ce programme de recherche était un stress thermique chaud). Chacun des centres participant au programme a choisi deux matrices alimentaires. Pour sa part, le CTSCCV a choisi le jambon cuit entier et la mêlée de saucisse. ÉVOLUTION DE LA FLORE NATURELLEMENT PRÉSENTE DANS LES MATRICES PROTOCOLES Enrichissement naturel des échantillons Les échantillons ont été conservés pendant 8 heures à 20 C de manière à enrichir naturellement leur flore microbienne, ceci afin de pouvoir observer un effet de la congélation. Conservation des échantillons Les échantillons ont été conservés soit 7 jours à 4 C, soit 21 jours à -20 C. Analyse des échantillons Pour les échantillons congelés, la décongélation avant analyse s'effectuait à 4 C pendant 5 heures 30. Pour les deux températures de conservation, à chaque point d'analyse, 3 échantillons étaient analysés. Les échantillons conservés à 4 C ont été analysés à J0, J2, J3, J4, J6, J7. Les échantillons conservés à -20 C ont été analysés à J0, J2, J3, J4, J6, J7, J14 et J21. Méthodes de dénombrement Nous avons recherché et/ou dénombré les flores suivantes selon les normes AFNOR en vigueur ou par des méthodes validées par l AFNOR. Flore totale mésophile aérobie à 30 C Coliformes totaux à 30 C Coliformes thermotolérants à 44 C Staphylocoques à coagulase positive Clostridium perfringens Salmonella selon la méthode alternative du mini VIDAS (Bio Mérieux) Listeria monocytogenes selon la méthode alternative du mini VIDAS (Bio Mérieux) Flore lactique Pseudomonas (pour la mêlée de saucisse) 4
ÉTUDES RÉSULTATS Jambon cuit Le jambon a été divisé en échantillons de 10 g avant conservation à 4 C ou -20 C. Seules les flores lactique et mésophile aérobie (30 C) ont pu être suivies. En effet, les autres flores n'étaient pas présentes dans le produit analysé ou à des taux inférieurs aux seuils de détection des différentes méthodes utilisées. Les résultats obtenus pour la flore mésophile aérobie sont présentés sur la figure 1 et ceux pour la flore lactique sur la figure 2. A 4 C comme à -20 C, il est difficile de voir une évolution de la flore car le niveau de contamination est élevé dès J0. Ceci est lié au fait qu'avant stockage à 4 C et -20 C, nous avons procédé à un "enrichissement naturel" en laissant le produit à 20 C. De plus, les résultats sont très hétérogènes, ceci est dû à l'échantillon lui-même. En effet, un jambon cuit entier a une masse importante comprise entre 4 et 5 kg. En fonction du lieu de prélèvement, la contamination peut donc varier et les microorganismes peuvent avoir subi un traitement thermique différent en fonction de leur localisation à cœur ou en surface du jambon. FIGURE 1. Évolution de la flore mésophile naturellement présente dans le jambon cuit entier (valeurs moyennes). FIGURE 2. Évolution de la flore lactique naturellement présente dans le jambon cuit entier (valeurs moyennes). * UFC : unité formant colonie 5 BULLETIN DE LIAISON DU CTSCCV / VOL.12 N 3/2002
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? Mêlée de saucisse La chair à saucisse a été divisée en échantillons de 10 g avant conservation à 4 C et -20 C. Seules la flore lactique et les Pseudomonas ont pu être suivies. Les autres flores n'étaient pas présentes dans le produit analysé ou à des taux inférieurs aux seuils de détection des différentes méthodes utilisées. Les résultats obtenus pour la flore lactique sont présentés sur la figure 3 et pour les Pseudomonas sur la figure 4. Contrairement au jambon cuit entier, nous n'avons pas observé de problème d'hétérogénéité de l'échantillonnage. A 4 C, nous observons une évolution rapide de la contamination de la mêlée par les Pseudomonas et la flore lactique. A -20 C, à partir du 4 e jour, nous observons une diminution de plus d'un log de la contamination par Pseudomonas, puis une augmentation très visible à J21. Ce phénomène pourrait s'expliquer par un stress des cellules lors de la congélation, ce qui entraînerait leur non cultivabilité, puis par une "revivification" qui leur permettrait d'être à nouveau cultivables. FIGURE 3. Évolution de la flore lactique naturellement présente dans la mêlée (valeurs moyennes). FIGURE 4. Évolution des Pseudomonas naturellement présentes dans la mêlée (valeurs moyennes). 6
ÉTUDES Cependant, on peut se demander si les cellules microbiennes peuvent se revivifier à une température si basse. Par contre, la flore lactique semble peu affectée par la congélation. ÉTUDE DE L'ÉVOLUTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES, SALMONELLA ET E. COLI RÉENSEMENCÉES DANS DU JAMBON L'ensemble des centres a travaillé sur les mêmes souches. Listeria et Salmonella ont été fournies par le CTSCCV et E. coli par l'isha. Les souches sont conservées sur cryobilles. Les protocoles de préparation des suspensions cellulaires pour Listeria monocytogenes et E. coli sont ceux développés dans le cadre du programme ACTIA "Challenge test". PROTOCOLES Protocole d'obtention de cellules en phase stationnaire Les cellules de Listeria monocytogenes, E. coli et Salmonella sont obtenues après 3 précultures à 37 C en milieu BHI (bouillon cerveau-cœur). Méthode d'ensemencement Un jambon entier stérile a été divisé en échantillons de 10 g (autant d'échantillons que de points d'analyses ont été réalisés). Chacun des échantillons est ensemencé avec 0,1 ml d une suspension à 10 4 cellules/ml obtenue à partir de la 3 e préculture. Dans le même temps, la contamination en Pseudomonas et Entérobactéries a été suivie sur un jambon non stérile. Conservation des échantillons Les échantillons ont été conservés soit 7 jours à 4 C, soit 21 jours à -20 C. Analyse des échantillons Pour les échantillons, la décongélation avant analyse s'effectuait à 4 C pendant 5h30. Pour les deux températures de conservation, à chaque point d'analyse, 3 échantillons étaient analysés. Les échantillons conservés à 4 C ont été analysés à J0, J1, J2 et J7. Pour Listeria monocytogenes qui peut se développer à 4 C, les points J3 et J4 ont également été analysés. Les échantillons conservés à -20 C ont été analysés à J0, J1, J2, J7, J14 et J21. Les flores ont été dénombrées sur PCA et sur milieu sélectif Hektoen pour Salmonella, Palcam pour Listeria monocytogenes et Rapid E. coli2 pour E. coli. Les Pseudomonas et Entérobactéries ont été dénombrées sur milieux sélectifs : CFC et BEA. Calcul des taux de stress Le taux de stress est estimé à partir des dénombrements obtenus sur milieu optimal (PCA) et sur milieu sélectif. Sur milieu sélectif, seules les cellules non stressées se multiplient, et sur milieu optimal, les cellules stressées et non stressées se développent. Le pourcentage de stress est calculé à l'aide de la formule suivante : % de stress = [optimal] - [sélectif] x 100 avec : [optimal] [optimal] = nombre de cellules dénombrées sur milieu optimal [sélectif] = nombre de cellules dénombrées sur milieu sélectif RÉSULTATS Dans le cas des Pseudomonas et Entérobactéries, tous les dénombrements étaient inférieurs au seuil de détection des méthodes (10 UFC/g). Salmonella Les résultats des dénombrements obtenus pour Salmonella conservée à 4 C sont présentés sur les figures 5 et 6. Les pourcentages de cellules stressées lors de la conservation à 4 C sont présentés sur la figure 7. 7
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? FIGURE 5. Évolution de la population de Salmonella, à 4 C (dénombrement sur PCA et Hektoen). FIGURE 6. Évolution de la population de Salmonella, à 4 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 7. Évolution du pourcentage de stress de Salmonella à 4 C. 8
ÉTUDES FIGURE 8. Évolution de la population de Salmonella à -20 C (dénombrement sur PCA et Hektoen). FIGURE 9. Évolution de la population de Salmonella à -20 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 10. Évolution du pourcentage de stress de Salmonella à -20 C. 9
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? FIGURE 11. Évolution de Listeria monocytogenes à 4 C (dénombrement sur PCA et Palcam). FIGURE 12. Évolution de Listeria monocytogenes à +4 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 13. Évolution du pourcentage de stress de Listeria monocytogenes à 4 C. 10
ÉTUDES FIGURE 14. Évolution de Listeria monocytogenes à -20 C (dénombrement sur PCA et Palcam). FIGURE 15. Évolution de Listeria monocytogenes à -20 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 16. Évolution du pourcentage de stress de Listeria monocytogenes à -20 C. 11
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? FIGURE 17. Évolution de E. coli à 4 C (dénombrement sur PCA et Rapid E. coli2). FIGURE 18. Évolution de E. coli à 4 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 19. Évolution du pourcentage de stress de E. coli à 4 C. 12
ÉTUDES FIGURE 20. Évolution de E. coli à -20 C (dénombrement sur PCA et Rapid E. coli2). FIGURE 21. Évolution de E. coli à -20 C (dénombrement sur PCA). FIGURE 22. Évolution du pourcentage de stress de E. coli à -20 C. 13
La congélation des produits modifie-t-elle les résultats d analyses microbiologiques? Nous n'observons pas d'évolution à 4 C, si ce n'est une petite chute à J7 lors du dénombrement sur PCA. Par contre, nous observons progressivement une augmentation du nombre de cellules stressées (à partir du 4 e jour). Les résultats obtenus à -20 C sont présentés sur les figures 8, 9 et 10. A -20 C, on observe une légère diminution à J1 (et J2 pour le 3 e essai), puis pas d'évolution particulière. De plus, le nombre de cellules stressées augmente rapidement dès la congélation et reste très important tout au long de la conservation. Listeria monocytogenes Les résultats des dénombrements obtenus pour Listeria monocytogenes conservée à 4 C sont présentés sur les figures 11 et 12. Les pourcentages de cellules stressées lors de la conservation à 4 C sont présentés sur la figure 13. Pour Listeria monocytogenes à 4 C, nous n'observons pas d'évolution de la population jusqu'à J4 (phase de latence) puis, entre le 4 e et le 7 e jour, un début de croissance. Cette croissance était prévisible puisque Listeria monocytogenes est une bactérie psychrotrophe, ce qui explique que nous n'avons pas mis en évidence de cellules stressées. Les résultats obtenus à -20 C sont présentés sur les figures 14, 15 et 16. Par ailleurs, Listeria ne semble pas sensible à la congélation à -20 C (absence de stress et très faible mortalité). Pour E. coli, nous n'avons pas observé d'évolution de la population à 4 C. Par contre, il semblerait que la souche soit sensible à la congélation puisque l'on observe une diminution progressive de la population. A -20 C, après une augmentation rapide du stress, celui-ci diminue dans le même temps que la mortalité augmente. Il semblerait que les cellules stressées par la congélation meurent progressivement, ce qui expliquerait la diminution du nombre de cellules stressées. Par ailleurs, à 4 C le pourcentage de stress augmente au cours du temps, ce qui confirmerait la sensibilité de la souche au froid. CONCLUSION Les résultats obtenus au cours de cette partie de l'étude, montrent que la sensibilité des microorganismes au froid, et plus particulièrement à la congélation, varie en fonction de l'espèce. Ainsi, Listeria est insensible au froid (positif comme négatif), Salmonella est stressée par la congélation et E. coli est stressée à 4 C (ce qui entraînera une sous-estimation de la population lors du dénombrement) et est en partie détruite à -20 C ; là encore, la contamination du produit sera sous-estimée. Il convient donc de mettre en place non seulement un protocole de congélation / décongélation limitant l'impact de ce mode de conservation des échantillons, mais également d'étudier l'intérêt de l'utilisation de cryoprotecteurs lors de la congélation. C'est ce que nous nous proposerons d'étudier pour la suite du programme. E. coli Les résultats des dénombrements obtenus pour E. coli conservée à 4 C sont présentés sur les figures 17 et 18. Les pourcentages de cellules stressées lors de la conservation à 4 C sont présentés sur la figure 19. Les résultats obtenus à -20 C sont présentés sur les figures 20, 21 et 22. 14