Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) BMC 403 Interface Immunologie-Microbiologie-Environnement février 2007 Durée de l épreuve : 2 heures Vous devez obligatoirement traiter les sujets I et II sur des copies distinctes. Barème: Sujet I noté sur 30 points Sujet II noté sur 30 points 9 pages y compris celle-ci
Sujet I - Immunologie (noté sur 30 points) L apoptose ou mort cellulaire programmée est un processus induit par des signaux intra- ou extracellulaires, impliquant des protéases à cystéine appelées les caspases. Les caspases sont synthétisées sous forme de pro-enzymes qui doivent subir un clivage protéolytique pour devenir des enzymes actives, et clivent leurs substrats protéiques à des sites contenant un résidu aspartate. L apoptose est un système de défense antivirale utilisé par l hôte infecté pour éliminer les cellules infectées par un virus. Elle peut être déclenchée : 1- par l action des lymphocytes T cytotoxiques, 2- par l action de cytokines pro-inflammatoires (par exemple le TNF-α) et 3- par un dérèglement du métabolisme et du cycle cellulaire causé par le virus. Pour échapper à l apoptose, de nombreux virus ou mycobactéries codent des protéines qui interfèrent avec des étapes clés de la voie de signalisation menant à l apoptose. I. Exercice 1 (d après Goldmacher V.S. et al. (1999) PNAS. 96 :12536-12541) Le cytomégalovirus humain (CMV) est un virus pathogène chez les individus immunodéprimés. Dans une 1 ère expérience, des fibroblastes humains ont été infectés in vitro par le CMV pendant les temps indiqués, puis traités par la cycloheximide (CHX) associée au TNF-α ou à un anticorps anti- Fas, pendant 12 heures. Le nombre de cellules vivantes a ensuite été déterminé par un comptage cellulaire au microscope (Figure 1). Figure 1: Evolution de la viabilité cellulaire des fibroblastes infectés par le CMV. Le pourcentage de survie des cellules (% survival cells) a été déterminé dans les cellules non infectées (N= non-infected) et dans les cellules infectées par le CMV au cours du temps après l infection (Days of CMV infection prior to treatment). Question 1. Pourquoi les cellules ont-elles été traitées avec le TNF-α ou avec un anticorps anti-fas en association avec la cycloheximide? (2 lignes maximum) Question 2. Quel est l effet de l infection par le CMV? (8 lignes maximum) Pour étudier quelles sont les protéines virales impliquées dans cet effet, les cellules ont ensuite été transfectées par différentes constructions plasmidiques codant les protéines suivantes : pul37x1 (protéine du CMV), pul37x1δ2-23 (protéine du CMV délétée), E1B19K (protéine de l adénovirus), p35 (protéine du baculovirus), IE1 et/ou IE2 (protéines du CMV), ou ont été Université Pierre et Marie Curie 2
transfectées par le vecteur vide (pcdna3). Vingt quatre heures après la transfection, les cellules ont été traitées avec un anticorps anti-fas et la cyclohehimide (CHX) pendant 24 heures supplémentaires, et la viabilité cellulaire a été déterminée (Figure 2). Figure 2 : Viabilité cellulaire des fibroblastes transfectés par les différentes protéines virales. Le nombre de cellules vivantes (No. of Surviving Cells) a été déterminé après 24h de traitement par un anticorps anti-fas et la CHX. Question 3. Que pouvez-vous conclure de cette expérience? (8 lignes maximum) Des expériences d immunofluorescence ont montré que la protéine pul37x1 était localisée au niveau de la mitochondrie, alors que la protéine pul37x1δ2-23 ne l est pas. La protéine UL37 a été nommée par la suite vmia («viral Mitochondrial Inhibitor of Apoptosis»). Les effets de vmia sur la voie de transduction du signal activée par Fas a été étudiée. Des cellules humaines de la lignée Hela transfectées par le vecteur pcdna3 (contrôle), exprimant vmia ou exprimant Bcl-X L ont été traitées par la cycloheximide et/ou par un anticorps anti-fas. Des lysats cellulaires ont été préparés. Des western blots ont été ont été réalisés à partir de ces lystas pour détecter la pro-caspase 8 (Figure 3a), les protéines Bid, cytochrome c, pro-caspase 9 et PARP, substrat de la caspase 9 (Figure 3b). Figure 3 : a. Détection de la pro-caspase 8 (pcasp-8) dans des cellules Hela transfectées par le plasmide contrôle (pcdna3), par un plasmide permettant l expression de vmia (vmia), ou permettant l expression de Bcl-X L (Bcl-X L ). Les cellules transfectées ont été ou non traitées par un anticorps anti-fas et la CHX. L expression de la pro-caspase 8 a été étudiée à différents temps après ces traitements (Time (h)). a. Détection de la protéine Bid, du cytochrome c (Cyt c), de la procaspase 9 (pcasp 9) et de son substrat (PARP) dans des cellules Hela transfectées pcdna3, vmia ou Bcl-X L, 4h après un traitement par un anticorps anti-fas et la CHX. Université Pierre et Marie Curie 3
Question 4. Rappelez les rôles de ces différentes protéines dans la voie de transduction de l apoptose. (5 lignes maximum) Question 5. A l aide d un schéma uniquement, indiquez à quel niveau de la voie de transduction la protéine virale MIA interfère-elle? II. Exercice 2 Dans les cellules infectées par l adénovirus, l apoptose induite par le TNF-α est inhibée par plusieurs protéines codées par le virus (région E3). Normalement, la fixation du ligand sur le récepteur Fas (un membre de la famille des récepteurs du TNF) entraîne l apoptose de la cellule. Le complexe protéique RID («Receptor Internalization and Degradation») codé par l adénovirus est composé de 2 polypeptides appelés RID-α et RID-β. Une autre protéine virale de l adénovirus, E1B-19K est connue pour inhibée l apoptose induite par le TNF-α. Pour déterminer le rôle éventuel des protéines RID sur l apoptose, des cellules humaines de la lignée MCF7 exprimant la protéine Fas ont été infectées avec de l adénovirus sauvage (wild-type, rec700) ou l adénovirus muté qui ne peut produire les protéines RID-α, RID-β ou E1B-19K. Après l infection, les cellules ont été traitées par un anticorps anti-fas pour induire l apoptose. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Question 1. Virus utilisé % cellules apoptotiques Wild type (rec700) 0,1 E1B-19K+, RID-α- 0,6 E1B-19K+, RID-β- 0,2 E1B-19K-, RID+ 9,9 E1B-19K-, RID- 87,2 Tableau 1: Apoptose induite par anti-fas, après infection des cellules par l adénovirus Citez deux techniques permettant de mettre en évidence l apoptose dans ces cellules. (2 lignes maximum) Question 2. Que pouvez-vous conclure de l effet des protéines virales sur l apoptose? Parallèlement, les mêmes cellules infectées par les différentes formes de virus ont été incubées avec un anticorps anti-fas ou avec un anticorps anti-transférine, couplés à un fluorochrome (fluorescéine FITC), puis ont été analysées en cytométrie de flux (Figure 4). Un western blot a également été réalisé sur les lysats cellulaires, et l expression de Fas, du récepteur de la transférine et de la protéine virale E1A a été recherchée (Figure 5). Université Pierre et Marie Curie 4
Figure 4 Expression de Fas (trait gras), ou du récepteur de la transférine (trait pointillé), dans les cellules contrôles non infectées (Mock) et dans les cellules infectées par le virus sauvage (rec 700 wild-type), ou le virus muté (dl748 ou dl764). En trait fin, les cellules ont été incubées avec un anticorps contrôle. N.B. L étude de l expression du récepteur à la transférine a été utilisé comme contrôle. Figure 5 Détection de la protéine Fas (Fas), du récepteur de la transférine (TfR), et de la protéine virale E1A dans des cellules MCF7 non transfectées (Mock), exprimant l Adénovirus sauvage de type 5 (Ad5 WT) ou de type 2 (Ad2 WT), l adénovirus sauvage rec 700 WT, ou exprimant les adénovirus mutés dl309 (RID-), dl748 (RIDα-) ou dl764 (RIDβ-). Question 3. Quel est l effet des protéines virales RID sur l expression de Fas et du récepteur de la transférine? (8 lignes maximum) Question 4. Par quel mécanisme le virus induit-il une résistance à l apoptose? (5 lignes maximum) Université Pierre et Marie Curie 5
Sujet II - Microbiologie (noté sur 30 points) 1/ Définir ce qu est un processus inflammatoire (6 lignes / 2pts) 2/ Les cytokines jouent un grand rôle dans l inflammation mais aussi dans sa résolution. Décrire le rôle des cytokines dans l inflammation en différenciant précisément mais succinctement leurs trois grands groupes. (2 lignes par groupe de cytokines / 2pts) 3/ Quelle est la principale classe de cytokines impliquée dans la réponse anti-virale? A quoi correspondent les deux catégories (Type I et II) de cette classe de cytokine? (3 lignes / 2pts) La famille des poxviridae est constituée de virus à ADN double brin linéaire de grande taille. Ce sont de grands virus de forme quadrilatère aux angles arrondis d environ 200nm. Les poxviridae sont très répandus dans le monde animal (pox est le pluriel de pock qui en anglais signifie pustule). Parmi ceux qui sont pathogènes pour l'homme se trouvent les virus de la variole et de la vaccine. Le virus de la vaccine est très connu car utilisé comme virus vecteur de vaccins recombinants. Cette famille de virus possède de très nombreuses stratégies d échappement à l inflammation et à l immunité. Le virus de la vaccine (VV) est le prototype des poxviridae. Il code de très nombreuses protéines dont certaines sont sécrétées et interagissent avec des protéines de l hôte liées à l inflammation pour inhiber leurs activités. Figure 1 : En 1995, des chercheurs ont infecté pendant 16h des cellules fibroblastiques L-929 avec différentes souches de virus de la vaccine (non infecté = «mock», «EV», «cowpox», «WR», WR invalidé pour le gène correspondant à la protéine virale B18R «B18R-KO», WR invalidé pour le gène correspondant à la protéine virale B15R «B15R-KO», WR invalidé pour les deux gènes correspondant à la protéine virale B15R et B18R «B15/18R-KO»). Les cellules ont été lysées et un crosslink d affinité (une liaison covalente entre deux protéines interagissant entre elles) a été effectué en présence d IFN-_ radiomarqué à l iode 125. Ces lysats ont ensuite été déposés sur un gel SDS-PAGE. 4/ Quel est le but de cette technique? (en 2 à 3 lignes / 2pts) 5/ Quelle est la protéine virale (B18R ou B15R) qui est impliquée dans cette activité? (en une phase courte / 1,5 pt) Université Pierre et Marie Curie 6
6/ Sachant que l IFN-_ fait environ 20kDa, quel est le poids moléculaire approximatif de cette protéine virale? (une phrase courte / 1,5 pt) Figure 2 : A Milieu de culture B membranes cellulaires Les mêmes expériences de crosslink d activité que celles effectuées dans la figure 1 ont été répétées sur le surnageant ou la surface membranaire de cellules L-929 infectées par différentes souches de Vaccinia virus et la quantité de radioactivité liée à d IFN-_ quantifiée par phosphorimager. Les bandes quantifiées sont toujours à la même taille qu observé précedement. (mock = non infecté, VΔB18R = WR KO pour le gène correspondant à la protéine virale B18R). 7/ Analysez les figures 2A et 2B. Quels éléments apportent ces figures par rapport à la figure 1? (1/2 page maximum / 3 pts) 8/ Que ce passe t il avec les souches VV-USSR et Elephantpox comparé aux autres souches virales? (3 lignes / 1,5 pt) 9/ Emettez une hypothèse sur la différence de liaison à l IFNα de la souche VV-Wyeth par rapport à la souche VV-WR observé dans la figure 2A et 2B, sachant que l on n observe pas de différences significatives sur l expression et la localisation des protéines B18R correspondant à ces deux souches virales. (10 lignes / 2,5 pts) 10/ Sachant que la constante de dissociation de la protéine B18R de VV-WR avec l IFNα est de 52 pm et que la constante de dissociation moyenne des récepteurs cellulaires à l IFNα est d environ 400 pm, conclure sur la stabilité de l interaction des protéines virales B18R à l IFN-_. (6 lignes / 2,5 pts) Figure 3 : Université Pierre et Marie Curie 7
Une immunoprécipitation des protéines JAK1-totales a été effectuée sur des cellules incubées deux heures en présence ou non de protéines recombinantes B18R (AcB18R) ou B15R (AcB15R) en présence ou non d IFNα. Les immunoprécipitats ont été analysés par westernblot en utilisant un anticorps anti-jak1-phosporylé (haut). En tant que contrôle, le même blot effectué avec un anticorps anti-jak1-total (bas). 11/ Comment s appellent les récepteurs cellulaires spécifiques de l IFN de type I? (une phrase / 1,5 pt) 12/ Quelles voies de transduction du signal est induite après reconnaissance de ce couple ligand-récepteur? (3 lignes / 1,5 pt) 13/ Que signifient les initiales ISG? (une phrase / 1,5 pt) 14/ Analysez la figure 3. Quels éléments nouveaux apporte cette figure? (1/2 page maximum / 3 pts) Figure 4 : Université Pierre et Marie Curie 8
Une infection de cellules L-929 à été effectuée en présence et en absence d IFNα avec les souches VV WR, WW WR délétée de B18R «vδb18r» en présence ou non de protéine recombinante B18R exogène. La figure 4 représente les plages de lyses virales obtenues dans ces différents cas de figure. 15/ Après analyse complète de la figure vous émettrez une hypothèse sur l importance de la stratégie virale basée sur B18R par rapport à la réplication virale et l inflammation (1/2 page maximum / 2 points) Université Pierre et Marie Curie 9