Chapitre 3 : Mise en place de la face et de la cavité buccale

Morphogenèse crâniofaciale et Odontogenèse UE Spécifique Odontologie Première Année Commune aux Etudes de Santé Année 2012 2013 Chapitre 3 : Mise en place de la face et de la cavité buccale Dr Agnès BLOCH ZUPAN Professeur des Universités Praticien Hospitalier Collège National des Enseignants en Sciences Biologiques Odontologiques Nous aborderons dans ce cours la mise en place de la face et le développement de la cavité buccale notamment du palais. Les objectifs sont les suivants: décrire la mise en place des bourgeons crâniofaciaux et leur devenir identifier les structures concernées sur des schémas et être capable de redessiner les grandes étapes de ce développement replacer l origine embryologique de ces structures connaître la chronologie des évènements. Les aspects moléculaires liés à la mise en place de ces éléments, et leur devenir seront évoqués. 1

1. Introduction 1.1. Evolution du développement embryonnaire (Souris RARElacZ; source M RHINN, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire IGBMC) 1. Introduction La mise en place de la face et de la cavité buccale s effectue entre la quatrième et la dixième semaine du développement chez l homme et est indissociable de la formation des arcs pharyngés et de leur colonisation par les cellules issues des crêtes neurales céphaliques. 1.1. L évolution du développement embryonnaire chez la souris génétiquement modifiée présentée sur ces images illustre bien les profonds remaniements nécessaires àla formation du massif crâniofacial. L âge de l embryon est donné en nombre de somites et ensuite en jour E (la durée de gestation chez la souris est d environ 19 jours). Ces souris transgéniques possèdent un élément de réponse àl acide rétinoïque lié au lacz qui permet un crible de sélection par la coloration bleue (soit ici la construction RARElacZ). La coloration bleue marque ainsi les zones où l activité acide rétinoïque est effective (objectivée par la production d acide rétinoïque le métabolite actif de la vitamine A ou rétinol). Regardez ainsi au jour embryonnaire E9.5 le massif crâniofacial signalé par une flèche. L'acide rétinoïque est une molécule indispensable au développement, elle peut aussi se révéler un puissant tératogène (c est àdire une substance ou un procédé qui provoque des malformations chez l embryon ou le foetus quand la mère est exposée) affectant en particulier le développement de la face et du palais. 2

1.2. Coupes frontales de souris E10.5 Foxg1 Cre;ROSA26R (source M. RHINN, IGBMC) 1.2. Coupes frontales de souris E10.5 Foxg1 Cre;ROSA26R Sur ces coupes frontales de souris génétiquement modifiées (par une construction différente nommée Foxg1 Cre;ROSA26R) au jour E10.5 du développement embryonnaire, la coloration bleutée (à la béta galactosidase) est un marqueur, entre autre, des dérivés des crêtes neurales et se retrouve tout autour de la cavité buccale (voir flèche) en particulier dans les arcs pharyngés. 3

Jour 21/22 Embryon rectiligne Neuropore cranial Somites Tube neural fermé Neuropore caudal 2. Mise en place de la face 2.1. La semaine 4 Jour 24 Bourgeon frontonasal 1er arc 2ème arc Dépression otique Saillie cardiaque Au début de la semaine 4 du développement humain les régions crâniales et cervicales (cou) constituent environ 1/2 de la longueur de l embryon. La face en développement est représentée par la région frontonasale et le premier arc pharyngé. 2. Mise en place de la face 2.1. La semaine 4 Tout commence àla quatrième semaine du développement. L embryon mesure entre 2 (début) et 5 (fin) millimètres. Les régions crâniales et cervicales (cou) constituent environ la moitié de la longueur de l embryon. Au début de la 4ème semaine, l embryon est encore rectiligne. Les somites forment des saillies nettement visibles àsa surface (le 1er somite est apparu au 20ème jour). Leur nombre sert àexprimer l âge de l embryon jusqu à la fin de la 4ème semaine qui correspond au stade de développement 28 somites. Le tube neural est fermé en regard des somites mais est ouvert au niveau des neuropores. Les plis limitant céphalique et caudal apparaissent respectivement au 22ème et au 23ème jours. Au 24ème jour, le neuropore crânial se ferme. A ce moment les 2 premiers arcs branchiaux sont visibles. Le cœur constitue une volumineuse saillie sous l embryon. Au jour 26, le neuropore postérieur se ferme. Trois arcs branchiaux sont visibles. Il y a apparition au niveau de l encéphale, des courbures mésencéphalique et cervicale. L ébauche du membre supérieur apparaît, les fossettes auditives (dépression otique) sont visibles. Au jour 28, quatre paires d arcs pharyngés sont visibles ainsi que les bourgeons des membres inférieurs et les placodes ectoblastiques cristalliniennes àl origine du cristallin (développement de l œil). La paroi ventrale est pratiquement achevée. 4

2.2. Les semaines 4/5 Bourgeon frontonasal Bourgeon maxillaire Bourgeon mandibulaire 2ème arc 2.2. Les semaines 4/5 La face en développement est représentée par la région frontonasale (en vert) et le premier arc pharyngé (en orangé) scindé en bourgeons maxillaires et mandibulaires. Elle est mise en place au cours du deuxième mois par le développement et la fusion de 5 bourgeons : le bourgeon frontal ou frontonasal (en vert), les deux bourgeons maxillaires, les deux bourgeons mandibulaires. 5

2.3. La semaine 6 Bourgeon frontonasal Bourgeon nasal médial ou médian Bourgeon nasal latéral Depression nasale Bourgeon maxillaire Bourgeon mandibulaire 2ème arc 2.3. La semaine 6 Au cours de la cinquième semaine deux épaississements ectoblastiques ou placodes olfactives ou nasales apparaissent sur les aspects latéraux du bourgeon frontonasal. A la semaine 6 l ectoblaste au centre de chaque placode nasale s invagine pour former une dépression nasale ce qui divise le bord surélevé de la placode en bourgeons nasaux latéraux (externes, en bleu) et médiaux (internes, en jaune). 6

2.4. Les semaines 6/7 semaines 7/8 Bourgeon frontonasal Bourgeon nasal médial Oeil Bourgeon nasal latéral Gouttière naso lacrymale Bourgeon maxillaire Bourgeon mandibulaire Oeil Bourgeon nasal latéral Gouttière naso lacrymale Bourgeon maxillaire Bourgeon mandibulaire 2ème arc 2.4. Les semaines 6/7 semaines 7/8 Les extrémités latérales des bourgeons nasaux médiaux rejoignent les extrémités des bourgeons nasaux latéraux. Les bourgeons nasaux latéraux fusionnent avec les bourgeons maxillaires. Ils participent àla formation des ailes du nez. A la semaine 6, les processus nasaux médiaux se développent pour s unir sur la ligne médiane; ils constitueront la partie médiane du nez. A la semaine 7, ces processus nasaux médiaux s étendent vers le bas et les côtés et fusionnent pour donner naissance au processus intermaxillaire. Les extrémités des bourgeons maxillaires grandissent pour rencontrer le processus intermaxillaire et s unir àlui. La dépression entre le processus nasal latéral et le bourgeon maxillaire est la gouttière naso lacrymale àl origine du conduit lacrymo nasal qui draine l excès de larme de la conjonctive de l œil vers la cavité nasale. Les parties latérales des bourgeons mandibulaires fusionnent avec les bourgeons maxillaires et constituent la partie inférieure de la joue et limitent l ouverture de la bouche. 7

2.5. Visage et nez semaine 7 semaine 10 Aile du nez Dos du nez Pointe du nez Joue Philtrum de la lèvre supérieure Bourgeon nasal latéral Bourgeon nasal médial Processus intermaxillaire Bourgeon maxillaire Bourgeon mandibulaire 2.5. Visage et nez semaine 7 semaine 10 Voici schématisée l évolution des différents bourgeons et les étapes de formation du nez Les bourgeons nasaux latéraux fusionnent avec les bourgeons maxillaires. Ils participent àla formation des ailes du nez. Les bourgeons nasaux médiaux se développent pour s unir sur la ligne médiane; ils constitueront le dos, la partie moyenne et la pointe du nez. Ces bourgeons nasaux médiaux fusionnés constituent le processus intermaxillaire d où dérivent le palais primaire, la partie antérieure de l arcade dentaire maxillaire et le philtrum ou partie moyenne de la lèvre supérieure. Le massif latéral de la face àl origine des parties latérales de la lèvre supérieure et de la joue est constitué par la confluence entre les extrémités des bourgeons maxillaires et le processus intermaxillaire. 8

2.6. Formation des cavités nasales Semaine 6 1 2 Fosse nasale primitive Processus intermaxillaire Membrane bucconasale Cavité buccale Fosse nasale Choane primitif Palais primaire 3 Semaine 7 4 Semaine 9 Palais primaire Palais secondaire Choane définitif 2.6. Formation des cavités nasales Quant àla formation de la cavité nasale, les dépressions nasales s invaginent (semaines 5 6) pour former une cavité nasale unique séparée de la cavité buccale par une cloison épaisse l aileron nasal (6ème semaine). Cet aileron s amincit et forme la membrane bucconasale qui disparait pour constituer le choane primitif (semaine 7). Le plancher de la cavité nasale est alors limité par le palais primaire issu du bourgeon intermaxillaire. Pendant que se forme le palais secondaire, le septum nasal médian formé à partir du bourgeon frontonasal et des bourgeons nasaux médiaux s allonge vers le bas pour fusionner avec la face supérieure du palais primaire et ensuite secondaire, séparant les fosses nasales droites et gauches. 9

3. Formation et ouverture de la cavité buccale Sillon intermaxillaire Stomodeum 3. Formation et ouverture de la cavité buccale Comment se forme plus spécifiquement la cavité buccale? Lors de la formation du mésoderme (3ème semaine du développement embryonnaire), il persiste deux zones circulaires d accolement de l ectoderme et de l endoderme. La membrane du côté céphalique est appelée membrane buccopharyngée, celle du côté caudal est appelée membrane cloacale. Ces membranes deviendront les 2 extrémités de l'intestin primitif. Ala fin du 1er mois, l ébauche de la face est centrée par le stomodeum, ou cavité buccale primitive, qui est limitée : En haut par l'extrémité du bourgeon frontonasal qui renferme l'extrémité antérieure du tube neural et forme le plafond du stomodeum. Plus tard, la cavité buccale sera limitée dans sa partie supérieure par le palais. Latéralement par les bourgeons maxillaires. En bas par les bourgeons mandibulaires qui ont fusionné dès la quatrième semaine et qui forment le plancher du stomodeum. A l'endroit où ils se rejoignent se trouve sur leur partie inférieure une fissure médiane ventrale qui disparaîtra durant la 5ème semaine pour donner la lèvre inférieure. Les bourgeons mandibulaires sont séparés des bourgeons maxillaires par les sillons intermaxillaires. Au début du 2ème mois, la cavité buccale a l'aspect d'une fente élargie. Au cours du deuxième mois, les portions latérales des bourgeons maxillaires et mandibulaires, jusque là séparées par les sillons intermaxillaires, fusionnent pour former les joues qui délimitent définitivement la cavité buccale. La membrane bucco pharyngée se rompt aux environs du 24ème jour et fait communiquer la cavité buccale primitive avec la partie antérieure (pharyngée) de l'intestin primitif. 10

4. 4.1. Aspects moléculaires du développement de la face Souris Poulet Brugmann et al, Am J Med Genet 2006 Reproduit avec la permission de Wiley & Sons, Inc. 4. Aspects moléculaires du développement de la face 4.1. Nous allons aborder quelques aspects moléculaires du développement de la face en examinant les travaux de Brugmann et collaborateurs. Sur ces vues de différents stades de développement de la face de la souris à gauche et du poulet à droite il est possible de repérer le devenir de structures issues du bourgeon frontonasal et leur participation respective àla formation du museau ou du bec. Les stades précoces du développement sont relativement superposables. Looking different: understanding diversity in facial form. Brugmann SA, Kim J, Helms JA. Am J Med Genet A. 2006 Dec 1;140(23):2521 9. Reproduit avec la permission de Wiley & Sons, Inc. 11

Poulet 4.2. Caille Canard Brugmann et al, Am J Med Genet 2006 Reproduit avec la permission de Wiley & Sons, Inc. 4.2. Si l on s intéresse comme Brugmann et collaborateurs à différentes espèces d oiseaux, à partir de stades précoces identiques (17) et de bourgeons frontonasaux pratiquement similaires, il est possible de générer des morphogenèses et morphologies de la face distinctes spécifiques de l espèce. Les variations morphologiques spécifiques de l espèce sont précédées par l expression différentielle de molécules de signalisation de type facteurs de croissance comme Fgf8 (fibroblast growth factor 8, facteur de croissance des fibroblastes 8) ou Bmp4 (bone morphogenetic protein 4, protéine morphogénétique de l os 4) ou comme shh sonic hedghog. Des différences subtiles dans l expression de ces molécules sont àl origine de la diversité de formes. 12

5. Formation du palais Chez les mammifères, Nez le palais secondaire participe à l alimentation Bouche la succion/déglutition la phonation 5. Formation du palais Nous allons maintenant aborder plus en détails la formation du palais véritable toit de la cavité buccale et plancher des cavités nasales. Chez les mammifères il participe à l alimentation, la succion/déglutition et la phonation. 13

5.1. Palais primaire et secondaire * Palais primaire Palais secondaire Palais dur (2/3) * Foramen incisif Palais mou (1/3) 5.1. Palais primaire et secondaire Ce palais se compose de deux parties: le palais primaire en avant du foramen incisif contenant les quatre incisives maxillaires et le palais secondaire subdivisé en palais dur parcouru de reliefs, les rugae, et palais mou ou voile du palais dans sa partie la plus postérieure. Sur le bord postérieur du palais mou se trouve la luette qui lorsque le palais est relâché repose sur la langue. 14

5.2. Origine embryologique du palais Semaine 7 Semaine 10 Palais primaire Palais secondaire Semaine 7 5.2. Origine embryologique du palais Rappelons tout d abord l origine embryologique du palais primaire àsavoir le bourgeon frontonasal via les bourgeons nasaux médiaux ou internes et le processus intermaxillaire du palais secondaire via le premier arc pharyngé et les bourgeons maxillaires. La formation du palais représente un évènement majeur du développement crâniofacial. Elle résulte de la confluence dans une suture en forme de Y de trois bourgeons: le bourgeon prémaxillaire ou palais primaire dérivant du bourgeon frontonasal et les deux processus ou bourgeons palatins, émanations des bourgeons maxillaires. Ce processus morphogénétique aboutit au cloisonnement du stomodeum, ou cavité buccale primitive, en cavité buccale définitive et fosses nasales. La fusion de ces bourgeons implique une jonction (suture) locale de leurs épithélia de recouvrement suivie de la dispersion de cette barrière épithéliale aboutissant à la continuité du mésenchyme. Des perturbations de ces évènements complexes sont àla base d une des anomalies congénitales les plus fréquentes: les fentes palatines. Ces fentes palatines et/ou labiales peuvent être diagnostiquées in utero ou àla naissance. Une fente sous muqueuse peut être plus difficile à mettre en évidence. 15

5.3. Développement du palais secondaire Mésenchyme N E13 d L bp Coupe frontale de la tête d un embryon de souris (E13): Section frontale les cavités nasales (N), les bourgeons dentaires (d), les bourgeons palatins (bp), la langue (L) Epithelium Nasal Epithélium future jonction médiane (MEE) Buccal 5.3. Développement du palais secondaire Sur cette coupe histologique frontale de la tête d un embryon de souris du jour E13 du développement il est possible de repérer la langue (L), les cavités nasales (N), les bourgeons dentaires (d) et les bourgeons palatins (bp). A partir des bourgeons maxillaires s individualisent les bourgeons palatins qui se développent verticalement et parallèlement aux faces latérales de la langue. Le gros plan montre que ces bourgeons palatins sont composés d un corps de mésenchyme et recouvert d un épithélium. Cet épithélium peut être divisé en partie nasale (en vert), en épithélium de la future jonction médiane correspondant à l extrémité du bourgeon palatin) (MEE medial edge epithelium en anglais; en rouge) et en épithélium buccal (en bleu). 16

5.3.1. Développement du palais secondaire Chronologie semaine 7 semaine 9 semaine 12 Max Bourgeon Palatin Processus palatin Palais 2ndaire http://embryology.med.unsw.edu.au/ Croissance Juxtaposition Adhésion Max bp L bp MEE MES Fusion * * E13 E14 E15 E16 5.3.1. Développement du palais secondaire Chronologie La formation du palais qui est très rapide chez la souris soit environ 4 jours s étale de la sixième à la douzième semaine du développement embryonnaire chez l homme. Elle peut être divisée en différents stades: L élévation et la juxtaposition: Les bourgeons palatins (bp) d abord verticaux de part et d autre de la langue (L) se développent, s élèvent, changent d orientation en devenant horizontaux et viennent au contact sur la ligne médiane. L adhésion: Les deux épithélia de recouvrement des bourgeons palatins (MEE medial edge epithelium) adhèrent, s intriquent et forment l épithélium médian de jonction ou MES (medial epithelial seam en anglais). La dispersion/fusion: pour assurer la fusion et la continuité des mésenchymes, les cellules épithéliales doivent se disperser et disparaître. La chronologie du développement du palais chez l homme est la suivante: Semaine 6&7 Le processus intermaxillaire (processus nasaux médiaux) donne le palais primaire Semaines 8&9 les parois médiales des processus maxillaires produisent les processus palatins verticaux parallèles aux faces latérales de la langue Semaine 9 élévation et fusion sur la ligne médiane, constitution du palais secondaire Fusion du palais primaire et secondaire et séparation des fosses nasales de la cavité buccale. 10 jours environ sont nécessaires pour achever la fusion des bourgeons palatins. La dispersion de l épithélium de jonction est souvent incomplète et est associée àla persistance de restes épithéliaux appelés les perles d Epstein sur la ligne médiane du palais. Cette fusion induit la formation d une structure équivalente àune suture qui restera active jusqu à l âge adulte. La fusion du palais est terminée à la semaine 12. 17

5.3.2. Dispersion de l épithélium médian de jonction * continuité du mésenchyme et fusion Mécanismes 1. Transition épithélio mésenchymateuse (EMT) (Gibbins et al, 1999) 2. Apoptose 3. Migration cellulaire 4. Rétraction contraction du feuillet épithélial 5.3.2. Dispersion de l épithélium médian de jonction Revenons à cette étape cruciale du développement du palais qu est la dispersion de l épithélium médian. Quatre mécanismes pourraient expliquer la dispersion de la barrière épithéliale: la rétraction/contraction du feuillet épithélial, la migration des cellules épithéliales de la suture en direction nasale ou orale, l apoptose ou la transition épithélio mésenchymateuse ("trans différenciation"). Les résultats de la littérature suggèrent que les quatre mécanismes sont actifs. Des reconstructions tridimensionnelles dans le plan sagittal ont établi que des zones limitées d apoptose apparaissent au sein de la suture épithéliale la divisant en îlots individualisés. Ces îlots semblent disparaître ensuite par transition épithélio mésenchymateuse. Le facteur de croissance Tgf beta3 est indispensable à la dispersion de l épithélium médian de jonction. Son expression est retrouvée dans l épithélium de jonction avant et pendant la fusion. 18

5.3.3. Après la fusion Jour 1 Postnatal Différenciation cellulaire après fusion Epithélium: Oral, Nasal Mésenchyme: Os, Muscle, Nerf, Vaisseau sanguin 5.3.3. Après la fusion Après la fusion s observent les différenciations cellulaires épithéliales et mésenchymateuses en particulier la formation osseuse. 19

5.3.4. Eléments osseux du palais secondaire Souris CD1 Palais 1 o Palais 2 o Suture palatine médiane Processus palatin du maxillaire Suture palatine transverse Os palatin Abrahams et al., 1998 Homme 5.3.4. Eléments osseux du palais secondaire Voici détaillés sur cette figure les éléments osseux du palais àsavoir le processus palatin du maxillaire et l os palatin séparés par la suture palatine transverse. La suture palatine médiane séparant les processus palatins est également bien visible. Ce schéma explicite également la correspondance des éléments osseux chez la souris et l homme. 20

5.4. Anomalies du développement du palais 5.4.1. Fente labio FL et/ou palatine FP FL/P FL L anomalie congénitale la plus fréquente Prévalence 1:500 à 1:2500 5.4. Anomalies de développement du palais 5.4.1. Les fentes labio FL et/ou palatines FP L'origine embryologique de la fente palatine diffère de celle de la fente labiale mais celles ci peuvent coexister. La prévalence des fentes labiales ou labiopalatines varie de 1 sur 500 à1 sur 2500 naissances, selon l'origine géographique et le groupe ethnique. On distingue donc les FP isolées sans fente labiale de celles associées à une fente labiale ou labio maxillaire. Les FP isolées sans fente labiale représentent 25 30 % des fentes, soit 1 sur 3300 à1 sur 10 000 naissances. On retrouve 20% de formes héréditaires. Les FP associées à une fente labiale représentent 45% des fentes, soit 1 sur 2000 à 5000 naissances. La fente palatine met en communication la cavité buccale avec une seule fosse nasale ou les deux. Environ 70% des fentes labiopalatines sont des anomalies isolées, non syndromiques. 21

5.4.2. Etiologie des fentes palatines 5.4.2.1. Génétique 5.4.2.1.1. Syndromique Maladies monogéniques (Mendel) OFD1: Syndrome Oro facial digital type I (OMIM 311200) TBX22: FP liée à l X et ankyloglossie (OMIM 303400) Craniosynostoses (Apert FGFR2, Saethre Chotzen: TWIST) IRF6 syndrome Van der Woude (OMIM 119300) Aberrations Chromosomiques délétion 22q11 5.4.2.1.2. Non syndromique Mutations TGF beta3 dans certaines populations (Beaty et al., 2002, Jugessur et al., 2003) 5.4.2. Etiologie des fentes palatines 5.4.2.1. Génétique L hérédité des fentes est dites polygénique, multifactorielle. 5.4.2.1.1. Syndromique 30% des fentes labiales ou labiopalatines font partie d'environ 300 syndromes malformatifs différents à hérédité mendélienne (1 gène 1 syndrome; dont le syndrome de Van der Woude cité ici en exemple) dans lesquels, le plus souvent, la fente est une anomalie observée parmi d'autres. Dans le syndrome de Van der Woude la fente peut être associée àdes puits/fissures des lèvres, des dents manquantes ou agénésies dentaires. Le gène responsable IRF6 (situé sur le bras long du chromosome 1 en 1q32 q41) code pour un facteur de transcription appelé facteur de régulation de l interféron 6. 5.4.2.1.2. Non syndromique Des mutations de TGF beta3 sont responsables de fente palatine uniquement sans association avec d autres signes cliniques. 22

5.4.2. Etiologies multifactorielles des fentes palatines 5.4.2.2. Environnement Tératogènes Dioxine (pesticide) Phénytoine Tabac/ Alcool Nutrition Vitamine A (excès/ déficience) Acide Folique Cholestérol Infection ET Génétiques: TGF beta3 TGF alpha RAR alpha 5.4.2.2. Environnement Etiologies multifactorielles Pour les fentes labiales ou labiopalatines non syndromiques, les causes sont souvent complexes et mal connues, multifactorielles mais elles impliquent àla fois les facteurs génétiques (loci TGF alpha; TGF beta3, RAR alpha) environnementaux et toxiques. En effet, les facteurs environnementaux, tels que l'exposition àdes produits tératogènes pendant le premier trimestre de la grossesse (alcool, tabac ou médicaments comme la phénytoine un antiépileptique), peuvent moduler la susceptibilité génétique. 23

5.5. Fentes palatines et modèles animaux 5.5.1. Rongeurs : Rat et *Souris Mammifère Etudes, Elevage Modèlede développement Susceptibilité aux FP C57BL/6 Swiss Webster (CD1) 5.5. Fentes palatines et modèles animaux 5.5.1. La souris est un bon modèle d étude des anomalies du développement. L apparition d une fente palatine chez le souriceau nouveau né est léthale. Il existe une susceptibilité particulière aux fentes palatines de la souche de souris C57BL/6 par rapport àla souche CD1. 24

5.5. Fentes palatines et modèles animaux 5.5.2. Souris Transgénique Inactivation (Knock out) Knockout Conditionnel (Gritli Linde, 2008) Tbx22 Facteur de transcription T box Tgf beta 3 Transforming growth factor beta 3 Tbx22 knockout (Pauws et al., 2009) Tgfβ3 / E16.5 (Taya et al., 1999) 5.5. Fentes palatines et modèles animaux 5.5.2. Il est possible chez la souris d inactiver un gène d intérêt totalement (knock out) ou de manière conditionnelle (par exemple pour différer dans le temps l inactivation) afin de reproduire le phénotype clinique rencontré chez l homme lorsque le même gène est inactivé. La souris permet ainsi l étude des maladies génétiques de l homme. Les souris mutantes pour le facteur de transcription T box Tbx22 /Y pour les males et Tbx22 / pour les femelles montrent des fentes palatines sous muqueuses (b2, c2) ou complètes (b3, c3) et une ankyloglossie reproduisant ainsi le tableau clinique rencontré chez l homme dans ce contexte particulier de fente palatine liée au chromosome X et ankyloglossie. Le frein de la langue est une mince membrane qui relie sa face inférieure au plancher de la bouche. L'ankyloglossie est une malformation de ce frein lingual, trop court ou trop rigide, qui entraîne un déficit de mobilité de la langue. Notez sur l image de microscopie électronique à balayage et les coupes histologiques frontales sériées au jour 16.5 du développement embryonnaire l absence de fusion du palais secondaire en zone antérieure (a) et postérieure (d) chez la souris Tgf beta 3 / (c est àdire après inactivation complète du gène). 25

5.6. Culture organotypique lèvre Palais sur le filtre lèvre Bourgeon palatin milieu Bourgeon palatin Boîte de Petri fusion E13 embryon souris avant la fusion Système de culture en milieu chimiquement défini Palais fusionnés en culture après 2 jours Pungchanchaikul et al, 2005 5.6. Culture organotypique Il est également possible de cultiver en boîte de Petri, sur un milieu chimiquement défini, des bourgeons palatins des souris disséqués avant la fusion au jour 13 du développement embryonnaire et d observer la fusion in vitro après deux jours de culture. 26

5.6.1. FP artificielle Eloignement des bourgeons palatins en culture Contrôle Séparation bp bp N N 7dAF 7dAF E13 = 0hr, fusion = 2 jours en culture cultivés pour 3, 5 et 7 jours après fusion (daf) N: nasal, bp: bourgeon palatin 5.6.1. FP artificielle Eloignement des bourgeons palatins en culture Dans ce système de culture il est possible de créer une fente palatine artificielle mécaniquement en éloignant les bourgeons palatins. Chez les contrôles, la fusion intervient environ 2 jours après le début de mise en culture de bourgeons palatins prélevés à E13.5. Ces explants sont cultivés pour 3, 5 et 7 jours après la date de fusion. 27

5.6.2. Fusion empêchée chimiquement en culture en interférant avec la synthèse protéique 5.6.2.1. Le principe des oligonucleotides antisens transcription traduction T A C T T C T DNA ARNm a u g a a g a t a c t t c t antisens a t g a a g a sens Tgf 3 contrôle 5.6.2. Fusion empêchée chimiquement in vitro en interférant avec la synthèse protéique Il est également possible de traiter les explants avec des oligonucléotides antisens dirigés contre Tgf beta 3. 5.6.2.1. Oligonucleotides antisens le principe Comment cela fonctionne t il? La séquence oligonucléotidique antisens, complémentaire d une séquence spécifique de l ARN messager, se lie à cette dernière et inhibe sa traduction en la protéine correspondante. Dans notre cas il n existe plus de Tgf beta3. La séquence sens est utilisée comme contrôle car elle ne doit pas perturber la traduction. 28

5.6.2.2. FP en culture après traitement par oligonucléotides antisens Tgf beta3 contrôle N sens N antisens N bp bp bp E13 = 0hr, fusion = 2 jours en culture Traités toutes les 12 heures 5.6.2.2. FP en culture après traitement par oligonucléotides antisens Tgf beta3 En traitant les explants avec des oligonucléotides antisens dirigés contre Tgf beta 3, les bourgeons adhèrent mais ne fusionnent pas: l épithélium médian persiste. Il existe donc une fente palatine. Dans les conditions de culture témoin ou contrôle ou en présence d'oligonucléotides sens la fusion des bourgeons palatins s effectue normalement in vitro. 29

5.6.2.3. Efficacité et contraintes de temps des oligonucléotides antisens Tgfbeta3 E13 2d 1d Fusion 1dAF 2dAF * 3dAF fusion fusion fusion bloqué * (Brunet et al., 1995) fusion 5dAF 5.6.2.3. Efficacité et contraintes de temps des Oligonucléotides antisens Tgfb3 Dans nos expériences de culture de bourgeons palatins, le traitement avec les oligonucléotides antisens doit être commencé dès le jour embryonnaire E13 et poursuivi 2 jours après le jour présumé de fusion pour bloquer celle ci. 30

5.6.2.4. 3 jours après la fusion contrôle N antisens O sens Barre=50µm, N: nasal, O: oral 5.6.2.4. 3 jours après la fusion Sur des coupes histologiques de bourgeons palatins traités par antisens Tgfbeta3 on remarque bien la persistance de la ligne épithéliale médiane et ceci même 3 jours après la date de fusion. Notez la disparition de cette ligne épithéliale médiane lorsque les bourgeons sont traités avec des oligonucléotides sens. 31

6. Références Palate development (Chap 38), Bloch Zupan A Oxford Handbook of Applied Dental Sciences C.S. Scully (Ed), 2002. Looking different: understanding diversity in facial form. Brugmann SA, Kim J, Helms JA. Am J Med Genet A. 2006 Dec 1;140(23):2521 9. Testing candidate genes for non syndromic oral clefts using a case parent trio design.beaty TH, Hetmanski JB, Zeiger JS, Fan YT, Liang KY, VanderKolk CA, McIntosh I.Genet Epidemiol. 2002 Jan;22(1):1 11. Variants of developmental genes (TGFA, TGFB3, and MSX1) and their associations with orofacial clefts: a case parent triad analysis.jugessur A, Lie RT, Wilcox AJ, Murray JC, Taylor JA, Saugstad OD, Vindenes HA, Abyholm F.Genet Epidemiol. 2003 Apr;24(3):230 9. Midline fusion in the formation of the secondary palate anticipated by upregulation of keratin K5/6 and localized expression of vimentin mrna in medial edge epithelium.gibbins JR, Manthey A, Tazawa YM, Scott B, Bloch Zupan A, Hunter N.Int J Dev Biol. 1999 May;43(3):237 44. Pathogenesis of cleft palate in TGF beta3 knockout mice.taya Y, O'Kane S, Ferguson MW.Development. 1999 Sep;126(17):3869 79. Tbx22null mice have a submucous cleft palate due to reduced palatal bone formation and also display ankyloglossia and choanal atresia phenotypes.pauws E, Hoshino A, Bentley L, Prajapati S, Keller C, Hammond P, Martinez Barbera JP, Moore GE, Stanier P.Hum Mol Genet. 2009 Nov 1;18(21):4171 9. Epub 2009 Jul 31. The etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models.gritli Linde A.Curr Top Dev Biol. 2008;84:37 138. Review. Gene expression during palate fusion in vivo and in vitro.pungchanchaikul P, Gelbier M, Ferretti P, Bloch Zupan A.J Dent Res. 2005 Jun;84(6):526 31. Inhibition of TGF beta 3 (but not TGF beta 1 or TGF beta 2) activity prevents normal mouse embryonic palate fusion.brunet CL, Sharpe PM, Ferguson MW.Int J Dev Biol. 1995 Apr;39(2):345 55. Embryologie Humaine 2ème édition William J Larsen De Boeck Université (Ed) 6. Références A titre informatif, je vous propose des références ayant servi de base àla construction de ce cours. 32

6.1. Références Internet http://cvirtuel.cochin.univparis5.fr/embryologie/animentre/animentre1.html http://www.embryology.ch/ http://embryology.med.unsw.edu.au/embryo.htm http://www.visembryo.com/baby/index.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/ 6.1. Références Internet Les sites Internet vous permettront d approfondir et de tester vos connaissances. 33