Diagnostic de l infection à VIH DCEM1 année 2008-2009 Diane Descamps, Bénédicte Roquebert, Thomas Mourez
Définition et classification Famille : Retroviridae Sous-famille : Orthoretrovirinae Genre : Lentivirus VIH-1 découvert en 1983, VIH-2 en 1986 Virus enveloppé Virus à ARN sb (2 copies) VIH-1 groupes M (majeur), N et O
Structure génomique des provirus VIH-1 et VIH-2
Diversité génétique des VIH 2 types : VIH-1 et VIH-2 VIH-1 : 3 groupes M N O -groupe M (major) = pandémique 9 sous-types purs A-B-C-D-F-G-H-J-K 37 CRFs (Circulating Recombinant Form) - groupes N (non-m/non-o) et O (outlier) minorité de souches (Afrique centrale) VIH-2 : 8 sous-types A-H (Afrique de l Ouest)
Distribution mondiale des sous-types de VIH-1
Les outils du diagnostic des infections VIH Diagnostic Direct : Mise en évidence de composants du virus lui-même Antigénémie p24 Acides nucléiques sous forme d ARN plasmatique ou d ADN proviral Isolement lymphocytaire et plasmatique Diagnostic Indirect : Mise en évidence de la réponse de l hôte contre l infection Anticorps anti-vih
Diagnostic de l infection VIH Adulte : SEROLOGIE Sauf dans le cas d une primoinfection ou de variants (VIH-1 groupe O, groupe N) Nouveau-né : PCR ou CULTURE
Dépistage des anticorps anti-vih Nécessite obligatoirement, pour chaque sérum, 2 techniques ou 2 réactifs différents: soit 2 réactifs ELISA Mixtes, soit 1 réactif ELISA Mixte et un réactif HIV-1 monospécifique, Soit 1 réactif ELISA Mixte et un test unitaire rapide. Direction Générale de la Santé (08 septembre 1993)
Tests de dépistage des Anticorps anti-vih : Sérologie 1985 Lysats de cellules infectées par le VIH-1 (première génération) Faux négatifs, et spécificité médiocre 1986 Antigènes recombinants produits par génie génétique et peptides de synthèse (deuxième génération) 1987 Tests mixtes de détection des anticorps anti-vih1 et VIH2 1991 Tests sandwich IgG/IgM (troisième génération): - Sensibilité +++ - Spécificité +++ 1997 Tests combinés (quatrième génération) détectant Ac anti-vih1, Ac anti-vih2 et Ag p24. Ag VIH1 groupe M sous type B et VIH1groupe O, Ag VIH2 sous-type A
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Lecture Révélation Substrat de l enzyme Deuxième Ac marqué par une Enzyme Serum du patient Antigène viral Support Traité de virologie médicale, Huraux, Agut, Nicolas, Peigue-Lafeuille
Détection des Anticorps anti VIH Technique Elisa : La plus utilisée Simple Rapide Reproductibilité Sensibilité++++ Spécificité+++ Adaptée à de grandes séries Mise en évidence des Ac 3 semaines après le contage
Dépistage combiné : Ac + Ag (Vidas : HIV Duo ) Diagnostic de l infection 15 à 17 jours après le contage
Tests unitaires rapides Ne nécessitent pas d appareillage sophistiqué 10-20 mn Dépistage des Ac contre le VIH-1 ET VIH-2 NOUVEAUTE 2008 : nouveaux tests rapides combinés Ag/Ac (en évaluation) Lecture visuelle Sensibilité «légèrement» inférieure aux nouvelles techniques Elisa (Pb des séroconversions) Aide au diagnostic d urgence et en situation de détresse matérielle. France : en association obligatoire avec les tests Elisa
Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2
Tests unitaires rapides de détection des anticorps anti VIH-1 et anti VIH-2 négatif positif
TESTS DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTI-VIH-1 ET VIH-2 Agrément par l AFSSAPS : Sensibilité : - panels de séroconversions VIH-1 (50) - VIH-1 groupe M sous-types (150) - VIH-2 (50) - VIH-O (10) Spécificité : 2000 sérums Réévaluation périodique des tests par AFSSAPS Contrôle de qualité des laboratoires, obligatoire, tous les 6 mois
Western-blot (WB) Test de confirmation : OBLIGATOIRE (si + ou discordant) Analyse de la spécificité Antigénique des Ac Spécificité > ELISA mais Sensibilité < ELISA Fractionnement préalable des protéines virales électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide transfert sur un support (nitrocellulose, Nylon) autorisant ELISA WB spécifiques du VIH-1 et du VIH-2 : Si réaction sur les protéines issues des gènes «gag» et/ou «pol» de forte intensité par rapport aux protéines issues des gènes «env», faire un WB VIH-2 et envisager une infection par le VIH-1 de groupe O. Deuxième prélèvement demandé immédiatement
Western-blot (WB) Confirme une séropositivité VIH-1 permet de soupçonner une primo-infection VIH-1 voire une séropositivité VIH-2. Critères de positivité (France) 2 env + gag ou pol
WB VIH-1 indéterminé? Séroconversion VIH-1? Infection par VIH-2? Erreur de tube? Variant?
Diagnostic sérologique des infections par VIH-2 Stratégie identique à celle VIH-1 La réactivité croisée par WB est un problème pour confirmer ou infirmer une infection par VIH-2. Une stratégie utilisant des protéines spécifiques VIH-1 ou VIH-2 avec des tests évitant la réactivité croisée est nécessaire. Pas de critères sérologiques pour les doubles infections VIH-1/VIH-2 Détection génomique : PCR ADN VIH-1 et VIH-2
Différenciation Ac VIH1 / VIH2 La différenciation entre Ac anti VIH-1 et VIH-2 n est pas une obligation légale Recommandée par le groupe ANAES (2000) Peptides synthétiques spécifiques de chacun des 2 virus T- T+ VIH-2 VIH-1 VIH-1+2
WB HIV-1 WB1 WBWB2 HIV-2 VIH-2 sous type A VIH-2 sous type A VIH-2 sous type B
VIH-1 groupe O Environ 100 cas identifiés à ce jour en France et près de 600 au Cameroun Epicentre de l épidémie : Cameroun Grande diversité au sein des VIH-O Parfois mal reconnu au dépistage: possible faible réactivité des EIA et WB le plus souvent indéterminé Non quantifié par les trousses commerciales de charges virales sauf Abbott Généralement résistant aux NNRTI
Cinétique des marqueurs viraux VIH Fenêtre Virologique ARN VIH plasmatique Antigénémie p24 ADN PROVIRAL Fenêtre Sérologique Anticorps anti-vih positifs par ELISA Anticorps anti-vih positifs par WB
VIH - Evolution des marqueurs Contage 10 à 12 jours Fenêtre virologique 2 7 ARN viral plasmatique: 10 à 10 copies / ml 16 jours après contage Ag HIV Fenêtre sérologique 22 à 26 jours après contage Disparition Ag HIV et séroconversion Diminution ARN et plateau
Algorithme sérologique Prélèvement n 1 Dépistage (2 tests) / Prélèvement n 2 Dépistage (2 tests) +/+ ou +/ Déclaration obligatoire Absence d infection en l absence d exposition de moins de 3 mois WB ou IB VIH1 Négatif ou indéterminé Positif Infection à VIH Différenciation VIH-1 / VIH-2 Infection récente? Ag p24 ou ARN VIH VIH2? WB VIH2 Faux positif? Contrôle + M1, M3 Erreur tube? Variant? Tests spécialisés
Diagnostic de la primo-infection Mesure de l ARN-VIH plasmatique qui témoigne d une réplication virale dans l organisme Marqueur le plus précoce, sensibilité 100% Détectable 8-17 j après le contage (vers J11) Au moment du pic : 102 à 107 copies/ml de plasma En l absence de traitement équilibre de la CV à M4-M6 Suivi virologique du patient infecté Obstacle : diversité VIH
Diagnostic précoce de l infection chez l enfant né de mère séropositive Transmission : o 20-30% in utéro o 70-80% en péri-partum Transmission : o 20% sans prise en charge o < 1% si TTT +/- césarienne Estimation de la proportion d enfants infectés par semaine avant l accouchement
Diagnostic précoce de l infection chez l enfant né de mère séropositive Prélèvements de l enfant première semaine, 1 mois, 3 mois et 6 mois de vie prélèvement de la mère en parallèle Techniques détection de l ADN proviral lymphocytaire par PCR 2 PCR successives positives détection de l ARN plasmatique ARN viral négatif avant l âge de 6 semaines si l enfant est traité isolement de virus à partir des lymphocytes à M6 Suivi sérologique après 6 mois (négativation à 18 mois)
Recommandations HAS 2008 Le maintien de la réalisation de deux techniques de dépistage sur le même prélèvement, dans le cadre de l analyse de dépistage des anticorps anti-vih, n est plus justifié en 2008 basée sur o performance des techniques o comparaison de la performance des 2 stratégies Un résultat négatif du test de dépistage ELISA mixte et combiné 6 semaines après l exposition supposée pourra être considéré comme signant l absence d infection par le VIH basée sur performance des techniques
Algorithme sérologique de dépistage Recherche Ac anti VIH-1 et VIH-2 Et Ag p24 par un test combiné - + WB ou IB Différenciation VIH1/VIH2 Absence d infection* + - ou indéterminé Recherche Ac anti VIH-1 et VIH-2 et Ag p24 par un test combiné (2eme prélèvement)** - + Infection VIH confirmée * Sauf exposition supposée au VIH dans les 6 semaines précédentes Si PPE : délai reste 3 mois ** le test combiné peut être identique ou différent du 1er 1 à 2 semaines plus tard Recherche ARN VIH plasmatique ou Ag p24 + Erreur identification Contrôle sérologique Primo infection probable Contrôle Sérologique Absence d infection Probable réaction non spécifique Contrôle Sérologique Explorations complémentaires Variants?
ARN VIH plasmatique Mesure ARN VIH1 plasmatique: paramètre important dans o la suivi du traitement o la décision de changer un traitement Nécessite d avoir 2 mesures de charge virale dans le suivi récent du patient. Le résultat de la charge virale peut varier chez un même patient d un facteur 3 (0,5 log) sur 2 points successifs sans signification particulière. Infections intercurrentes, vaccination peuvent augmenter transitoirement la charge virale.
Détection d acides nucléiques viraux Amplification de la cible : PCR (Polymerase Chain Reaction) Multiplication, de manière exponentielle, d un fragment d acide nucléique (ADN) afin d augmenter la sensibilité de sa détection Amplification du signal: Augmenter le nombre de sondes marquées générant un signal sans modifier la quantité de molécules cibles présentes initialement
PCR : amplification de la cible ARN cible 5 3 ADN cible 5 3 Transcription inverse 3 5 95 C Dénaturation 3 3 5 Cycle 1 5 Hybridation 3 Amplicon 55 C 5 3 72 C Cycle 3 5 3 5 3 5 Elongation Cycle 2
PCR : amplification de la cible multiplication exponentielle n cycles Cycle 3 détection des produits amplifiés à l aide de sondes marquées Quantité théorique de copies générées par PCR en fonction du nombre de cycles : 1 cycle 2 copies 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies. 6 cycles 64 copies. 22 cycles 4194304 copies. 30 cycles 1073741824 copies
PCR temps réel : Gamme de quantification - technologie «Taqman» -Amorces et sondes 10000 copies 5 copies
PCR : amplification de la cible Sondes* marquées et Amplificateur* Technologie b-dna «ADN branché» Pré-amplificateur* ARN cible Label Extender* (LE) Capture Extender (CE) Sonde de Capture Microplaque
ARN VIH-1 Plasmatique Trousses disponibles Bayer Quantiplex bdna 3.0 et Roche Monitor 1.5: PCR classique puis hybridation Roche Cobas taqman / PCR temps réel Biomérieux Nuclisens temps réel Abbott PCR temps réel : quantification des VIH-1 groupe O Ne détectent pas l ARN plasmatique VIH-2
Génotypage Recherche de mutations de résistance aux antirétroviraux
Cas n 1 Un jeune homme de 27 ans et sa fiancée envisagent des rapports sexuels stables sans préservatif. Auparavant le jeune homme juge bon de faire faire une recherche d'anticorps HIV dans son sérum. a) Des deux tests ELISA effectués, l'un est positif, l'autre négatif. Que dire? Que faire? b) Les deux tests ELISA effectués sont négatifs. Que dire? Que faire?
Cas n 2 Un homme de 32 ans homosexuel consulte pour un syndrome grippal associé à une angine et une éruption cutanée maculo papuleuse. Quelles sont les étiologies virales les plus fréquentes à évoquer? La sérologie VIH (ELISA) est discordante : 1 test AC négatif, 1 test Ag/AC positif. Quels examens complémentaires demandez vous pour affiner le diagnostic?
Cas n 3 Après une grossesse sans suivi médical convenable, une séropositivité pour l HIV-1 est découverte chez une femme le jour de son accouchement. Aucun traitement préventif pour la transmission materno-fœtale n a pu être administré, ni à la mère, ni à l enfant. Quels examens faut-il prescrire et à quelles dates pour rechercher une infection par HIV chez ce nouveau-né, qui n est pas allaité?