Applications de la Spectrométrie de Masse au Laboratoire de Microbiologie Pharm Biol Delphine Martiny Departement de Microbiologie CHU Saint-Pierre & Institut Jules Bordet Bruxelles, Belgique
Seng CID 2009
Performances Bizzini CMI 2010 n BD Phoenix Bruker Genre Espèce Genre Espèce Espèces courantes 308 95% 93% 96% 93% Espèces moins fréquentes 132 52% 34% 85% 56% Saffert JCM 2011
Accuracy of API Campy System, Vitek 2 Neisseria-Haemophilus (NH) Card and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for Identification of Campylobacter and related organisms. Identification correcte à l espèce N=234 API Campy Vitek NH Maldi-TOF MS C. jejuni ssp jejuni 94.4% 89.6% 100% C. coli 73.8% 87.7% 100% Other species 47.7% 0% 90.9% All strains 79.9% 72.2% 98.3% Mauvaise identification API Campy Vitek NH Maldi-TOF MS C. jejuni ssp jejuni 0% 10.4% 0% C. coli 4.6% 7.7% 0% Other species 22.7% 69.5% 0% All strains 5.6% 20.1% 0% Martiny CMI 2010
Systèmes disponibles Réflectron? IVD versus RUO? Etude en cours
Préparation de l échantillon Matériel biologique Fraction d une colonie isolée Différents milieux Dépôt direct ou extraction Matrice HCCA Réservées à la recherche: DHB Acide sinapinique Point déterminant: quantité de matériel biologique déposé Contrôles
Principe a b Acceleration Drift + + + + + + Electrodes Detector Laser Desorption/Ionization Intensity Time-of-Flight m/z
Base de données Bruker Nom Comparaison Biotyper Spectres de référence Origine des spectres Souches de référence et clinique Entrées ~ 4000 Base de données complémentaire «bioterrorisme» ~ 100
Resultats Cut-off adaptés? Result Overview Analyte Organism Score Organism Score Name (best match) Value (second best match) Value 1 ( +++ ) 11516 ( +++ ) 13140 ( +++ ) 13220 ( +++ ) 1366 ( +++ ) Campylobacter coli 11167_03 NVU Arcobacter butzleri DSM 7301 DSM Arcobacter butzleri 460_98 NVU Arcobacter butzleri 460_98 NVU Campylobacter coli 11167_03 NVU 2,484 2,414 2,341 2,527 2,407 Campylobacter coli CCUG 11283 NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Arcobacter butzleri 347_98 NVU Campylobacter coli CCUG 11283 NVU 2,446 2,383 2,337 2,488 2,281 Meaning of Score Values Range Description Symbols Color 2.300... 3.000 highly probable species identification ( +++ ) green 2.000... 2.299 secure genus identification, probable species identification ( ++ ) green 1.700... 1.999 probable genus identification ( + ) yellow 0.000... 1.699 no reliable identification ( - ) red
Validation RUO versus IVD Reproductibilité Influence de l âge de la culture Comparaison avec les techniques classiques et adaptation des algorithmes
Reproductibilité ATCC S. aureus 30 analyses -> ID ok -> Scores entre 2.18 et 2.36 Mellmann JCM 2009
Age Culture J3 J4 S. pneumoniae Manuel 2.02 Manuel 2.1 S. agalactiae 2.299 2.313 S. anginosus NPF / E. faecalis 2.318 2.302 K. pneumoniae 2.236 2.38 P. aeruginosa 2.331 2.338 E. coli 2.253 2.356 S. sonnei E. coli 2.04 E. coli 2.072 C. jejuni NPF /
Comparaison avec les techniques classiques: origine des isolats (n=992) Double dépôt
300 Bacilles Gram négatif Nombre d isolats 250 200 150 100 50 Rouge = erreur au genre Jaune = erreur à l espèce Bleu = ID correcte au genre et à l espèce 0 200 CIT ENT ESC MOR PRO PSE SAL SHI SER ACH ACI EIK HAE STE KLE Coques Gram positif Genre Nombre d isolats 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Seulement Biotyper = 4% ENC STA AUR SCN STR HEM STR Genre
1er algorithme: Décembre 2010 Colonie isolée Score <2 -> contamination? Score >2 E. coli, K. pneumoniae and K. oxytoca, E. cloacae et E. aerogenes, P. aeruginosa, C. freundii et C. koseri, S. aureus, SCN -> ok Autres: identification classique
Pratiquement 65% identifiées par MT 32% non validées 3% NRI / NPF / <2 Algorithme évolutif
Dernier algorithme: Mai 2011 41 espèces de 16 genres bactériens Acinetobacter Enterobacter Streptococcus baumanii genomospecies cloacae asburiae kobei ludwigii hormaechei cloacae complexe anginosus constellatus répondre A. baumanii complexe répondre E. cloacae complexe répondre S. anginosus groupe Validation au genre: Acinetobacter, Enterococcus, Staphylococcus, Salmonella, Corynebacterium, Micrococcus
Follow-up: 16 au 29 mai 2011 URI: 144 / 145 ID 99.3% par MT 1 Achromobacter xylosoxydans VRS: 86 / 97 ID 88.6% par MT 9 Haemophilus / Pneumo 1 Hafnia alvei, 1 Klebsiella ozaenae PUS: 216 / 228 ID 94,7% par MT 7 Haemophilus / Pneumo 4 Streptos hémolytiques 1 Providencia rettgeri et 1 Enterococcus casseiflavus HC et dépistages: 76 / 82 ID 92,7% par MT 5 Pneumo / Strepto 1 Salmonella
Follow-up: approximation Biais: flores salivaires, Anaérobies et levures 3% NPF / NRI Total: (552-29)/552= 94.6% Toujours en évolution
Avantages
Rapidité du diagnostic Préparation de la matrice ~ 5 min Extraction, si nécessaire ~ 30 min Préparation de la cible ~ 15 min Liste de travail ~ 5 min Acquisition des spectres ~ 1 min Comparaison à la base de données ~ 1 min Résultats (1 cible complète) ~ 2h
Coût Seng CID 2009
Pratiquement Facile à utiliser Peu de matériel biologique nécessaire Large panel d espèces incluses dans la BD Coprocultures Outil diagnostique
Désavantages
Identification Shigella versus E. coli C. africana versus C. albicans S. pneumoniae versus S. mitis/oralis B. pertussis versus bronchiseptica K. oxytoca versus R. ornitholytica S. maltophilia versus Pseudomonas species Achromobacter species Pseudomonas fluorescens group Burkholderia cepacia complex Bacteroides species Listeria species Enterobacter cloacae complex Aeromonas species Pseudomonas putida group Acinetobacter species
Pratiquement Pas d information sur la résistance aux AB Contaminations (Connexion au LIS) (Nettoyage des plaques) (Préparation de la matrice)
Conclusions Rapide, économique, peu de matériel (bio ou tech) > 90% des souches identifiées sans test compl. Pas de temps épargné au début Workflow à revoir Plus d ID réalisées Découverte de pathogènes potentiels
Perspectives dans notre laboratoire Identification directe sur échantillons (HC) Centrifugations Tampon de lyse Sepsityper kit Yan, JCM 2011 Prod hom JCM 2010 Stevenson, JCM 2010 Ferroni, JCM 2010 Ferreira, CMI 2010 Moussaoui, CMI 2010
Travail de David Fage
Levures Travail de Ann Packeu (ISSP) Extraction courte + cut-offs adaptés Milieux chromogènes Aspergillus, dermatophytes Erhard, Exp Derm 2007 Alliano, CMI 2010 Santos, J Appl Microbiol 2010 Putignani, Mol Biosyst 2011
Bader CMI 2010 Dhiman, JCM 2011
Anaerobies Aurélien Simon validation en cours Expansion de la base de données nécessaire Bacteroides fragilis group CGP anas Total n Sans pré-traitement Avec pré-traitement Après upgrade espèce genre espèce genre espèce genre Bruker 87 [100] 87 100 NA NA 15 Shimadzu 53 93.3 NA NA NA NA Bruker 12.5 37.5 37.5 50 NA NA 24 Shimadzu 83 92 NA NA NA NA Bruker 35.4 51.9 50.6 60.8 63.3 72.2 79 Shimadzu 60.8 70.9 NA NA NA NA Veloo CMI 2011 Veloo Syst Appl Microbiol 2011
Mycobacteries Procédure d inactivation Consortium NTBC Expansion de la base de données nécessaire
Milieu solide Inactivation à la chaleur Upgrade db Procédure d extraction Saleeb, JCM 2011
Demain? Typage? Resistance? Toxicité? Virologie? Génomique?
MERCI DE VOTRE ATTENTION Contact : Pharm Biol Delphine Martiny, Dpt of Microbiology Saint-Pierre Univ Hospital & Jules Bordet Institute Brussels, Belgium E. mail: delphine_martiny@stpierre-bru.be