Rapport d activités du C.N.R. Haemophilus influenzae 2009-2010

Rapport d activités du C.N.R. Haemophilus influenzae 2009-2010 Olivier Gaillot Institut de Microbiologie Centre de Biologie Pathologie CHU de Lille Boulevard du Professeur Leclercq 59037 Lille CEDEX tél. 03 20 44 49 45 olivier.gaillot@chru-lille.fr

Rappel des missions et objectifs du CNR en termes de santé publique : - La mission première du CNR Haemophilus influenzae est le recueil et l analyse des souches de H. influenzae responsables d infections invasives en France. Il alerte la direction de l Institut de Veille Sanitaire et le Ministre de la Santé lors de l augmentation de fréquence ou de gravité des cas. L objectif de cette surveillance est (i) d évaluer la qualité protection vaccinale de la population française vis-à-vis de H. influenzae du sérotype b (Hib), (ii) de caractériser d éventuelles souches virulentes d autres types qui pourraient émerger, (iii) d identifier et décrire les cas groupés d infections. - Le CNR réalise la surveillance de la sensibilité à sept familles d antibiotiques des souches, invasives ou non, qui lui sont adressées. - Le CNR met à la disposition des laboratoires d analyse médicale un support technique au diagnostic des infections à H. influenzae et bactéries apparentées. Ce support inclut : s des techniques phénotypiques (biotypage, sérotypage capsulaire, identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF) ; s des techniques génétiques de typage des isolats (typage des gènes d encapsulation, étude du polymorphisme, détection de gènes de résistance) ; s des techniques génétiques de détection de H. influenzae (capsulé ou non) dans le liquide céphalorachidien. s le dosage des anticorps anti-h. influenzae b dans le cadre exclusif de l exploration des échecs de la vaccination anti-hib. - Le CNR participe à la mise au point, à l évaluation et à la diffusion des techniques et stratégies de diagnostic des infections à H. influenzae. Dans ses domaines d expertise, il répond aux questions que lui soumettent les biologistes et les cliniciens. - Il assure la conservation des isolats cliniques qui lui ont été confiées. Ces souches sont disponibles pour des études à réaliser par le CNR ou par d autres équipes. - Depuis son ouverture en 2009, le CNR participe au programme européen de contrôle des maladies transmissibles (The European Surveillance SYstem, TESSY). Il est membre du consortium européen de surveillance des infections invasives bactériennes (IBD-labnet) du European Centre for Prevention and Disease Control (ECDC, Stockholm, Suède) et participe au contrôle de qualité international mis en place en 2009 par cet organisme. Localisation du CNR : Dans l Institut de Microbiologie du CHU de Lille (Centre de Biologie Pathologie, boulevard du Pr. Leclercq, 59037 Lille CEDEX. Tél. 03 20 44 49 46 ou 54 80). Le CNR fonctionne sans laboratoire associé. Une page web d information et de téléchargement des fichiers relatifs au CNR est consultable à l adresse http://biologiepathologie.chru-lille.fr/organisationfbp/96841.html. Composition de l équipe : - Dr Olivier Gaillot, responsable du CNR. - Dr Frédéric Wallet - M me Valérie Poitevin, technicienne dédiée au CNR.

RÉSUMÉ DES DONNÉES ÉPIDÉMIOLOGIQUES (2009-10) : s La majorité des souches invasives n étaient pas capsulées : 159 souches et 5 échantillons de LCR contenant de l ADN de H. influenzae ont permis de documenter 52 méningites et 105 bactériémies sans méningite : Présentations cliniques des infections invasives à H. influenzae, 2009-2010. 75 % des isolats invasifs étaient non capsulés (n = 118) : Répartition des sérotypes capsulaires des isolats invasifs, 2009-2010. Pour la 1 re fois en France, les isolats capsulés invasifs du sérotype f (n = 19) ont été plus nombreux que ceux du sérotype b (n = 8). Ces derniers ne représentent plus que 6,5 % des isolats invasifs, mais restent responsables d infections sévères chez le jeune enfant lorsque la vaccination est incomplète.

s 1/3 des isolats capsulés reçus par le CNR (13 sur 38) provenaient d un portage respiratoire ou d infections localisées (conjonctivite et rhinite), sans infection invasive associée. Parmi eux, le sérotype e était prédominant (7 isolats sur 13) suivi du sérotype f (4/13). La plupart des isolats capsulés non invasifs (9 sur 13, soit 70 %) provenaient de patients atteints de mucoviscidose. s 10,5 % des isolats de portage respiratoire appartenaient en réalité à l espèce H. haemolyticus. L identification des souches non hémolytique de cette espèce a été obtenue par spectrométrie de masse grâce à une base de donnée spécifique du CNR. s Résistance aux antibiotiques : 15 % des souches produisaient une bêta-lactamase, 15,7 % étaient de sensibilité diminuée à l ampicilline par mutation de cible, 4,4% des souches possédant les deux mécanismes de résistances. Parmi les isolats invasifs, 12,5 % étaient producteurs de bêta-lactamase et 20 % étaient de sensibilité diminuée à l ampicilline par mutation de cible. Tous les isolats reçus au CNR étaient sensibles aux céphalosporines de 3 e fluoroquinolones et à la rifampicine. génération orales et parentérales, ainsi qu aux

DÉTAIL DE L ACTIVITÉ D EXPERTISE (2009-10) 1. Nombre d isolats ou prélèvements (fiches de données) réceptionnés : 938 souches bactériennes ont été adressées au CNR (240 en 2009, 698 en 2010), accompagnées d une fiche de données biocliniques, réparties comme suit : 800 700 600 2009 2010 2009-2010 500 400 300 200 100 0 H. influenzae H. haemolyticus autres espèces 2009 2010 2009-2010 Fig. Proportion d isolats de H. influenzae et d autres espèces bactériennes reçues par le CNR en 2009 et 2010. Le nombre élevé de souches de H. haemolyticus résulte de la difficulté à distinguer cette espèce commensale de H. influenzae. s 709 H. influenzae s 111 (11,7 %) H. haemolyticus. L identification obtenue par MS-MALDI-TOF a été confirmée dans chaque cas par PCR du gène fuck et séquençage du gène reca. Seuls deux de ces isolats ont été responsables d infection invasive (bactériémie sans signe de gravité). s 118 isolats divers, répartis par espèce comme suit : - autres Haemophilus (n = 42) H. parainfluenzae (n = 35) H. parahaemolyticus (n = 5) H. haemoglobinophilus (n = 1) H. paraphrohaemolyticus (n = 1) - Aggregatibacter sp. (n = 42) A. aphrophilus (n = 20) A. segnis (n = 19) A. actinomycetemcomitans (n = 3) - Pasteurella sp. (n = 25) P. multocida (n = 16) P. canis (n = 3) P. stomatis (n = 2) P. dagmatis (n = 2) P. bettyae (n = 1) Actinobacillus hominis (n = 1) - autres (n = 9) Escherichia coli déficient (n = 1) Kingella kingae (n = 2) Bergeyella zoohelcum (n = 2) Capnocytophaga sputigena (n = 1) Bacillus sp. (n = 1) Rhodopseudomonas palustris (n = 1) Mycobacterium fortuitum (n = 1)

s 6 échantillons de LCR et 4 de sang total adressés pour recherche d ADN de H. influenzae. Il n a été détecté d ADN bactérien que dans un seul de ces produits, identifié comme provenant de Neisseria meningitidis. s Échantillons biologiques (n = 18) - 8 échantillons de LCR et 4 extraits d ADN. Le gène ompp2 de H. influenzae a été amplifié dans 3 d entre eux, mais pas le gène bexa caractéristique des souches capsulées. - 6 sérums pour dosage des anticorps anti-hib La plupart ont été conservés dans l objectif d études ultérieures de marqueurs de prédisposition particulière à l infection par H. influenzae. Dans trois cas correspondant des méningites à H. influenzae de type b (Hib), le taux d anticorps spécifiques anti-hib a été déterminé. Un seul des patients présentait un taux significativement faible d anticorps anti-hib en dépit d un schéma vaccinal complet. - provenance des échantillons : à l exception de 3 isolats du sérotype a adressés par le CH de Mayotte, toutes les souches provenaient de France métropolitaine : s 96 centre hospitaliers dont 17 CHU, s 6 laboratoires d analyse médicale de ville. - niveau de caractérisation réalisé : Tous les isolats de H. influenzae ont été biotypés, sérotypés/génotypés s ils étaient invasifs. L absence d encapsulation des isolats invasifs non agglutinés par les antisérums spécifiques a été confirmée par typage génétique du locus cap (amplification du gène bexa négative). En l absence de situation épidémique et de demande particulière, aucun typage épidémiologique poussé (RFLP, MLST) n a été réalisé en 2009-2010. Les isolats d autres espèces ont été identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF, identification confirmée si nécessaire par séquençage de gènes domestiques (soda, reca, et/ou ADNr 16S). - Nombre de souches testées pour leur sensibilité aux anti-infectieux et résultats : La sensibilité à sept familles d antibiotiques au moins [bêta-lactamines (amoxicilline, coamoxiclav, cefotaxime), tétracyclines, macrolides, quinolones, rifampicine, sulfamides et triméthoprime] a été testée sur les 948 isolats de H. influenzae envoyés au CNR.

2. Surveillance de l évolution et des caractéristiques des infections - Définition de l échantillon de souches isolées : 709 isolats de H. influenzae dont : - 52 isolats capsulées (5,5 %), invasifs ou non sérotype a (Hia), n = 3 sérotype b (Hib), n = 12 sérotype d (Hid), n = 1 sérotype e (Hie), n = 13 sérotype f (Hif), n = 23-157 isolats invasifs (16,6 %) 118 non capsulés (75 %) 39 capsulés (figure 2) Fig. 2 (rappel). Répartition des sérotypes capsulaires des isolats invasifs, 2009-2010

- Distribution des infections invasives selon l âge et le sérotype capsulaire - Bactériémies sans manifestation méningée (n = 105) 50 Nombre d isolats 40 30 20 Hia (n = 1) Hib (n = 2) Hie (n = 4) Hif (n = 14) non capsulé (n = 84) 10 0-6 mois 6-24 mois 2-15 ans 15-60 ans > 60 ans groupe d âge Les isolats capsulés ont été responsables de 18 % des cas dans ce contexte. Le sérotype b était quasiment absent, mais responsable de l unique cas d épiglottite documenté en 2010 au CNR chez un enfant de 11 mois n ayant pas reçu la dernière dose du schéma vaccinal.

- Méningites (n = 52) Nombre d isolats 20 15 10 Hia (n = 2) Hib (n = 8) Hid (n = 1) Hie (n = 2) Hif (n = 5) non capsulé (n = 34) 5 0-6 mois 6-24 mois 2-15 ans 15-60 ans > 60 ans groupe d âge Les isolats capsulés ont été responsables de 35 % des cas dans ce contexte. Le sérotype b restait à lui seul responsable de 15 % des méningites tous âges confondus, et de 26 % des méningites chez l enfant de moins de 2 ans (5 cas sur 19 méningites en 2009-2010). Les 5 méningites à Hib chez des enfants de moins de deux ans correspondaient à - un échec vaccinal vrai, documenté par dosage des anticorps spécifiques anti-hib ; - deux cas survenu avant la vaccination (nourrisson de 3 semaines) ; - deux cas survenu entre 9 et 13 mois, chez des enfants n ayant pas encore reçu le rappel/booster du 12 e mois.

s Rôle des souches capsulées dans les infections non invasives (n = 23) Nombre d isolats 10 5 Hib Hie Hif infections génitales Otite moyenne aiguë conjonctivite Origine clinique infection respiratoire infections dans la broncho-pulmonaires mucoviscidose Les souches capsulées étaient rares (1,5 %) lors des infections non invasives à H. influenzae. On remarque toutefois la présence d isolats capsulés de type e dans des infections respiratoires, en particulier dans la mucoviscidose. Le caractère hyper muqueux constant de ces souches pourrait être à l origine de leur capacité à s implanter au niveau de l épithélium bronchique. 3. Surveillance de la résistance aux antibiotiques - définition de l échantillon de souches testées. Tous les isolats parvenus au CNR ont été testés vis-à-vis de 7 familles d antibiotiques. Les isolats invasifs ont été distingués des isolats de portage et d infections localisées. - définitions utilisées pour exprimer la résistance. Les critères retenus sont ceux du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (2010). Les résultats de sensibilité aux bêta-lactamines correspondent à des mesures par microdilution en milieu liquide, ceux des autres antibiotiques à des mesures par dilution en milieu gélosé.

- résultats : s Sensibilité aux bêta-lactamines : 13 % des souches produisaient une bêta-lactamase, 18 % étaient de sensibilité diminuée à l ampicilline par mutation de cible, 3,9 % des souches possédant les deux mécanismes de résistances. Parmi les 157 isolats invasifs, 9,2 % étaient producteurs de bêta-lactamase et 14,7 % étaient de sensibilité diminuée à l ampicilline par mutation de la PLP3, cible de l antibiotique. Ce mécanisme de résistance étaient cependant sans impact sur la sensibilité constante aux céphalosporines de 3 e génération orales (cefpodoxime et céfixime) et parentérales (ceftriaxone et céfotaxime), ainsi qu au méropénème (CMI < 0,1 µg/ml). 90 % des isolats invasifs de sensibilité diminuée à l ampicilline par mutation de la PLP3 étaient non capsulés. Quinze des 50 isolats d otites recueillis (30 %) étaient de sensibilité diminuée à l ampicilline par modification de la PLP3, la CMI d amoxicilline étant égale à 8 µg/ml pour 2 d entre eux, responsables d échecs thérapeutiques au coamoxiclav. s Sensibilité aux fluoroquinolones : tous les isolats étaient très sensibles à la ciprofloxacine (CMI < 0,01 µg/ml). Six (0,8 %) présentaient cependant une sensibilité diminuée à l acide nalidixique (4 µg/ml < CMI 16 µg/ml), ce qui suggère l acquisition d un premier niveau de résistance par mutation de gènes de topoisomérases, cibles des quinolones. Cinq de ces 6 isolats provenaient de prélèvements respiratoires de patients atteints de mucoviscidose. Aucun n était associé à une infection invasive. s Sensibilité à la rifampicine : tous les isolats testés étaient sensibles à la rifampicine. s Sensibilité aux cotrimoxazole : selon les critères du CA-SFM, 518 isolats (73 %) étaient sensibles au cotrimoxazole, mais parmi ceux-ci, 424 (soit 82 % des isolats sensibles au cotrimoxazole) étaient résistants aux sulfamides. Les 27 % de souches résistantes possédaient une résistance acquise au triméthoprime. s Sensibilité aux tétracyclines : 28 isolats (4,1%) étaient résistants (CMI > 2 µg/ml) à la tétracycline. s Sensibilité aux macrolides : aucune résistance acquise de haut niveau aux macrolides (CMI d érythromycine < 16 µg/ml) n a été détectée parmi les 709 isolats testés. - analyse des tendances. La résistance à l ampicilline tous mécanismes confondus semble en légère diminution par rapport aux années 2005-2007, et les bêta-lactamines recommandées pour le traitement probabiliste des infections invasives restent constamment actives in vitro (aucune souche ne présentait une CMI de ceftriaxone 0,125 µg/ml).

4. Détection et investigation des cas groupés et des phénomènes anormaux Il n y a pas eu de cas groupés ni de phénomènes anormaux en 2009 et 2010, et pas de transmission nosocomiale détectable. L épidémie grippale a en particulier été sans impact notable sur le nombre d infections signalées au CNR. 6. Techniques développées en 2010 : s Détection de H. influenzae (capsulé ou non) dans le liquide céphalo-rachidien par PCR. s Multilocus sequence typing pour pallier le faible pouvoir discriminant de la RFLP dans l analyse des isolats capsulés et pour une comparaison reproductible des isolats non capsulés. Les sept gènes cibles du schéma international (adk, atpg, frdb, mdh, pgi, reca et fuck) peuvent être amplifiés, séquencés au CNR, et leur polymorphisme analysé en ligne (http://haemophilus.mlst.net). s Application de la spectrométrie de masse MALDI-TOF à l identification de H. influenzae et des espèces proches. Une banque de données spectrales de toutes les espèces de Pasteurellaceae a été constituée et validée sur plus de 1 500 isolats cliniques.

ANNEXE Liste des marqueurs épidémiologiques disponibles au CNR s Biotype, antibiotype ; s Sérotype et génosérotype capsulaire ; s Polymorphisme de macrorestriction (RFLP) ; s Polymorphisme de MLST. Collections de souches, antigènes ou immun-sérums de référence : s Trois souches de référence pour contrôle de qualité de l antibiogramme, ATCC 49247, ATCC 49766 et ATCC 10211. s Ne fabriquant pas d immun-sérums, le CNR ne peut les fournir à ses correspondants. Liste des techniques de diagnostic/identification recommandées par le CNR : s Les procédures d identification conventionnelles et de caractérisation génétique des souches de H. influenzae sont fournies sur demande aux correspondants du CNR. Les séquences d amorces et conditions de PCR que nous utilisons sont également fournies sur simple demande. s Des recommandations relatives à la mesure de la sensibilité aux antibiotiques ont été récemment réactualisées par le CNR, dans un souci d harmonisation avec les recommandations européennes de l EUCAST. Elles sont fournies aux laboratoires qui en font la demande, en attendant leur prise en compte par le Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie. s Chapitre 34 consacré à l antibiogramme de H. influenzae dans l ouvrage «Antibiogram», P. Courvalin, R. Leclercq et L. B. Rice, eds. ASM Press, Washington 2010/ESKA, Paris 2010. Traduction et mise à jour du même chapitre dans la 3 e édition de l ouvrage «L Antibiogramme» de P. Courvalin, R. Leclercq et E. Bingen, éditions ESKA, Paris 2011.