EXPLORATION DE L HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV Les tests de détection de l IFN-γ (IGRAs) dans l aide au diagnostic de tuberculose Le test ELISPOT dans l hypersensibilité retardée aux médicaments LAURE DENIS Laboratoire d Immunologie Pr. BIENVENU, CHLS DES/DESC Immunologie 15 Mars 2012
EXPLORATION DE L HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV LE TEST QUANTIFERON et T-SPOT-TB DANS L AIDE AU DIAGNOSTIC DE LA TUBERCULOSE LATENTE
INTRODUCTION - RAPPELS Individus contagieux BK Contamination aérienne Individu(s) contact(s) Première cause de mortalité infectieuse dans le monde (1 à 2 millions de décès / an) Incidence : 9 millions Guérison apparente Tuberculose latente Réactivation Immunodépression Sujets âgés Forme pulmonaire Primo-infection Tuberculose maladie Jeune âge (<4 ans) Quantité importante de BK Immunodépression Forme extra pulmonaire Prévalence de la Tuberculose maladie > 14 M (1/3 de la population infectée susceptible de développer la maladie) La France pays de faible endémie (Ile de France et Guyane +++) - Dans 90-95% des tuberculoses infection récentes, la prolifération de M. tuberculosis est contrôlée par les défenses immunitaires : tuberculose infection latente - Dans 5 à 10% des cas, la TIL évolue en tuberculose active ou tuberculose maladie (pulmonaire dans ¾ des cas) dont 50% dans les 2 ans suivant l infection.
REPONSE IMMUNITAIRE (1)
REPONSE IMMUNITAIRE (2) LES CELLULES Les monocytes - macrophages - Immunité non spécifique : phagocytose des bacilles formation d un foyer infectieux local - Immunité spécifique : présentation antigénique aux LyT dans les ganglions lymphatiques régionaux réponse cellulaire Th1 Les lymphocytes - Activation des Ly T CD4+ avec sécrétion d IFN-γ et TNF-α - Activation des Ly T CD8+ cytotoxiques (perforine, granzyme), sécrétion d IFN-γ -Ly γδ TCR+ limitent la multiplication précoces des bacilles (CK, cytotoxicité), jonction immunité naturelle et immunité spécifique - Ly TCD1 restreints reconnaissent les Ag de nature lipidique (CK, cytotoxicité) - Ly T mémoires centraux : mémoire immunitaire durable
REPONSE IMMUNITAIRE (3) LES CYTOKINES IFN-γ sécrété par les LyT spécifiques activation des macrophages IL-12 synthétisée par les macrophages activés. Orientation de la réponse T vers un profil Th1 (IFN-γ) TNF-α synthétisé par les macrophages, LyT, cellules dendritiques. Réaction inflammatoire responsable de la formation du granulome, activation des macrophages
LES OUTILS DE DIAGNOSTIC INDIRECT -Test cutané : Intradermoreaction à la tuberculine -Tests de détection de l IFN-γ (IGRAs Interferon-gamma-release Assays) Measurement of induration and erythema Measurement of IFN-γ production
INTRADERMOREACTION A LA TUBERCULINE (IDR) Test cutané qui explore in vivo l HSR par l injection de composants antigéniques mycobactériens. Source antigénique : > 200 protéines de M.tuberculosis Lecture à 72h par mesure du diamètre d induration en mm Seuil de positivité Virage tuberculinique LES LIMITES DE L IDR l'idr présente des problèmes de performance et de logistique : Subjectivité Sensibilité moyenne Effet Booster Nécessité de 2 visites La faible spécificité : Réaction croisée avec le BCG Mycobactéries non tuberculeuses (NTM)
TESTS DE SECRETION DE L IFN-γ (IGRAs) Détection in vitro de la production d IFN-γ par les lymphocytes T spécifiques de M.tuberculosis après stimulation avec des protéines mycobactériennes - Test ELISA QuantiFERON-TB Gold in tube (dernière version) - Test ELISPOT T-SPOT-TB Mesure de l IFN-γ La production d IFN- γ témoigne de la réponse cellulaire. Les lymphocytes T produisent de l IFN-γ lorsqu ils sont stimulés par des antigènes Sécrété, mesurable et stable Dans la plupart des cas, absent de la circulation Littérature démontrant le rôle important de l IFN-γ dans l infection tuberculeuse
SELECTION D ANTIGENES SPECIFIQUES Evolution du substrat antigénique grâce au séquençage complet de M.tuberculosis Antigènes specifiques de M. tuberculosis Codage par les gènes de la région RD-1 Antigènes communs avec le BCG Codage par la région RD-1 Antigènes spécifiques : ESAT-6, CFP-10 et TB 7.7 Absents du BCG Absents dans la plupart des MNT Induisent la sécrétion d IFN-γ Identifiés par immunologie, biologie moléculaire
Specificité d ESAT-6, CFP-10 et TB-7.7 Complex Tuberculosis ESAT Antigènes CFP TB-7.7 Mycobactéries non -TB ESAT Antigènes CFP TB-7.7 M tuberculosis M africanum M bovis Souches BCG gothenburg moreau tice tokyo danish glaxo montreal pasteur + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - M abcessus - - M avium - - M branderi - - M celatum - - M chelonae - - M fortuitum - - M gordonii - - M intracellulare - - M kansasii + + M malmoense - - M marinum + + M oenavense - - M scrofulaceum - - M smegmatis - - M szulgai + + M terrae - - M vaccae - - M xenopi - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
DIFFERENCES TESTS IGRAs / IDR Avantages des tests IGRA sur l IDR Pas de seconde visite Peu d effet booster in vivo des réponses immunes Reproductibilité des tests et réactifs Résultat objectif Spécificité +++ (BCG, Mb atypiques) Contrôle + : mise en évidence des faux négatifs Différence des cellules T détectées : - IGRAs : T mémoires effectrices et T effectrices : infections récentes - IDR : T mémoires effectrices et T effectrices + T mémoires centraux
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (1) LE TEST QUANTIFERON-TB GOLD IN TUBE
Le test QuantiFERON -TB Gold IT PRINCIPE Test ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) Dosage sur sang total (prélevé sur tubes héparinés) Incubation des cellules mononucléées du sang périphérique avec les protéines mycobactériennes Décantation du plasma Dosage de l IFN-γ par technique ELISA (UI/mL) Validation du test avec un témoin négatif et un témoin positif
Le test QuantiFERON -TB Gold IT PHASE PREANALYTIQUE (1) Le prélèvement Stockage des tubes à température ambiante -Prélèvement : 3 x 1 ml - Agitation douce par retournements (x5) - Incubation à 37 C 16 à 24h
Le test QuantiFERON -TB Gold IT PHASE PREANALYTIQUE (2) Conservation Après 16 à 24 H à 37 C Centrifugation des tubes : décantation Réalisation du dosage ELISA immédiatement ou après conservation à 4 C pendant plusieurs jours (IFN-γ stable)
QuantiFERON -TB Gold IT Etape 1: incubation sur sang total hépariné Nil Control ESAT-6 CFP-10 Mitogen Control 1. 1mL de sang (X3) et incubation à 37ºC pdt 16-24 h. Etape 2: Dosage ELISA de l IFN-γ 2. Centrifugation pdt 15 minutes. IFN-γ stable à 4 pdt au moins 4 semaines. 3. Plasma +conjugué. Incubation 2H à température ambiante. 4. Lavage puis addition du substrat.lecture des DO après 30mn. 5. Calcul et impression des résultats
Le test QuantiFERON -TB Gold IT RESULTATS ET INTERPRETATION Nul Témoin Tube gris TB Ag Nul Tube patient Tube rouge Mit Nul Témoin + Tube violet Résultat 8 < 0.35 0.5 NEGATIF 8 0.35 0.5 POSITIF 8 0.5 ININTERPRETABLE Abs ctrl positif 8 ININTERPRETABLE Activation spontanée CELLESTIS
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (2) LE TEST T-SPOT-TB
LE TEST T-SPOT-TB Etape 1 Préparation des cellules Prélèvement de sang dans un tube Vacutainer CPT centrifugation du tube Pipetage de la bande correspondante aux lymphocytes Lavage et comptage cellulaire (cellule ou automate d hématologie) Ajout des cellules aux plaques 96 pts Ajout des antigènes dans les puits (ESAT- 6, CFP-10) Incubation 16 à 24h PBMC après extraction Ficoll ou tubes BD CPT Ajout des PBMC et Ags TB. Les Ly T spé sécrètent l IFN-γ. Capture de l IFN-γ par les anticorps. Incubation.
LE TEST T-SPOT-TB Etape 2 Révélation des spots Premier lavage des plaques Addition de réactif de détection 1h Deuxième lavage des plaques Addition du substrat : les spots apparaissent en 7 minutes Dernier lavage des plaques et séchage - + Chaque spot correspond à une cellule sécrétrice d IFN-γ Lavages et ajout de l Ac conjugué Ajout du substrat et comptage des spots
LE TEST T-SPOT-TB Etape 3 Comptage des spots - Comptage possible à l oeil à l aide d une loupe binoculaire ou d un microscope - Comptage à l aide d un lecteur automatisé Elispot : Lecture automatisée des plaques Calcul du nombre de spots par puits Stokage des images sur PC Paramétrage automatique de la caméra et de l analyse Validation : nb de spots panel A Témoin nég et/ou panel B Témoin nég 8 : POSITIF nb de spots panel A Témoin nég et/ou panel B Témoin nég 4 : NEGATIF nb de spots panel A Témoin nég et/ou panel B Témoin nég 5 et 7 : DOUTEUX
LE TEST T-SPOT-TB EXEMPLES SUJETS TEMOINS/ SUJETS TUBERCULOSE Témoin négatif Témoin positif Panel A Panel B
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (3) INTERPRETATION CLINIQUE ET BIOLOGIQUE
Interprétation clinique et biologique INTERPRETATION D UN TEST POSITIF RESULTAT POSITIF = - fréquence élevée de Ly T effecteurs/ T effecteurs mémoires spécifiques de M. tuberculosis : rencontre de M. tuberculosis faux positifs rares (M. kansasii, M. marinum, M.szulgai <200 cas / an en France) - Risque de réactivation M. tuberculosis si immunodépression (infection VIH, tt anti-tnf) Les IGRAs ne distinguent pas infection et maladie ne sont pas des tests diagnostiques de la tuberculose maladie
Interprétation clinique et biologique RESULTATS ININTERPRETABLES Absence d activation dans le contrôle positif (PHA Phytohémagglutinine) : Indication sur la compétence immunitaire du patient (âge, déficit ) Validation de la conservation des prélèvements avant incubation et de la manipulation. Activation spontanée dans le contrôle négatif : Infection, inflammation
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (4) PERFORMANCES
Performances EVALUATION CLINIQUE DU QuantiFERON -TB Gold Pas de Gold Standard pour l ITL Sensibilité calculée sur population de Tuberculose maladie non traitée. Confirmée par culture et/ou PCR (Gold Standard) Spécificité estimée sur population à bas risque (personnes saines non vaccinées) Détection de l ITL Corrélation avec facteurs de risque Etude autour d un cas Dépistage des personnels soignants
Performances PERFORMANCES DIAGNOSTIQUES Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137;952-968 Etudes analysées : 676 citations 124 études retenues (exclusions : edito, medico-economique, revues, lettres, case report, données insuffisantes ) Sensibilité : 40 études Spécificité : 7 études R. Indéterminés : 116 études
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137;952-968 RESULTATS SENSIBILITE Pays en développement
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137;952-968 RESULTATS SPECIFICITE
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137;952-968 RESULTATS INDETERMINES Population immunodéprimée
Evidence-Based Comparison of Commercial Interferon-gamma Assays for Detecting Active TB : A Metaanalysis R. Diel, R. Loddenkemper and A. Nienhaus Chest 2010;137;952-968 CONCLUSIONS Meilleure performance diagnostique des tests IGRAs par rapport à l IDR (supériorité des IGRAs dans les pays développés) Meilleure sensibilité du T-SPOT-TB par rapport au QFT TB Gold IT Meilleure spécificité du QFT TB Gold IT par rapport au T-SPOT-TB Résultats indéterminés T-SPOT-TB > QFT TB Gold IT IDR avant IGRAs non recommandée
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (5) UTILISATIONS
RECOMMANDATIONS (1) EN FRANCE Recommandations de dépistage de l infection tuberculeuse latente et de la tuberculose maladie dans certaines populations considérées à risque d être infectées, malades et/ou contagieuses : Les personnes infectées par le VIH Les sujets contacts d un cas index contagieux Les professionnels de santé et autres professionnels exposés à l embauche en cours d activité professionnelle selon le niveau de risque Les populations migrantes originaires de pays d endémie Les patients avant mise sous traitement anti-tnf alpha
RECOMMANDATIONS (2) RECOMMANDATIONS HAS 2006 - Diagnostic de tuberculose-infection latente pour réaliser l enquête autour d un cas (sujet > 15 ans) - Lors de l embauche, pour les professionnels de santé et ceux qui travaillent dans un service à risque, c est-à-dire dans les mêmes conditions que celles préconisées par les recommandations sur l IDR - Aide au diagnostic des formes extrapulmonaires de la tuberculose maladie - Avant mise en route d un traitement par anti-tnfα
RECOMMANDATIONS (3) RECOMMANDATIONS HCSP (Haut Conseil de la Santé Publique) 2011 Utilisation stricte des tests IGRA dans le seul diagnostic de l ITL et uniquement dans l objectif de la traiter (sauf cas particulier) - Diagnostic de TIL : réduire le réservoir de patients infectés : - Enquête autour d un cas : prise en charge des sujets contacts enfants > 5 ans sujets âgé > 80 ans - Patients infectés par le VIH (bilan initial) - Dépistage avant mise sous anti-tnf - Personnel de santé (y compris stagiaires et étudiants) : embauche (si IDR > 5 mm) cas contact - Migrants entre 5 et 15 ans - Diagnostic de tuberculose maladie : - Chez l enfant
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (6) BIBLIOGRAPHIE
QFT-TB Gold IT chez les patients sous traitement immunosuppresseur Matulis et al. American College of Rheumatology, San Diego, CA. November 2005 Comparison of in vitro-specific blood tests with tuberculin skin test for diagnosis of latent tuberculosis before anti-tnf therapy Sellam J. et al. Ann. Rheum Dis. 2007;66(12):1610-5 Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases: performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen-specific interferon gamma assay Matulis G. et al. Ann Rheum Dis. 2008;67(1):84-90 Les anti TNF-α réduisent la réactivité avec le tube mitogène. Les autres traitements immunosuppresseurs n ont pas ou peu d effets (corticoides ) La performance du test QFT-TB Gold IT est meilleure que celle de l IDR pour la détection des LTBI chez les patients sous immunosuppresseur Bonne performance des IGRAs dans le diagnostic de LTBI dans les IMID (Immune mediated inflammatory diseases) Le QFT-GIT peut être recommandé pour la détection de l ITL avant traitement anti-tnf-α.
LES TESTS IGRA DANS LE DEPISTAGE DE LA TB LATENTE AVANT MISE SOUS ANTI-TNF ETUDE ETAT Objectif : Evaluer l impact thérapeutique (% de patients pour lesquels la décision thérapeutique antitb a été modifiée par les résultats des tests in vitro par rapport aux recommandations de l AFSSAPS) du dépistage de la TBIL par QFT ou T-SPOT-TB avant traitement par anti-tnf-α 20 centres, 400 patients, durée 24 mois / PR, spondylarthrite, maladie de Crohn Résultats 31,8% PR, 45% SPA, 23,2% Crohn (60% immunosuppresseurs, 36,4% corticoides) 34,9% patients IDR > 5 mm / 16,7% patients IGRA positif 30,8% discordance IDR/IGRA (IDR+/IGRA- : 80% et IDR-/IGRA+ : 20%) Bonne concordance pour les deux tests IGRA Meilleure sensibilité du QFT/T-SPOT-TB Résultats indéterminés : 7,3% T-SPOT-TB et 2,8% QFT (pas d influence de la prise de corticoides ou d immunosuppresseurs) Conclusion Les tests IGRA permettent de diminuer de 50% le nombre de patients «TBLI» Attention : cas de TB avec IGRA négatif
QFT-TB Gold IT chez les patients HIV positifs Brock et al. Respiratory Research. 2006 599 HIV positifs 28 (4.8%) sont QFT-Gold positifs indiquant une ITL 87% ont au moins un facteur de risque de TB 22 (3.57%) ont un résultat indéterminé Forte corrélation entre le taux de CD4 et le taux de IFN-γ dans le tube mitogéne (P<0.01) 2 QFT-Gold positifs ont développé une tuberculose Log 10 Response to mitogen (IU/ml) 100 10 1 0.1 0.01 Correlation between CD-4 cell count and response to PHA 0-99 100-199 200-300 >300 CD 4 cell count (cells/microliter) Interferon gamma release assay in people infected with immunodeficiency virus Bua A. Clinical microbiology and infection : The official publication of the european society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2010 Performance of a Whole-Blood Interferon-Gamma Release Assay with Mycobacterium RD1- Specific Antigens among HIV-infected Persons. Fujita A. Clin. Dev. Immunol.2010 Le nombre de TCD4, leur pourcentage et le stade de la maladie affectent les performances des tests IGRAs chez les patients HIV
LES TESTS DE SECRETION D IFN-γ (7) CONCLUSIONS
CONCLUSIONS (1) INTERETS DES IGRAs Tests diagnostiques de l infection tuberculeuse latente (LTBI) Excellente valeur prédictive négative dans les TB latentes (pas besoin de suivi) Excellente spécificité / élimination des faux positifs liés au BCG préalable Intérêt dans les formes extra pulmonaires Chez les immunodéprimés, même si la sensibilité est modérée chez ce groupe de patients (ne peut exclure une TB ou LTBI)
CONCLUSIONS (2) LIMITES DES IGRA Les IGRAs : ne sont pas des tests diagnostiques de la TB Ne permettent pas de distinguer TB active et TB latente Ne permettent qu exceptionnellement d exclure une TB active (recherches bactériologiques) Ne sont pas validés chez le jeune enfant (< 5 ans) Ont une sensibilité diminuée chez la personne âgée Données insuffisantes pour suivre l efficacité d un traitement pour TB active ou latente Ont une sensibilité diminuée chez les immunodéprimés
ETAT DES LIEUX DE LA PRESCRIPTION DU TEST QUANTIFERON AUX HOSPICES CIVILS DE LYON
EVOLUTION DES PRESCRIPTIONS DU TEST QUANTIFERON TB GOLD IT DEPUIS 2008 Nombre de tests réalisés 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Total Moyenne/mois 5344 3245 2265 1610 134 189 270 445 2008 2009 2010 2011
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR HOPITAL EN 2010 (PNEUMO- CARDIOLOGIQUE 3% NEUROLOGIQUE 1% HENRI GABRIELLE 1% CHARPENNES 0% HFME 1% PIERRE GARRAUD 0% A. CHARIAL 0% AUTRES 1% LE VINATIER 2% EDOUARD HERRIOT 24% LYON SUD 37% HOTEL DIEU 16% CROIX ROUSSE 14%
REPARTITION DES PRESCRIPTIONS DU QFT PAR SERVICE AUX HCL EN 2010 Ophtalmologie 4% Pneumologie 4% Maladies Infectieuses 11% Gyneco Obstétrique Cardiologie 1% 1% Néphrologie 1% Neurologie 1% Pédiatrie 1% Hématologie 1% Autres 4% Médecine travail 21% Médecine statutaire 12% Hépato-Gastro- Entérologie 3% Allergologie 2% Dermatologie 5% Rhumatologie 14% Médecine Interne 15%
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (1) POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE 100% 5,6 4,3 2,42 4,14 4,15 80% 60% 75,5 93,61 88,13 40% 20% 0% 16,6 9,84 7,7 2749 579 337 Total Médecine travail Médecine statutaire
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (2) POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE 100% 4,76 2,91 2,84 5,67 9 7,8 5 80% 60% 90,4 73,76 66,3 81,7 40% 20% 0% 11,9 17,73 16,9 13,3 378 141 89 60 Rhumatologie Dermatologie Hépato-Gastro- Entérologie Allergologie
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (3) POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE 100% 11,55 5,89 9,2 3,7 8,7 9,56 2,88 80% 60% 53,1 49,56 82,7 67,57 40% 20% 33,9 32,17 14,99 14,42 0% 407 292 115 104 Médecine Interne Maladies Infectieuses Pneumologie Ophtalmologie
REPARTITION DES RESULTATS (POSITIF/NEGATIF/DOUTEUX/ININTERPRETABLE) PAR SERVICE (4) POSITIF NEGATIF DOUTEUX ININTERPRETABLE 100% 80% 16,6 6,7 10,7 16 10 10 6,25 7,6 2,8 60% 40 64,3 60 72,7 50 75 61,3 40% 20% 0% 36,7 25 24 27,3 30 28,3 18,75 30 28 25 22 20 16 106 Néphrologie Cardiologie Gyneco Obstétrique Neurologie Pédiatrie Hématologie Autres
EXPLORATION DE L HYPERSENSIBILITE DE TYPE IV LE TEST ELISPOT DANS L EXPLORATION DE L HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS
Introduction (1) HYPERSENSIBILITE RETARDEE AUX MEDICAMENTS Diagnostic : démonstration de la présence de lymphocytes T spécifiques dans la peau et le sang Tests in vivo cutanés : patch test et IDR à lecture retardée Tests biologiques in vitro :détection des LyT spécifiques du médicament
Introduction (2) TESTS BIOLOGIQUES UTILISEES DANS L HSR AUX MEDICAMENTS - Test de transformation lymphocytaire (TTL) : test de référence Suivi de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine tritiée - Test d activation lymphocytaire en cytométrie - Test ELISPOT (Enzyme-Linked-ImmunoSPOT assay) Dosage de la sécrétion de cytokines après activation des LyT spécifiques de ces médicaments
Tests Biologiques in vitro (1) TEST DE TRANSFORMATION LYMPHOCYTAIRE Ficoll Sang hépariné PBMC 5 j Culture PBMC Milieu de culture Médicaments à tester Ajout Thymidine tritiée 12 h Mesure de l incorporation de thymidine Témoin positif Témoin négatif The Lymphocyte transformation test in the diagnosis of drug hypersensitivity. Pichler WJ et al, Allergy, 2004 Long-Lasting reactivity and high frequency of drug-specific T cells after severe systemic drug hypersensitivity reactions. Beeler A et al, J Allergy Clinical Immunol, 2006 Index de stimulation (SI) = cpm avec l antigène / cpm sans l antigène Avantages : Mesure de la prolifération cellulaire Bonne spécificité 95% Inconvénients : sensibilité 60-70% (β-lactames) radioactivité 5 jours de culture
Tests Biologiques in vitro (2) TEST D ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE EN CYTOMETRIE Utilisation de marqueurs d identification et/ou d activation Mise en évidence des marqueurs de cytotoxicité CD69 up regulation on T cells as an in vitro marker for delayed-type drug hypersensitivity Beeler A et al, Allergy 2008 In vitro detection of cytotoxic T and NK cells in peripheral blood of patients with various drug-induced skin diseases Zawodniak A et al, Allergy, 2010
Tests Biologiques in vitro (3) TEST ELISPOT - PRINCIPE - Technique permettant la numération, même pour de très faibles fréquences, de cellules spécifiques, d un haptène ou d un peptide. Ac capture spécifique de l IFN-γ Ajout des cellules (500000/pts) en présence ou absence d un stimulus spécifique et incubation 15-20h Activation des cellules et sécrétion d IFN-γ qui se lie aux Ac de capture Elimination des cellules et ajout d un Ac de détection biotinylé qui se lie à l IFN-γ capturé Ajout du conjugué streptavidinenzyme Ajout du substrat : précipité coloré insoluble Formation d un spot = cellule productrice d IFN-γ Détermination du nombre de spots/puits (10 6 ) - contrôle négatif, - positif (PHA et FRIS) - antigène (3 dilutions du médicaments)
Tests Biologiques in vitro (3) TEST ELISPOT - CONCLUSION - Avantages : Méthode rapide Bonne sensibilité 91 % Bonne spécificité 95 % Quantification du nombre de cellules productrices d une cytokine Aide au diagnostic d HSR Discrimination des patients allergiques aux médicaments des patients non allergiques Validation réalisée sur l amoxicilline. Technique élargie aux autres médicaments. Résultats en cours d évaluation. A. Rozieres et al. Allergy 2009:64:534-542
EXPLORATION DE L HSR - CONCLUSION - Tests biologiques : mise en évidence de lymphocytes T spécifiques Difficultés : - Patients rares - faible fréquence de lymphocytes spécifiques - Tableaux cliniques variés - Acheminements des prélèvements délicats - Absence de gold standard pour définir la sensibilité et spécificité des tests Interrogations (ELISPOT) : - Délai entre réactions et tests - durée de stimulation des cellules - Présentation du médicament aux lymphocytes - Molécules variées, formes pharmaceutiques, concentrations - Reproductibilité