Mécanismes de protection immunitaire contre les infections mycobactériennes Rapport final de la semaine d étude en biologie et médecine Rosalie Pitteloud Lycée-Collège de la Planta Sion (VS) Responsables : Irène Garcia Maria Olleros CMU (Genève)
Introduction Nous nous sommes intéressés, à travers ce projet, aux différents mécanismes de protection immunitaire servant à lutter contre la tuberculose. Grâce à l observation de ces mécanismes, nous avons pu différencier des cellules malades ou saines. Mécanismes de défense immunitaire contre les mycobactéries : - après infection par les mycobactéries, phagocytose des bacilles par le macrophage alvéolaire - production de cytokines par les macrophages afin de prévenir le système immunitaire de l infection - arrivée des lymphocytes T et autres cellules impliquant la formation de granulomes Granulome -le granulome emprisonne les bacilles et ainsi empêche l infection de nouvelles cellules 2
-les cytokines (interférons et TNF) vont activer la production d oxyde nitrique dans le granulome Cellule infectée - destruction des bactéries par l oxyde nitrique Le but sera de différencier des cellules infectées et non infectées par le BCG en se basant sur les réponses immunitaires. Méthodes et résultats 1 ère méthode : Coupes histologiques Nous avons observé grâce à un microscope des coupes histologiques de foies et de poumons de souris infectées et non infectées par le BCG qui est une mycobactérie comme le bacille de Koch. Signes indiquant une infection : - Présence d un granulome (amas de cellules foncées formant un cercle et entourant des cellules plus claires) sur les colorations Hématoxiline-Eosine. 3
- - Cellules de poumon d une souris infectée par le BCG : présence d un granulome au centre Cellules de poumon d une souris saine : le poumon contient plus d alvéoles, ce qui montre qu il est plus sain. - Présence de petits bâtonnets colorés en violet (colorant de Ziehl- Neelsen) : ce sont les bacilles du BCG Cellules de poumon d une souris infectée (bacilles en violet au centre) 4
2ème méthode : Détermination du taux de nitrite à partir de surnageant de culture cellulaire Une cellule infectée par le BCG produit de l oxyde nitrique pour se défendre. Matériel : - Micropipettes - Plaque 96 puits - Lecteur de densité optique - PBS ; NaNO2 ; réactif de Griess ; surnageant de culture de cellules (macrophages) Plaque 96 puits Méthodologie : Création d un standard de couleur (le standard permet de savoir à quelle densité optique correspond quelle concentration) : - 50 microlitres de PBS dans toute la ligne A - 50 microlitres de NaNO2 en 1A - Dilution en série - 50 microlitres du réactif de Griess Dilution en série 5
Mesure du taux de nitrite à l aide d une coloration (réaction de Griess) -> plus la solution est foncée plus elle contient de nitrite Mélange de surnageant de cellules non-infectées et infectées (aux jours 1, 3 et 6) avec le réactif de Griess : - 25 microlitres de PBS - 25 microlitres de surnageant de macrophages - 50 microlitres du réactif de Griess Comparaison de la densité optique du surnageant des macrophages avec le standard à l aide du lecteur de densité optique Résultats : 12 10 8 6 4 2 0 1 3 6 Datenrei hen1 Macrophages non-infectés Axe X : Nombre de jours d infection au BCG Axe Y: Concentration d acide nitrique en micromolaires 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 3 6 Datenreih en1 Macrophages infectés par le BK Axe X : Nombre de jours d infection au BCG Axe Y: Concentration d acide nitrique en micromolaires 6
Le premier graphique montre une stabilité au cours du temps. Les fluctuations sont dues à la différence entre les cas. Ces macrophages ne sont donc pas infectés car il n y a pas de nette évolution de la concentration d oxyde nitrique. Le deuxième graphique montre une très nette augmentation du taux d oxyde nitrique à partir du troisième jour. Les macrophages sont donc infectés par le BCG. Conclusion Grâce à ces méthodes, il est simple de savoir si des cellules sont infectées par le BCG. La meilleure méthode pour quantifier le niveau d infection semble être la détermination du taux de nitrite. En effet, grâce au standard, la concentration de nitrite peut être calculée. Avec les coupes histologiques, le nombre de cellules peut être compté, indiquant, ainsi, également le niveau d infection. Remerciements Je tiens à remercier Irène Garcia et Maria Olleros pour leur pédagogie ainsi que leur équipe pour m avoir permis de visiter leur laboratoire. Je remercie également la fondation «La Science appelle les jeunes» pour l organisation de cette semaine d étude, qui restera pour moi une expérience exceptionnelle. 7