TD BIO57 blotting et hybridation Page 1 sur 6 L hybridation des acides nucléiques et la notion de «stringence» Les sondes et leur marquage Principales techniques d hybridation et leur emploi Dénaturation Hybridation Homoduplex Hétéroduplex Stringence Tm Concentration en sels Séquence complexe Formamide Sonde chaude 32P Sonde froide DIG Phosphatase alcaline et NBT/BCIP Transfert Membrane Nitrocellulose/nylon Réaction antigèneanticorps Anticorps primaire/secondaire Blot type Usual Gel Sample Probe Label Southern Agarose DNA complementary nt 32 P, 33 P or non radioactive label Northern Agarose RNA complementary nt 32 P, 33 P or non radioactive label Western SDS-PAGE Protein primary Ab 2 o Ab conjugated to HRP, AP or fluorophore
TD BIO57 blotting et hybridation Page 2 sur 6 Schéma d un southern blot ADN génomique humain (3 sujets différents) Plusieurs enzymes de restriction : mais les auteurs ne précisent pas lesquelles! http://www.genelink.com/newsite/products/dnapurificationomnipuregenomic.asp Schéma du northern blot - extraction des ARNm totaux (noyaux + cytoplasme) - sonde = ADNc de la β-globine A quoi correspondent ces différentes bandes?
TD BIO57 blotting et hybridation Page 3 sur 6 Schéma du western blot Image typique d un gel de protéines - A gauche : protéines extraites de bactéries produisant une protéine humaine - A droite : marqueurs de taille - Gel à 10% de polyacrylamide
TD BIO57 blotting et hybridation Page 4 sur 6 APPLICATIONS: Exemple de southern blot (http://www.biotech.ufl.edu/workshopscourses/summerbcourse/gallery.html) Agarose gel fractionation of Rsa I digested genomic DNA Hybridization and detection
TD BIO57 blotting et hybridation Page 5 sur 6 APPLICATIONS: Exemple d une analyse d ARNm par northern blot Analyse de la stabilité de l ARNm du récepteur de la transferrine en fonction du temps. Cellules = fibroblastes cultivés dans des boîtes de Pétri Actinomycine : bloque l activité de l ARNpolII. Résultat? a. Traitement par l hémine : les cellules sont très chargées en Fer b. Traitement par la desferrioxamine : les cellules sont appauvries en Fer Comment interprétez-vous les expériences a et b? APPLICATIONS: Autre exemple de southern blot et de northern blot Application à l étude de l enzyme dégradant la TRH humaine (Thyrotropin-Releasing Hormone) 9.5 7.5 4.4 Southern Northern Zoo blot Human TRH-degrading ectoenzyme: cdna cloning, functional expression, genomic structure and chromosomal assignment. Eur. J. Biochem. 265, 415-422 (1999) Fig. 5. Southern, Northern and Zoo blot analysis. TRH-DE cdna-fragments were radioactively labelled and used to hybridize nylon membranes with size separated preparations of: (A) genomic human DNA that was restricted by the indicated enzymes to completion (BHI, BamHI; EI, EcoRI; EV, EcoRV; Hin, HinfI; Sac, SacI; Sau, Sau3AI; Xho, XhoI), and (B) mrna preparations from human tissues (ht, heart; br, brain; pl, placenta; lu, lung; li, liver; sm, skeletal muscle; kd, kidney), the horizontal bars denote the positions of the RNA standards (top to bottom: 9.5, 7.5, and 4.4 kb). (C) EcoRI-digested genomic DNA from the indicated species (ch, chicken; rb, rabbit; cw, cow; dg, dog; ms, mouse; rt, rat; mn, monkey; hm, human). Sonde CDNA et localisation par hybridation in situ
TD BIO57 blotting et hybridation Page 6 sur 6 APPLICATIONS: Western blot Exemple : test HIV Interpretation of the Western Blot can be complicated. gp 160 gp 120 gp 65 gp 55 gp 41 gp 32 gp 24 gp 18 The Western blot positive control lane contains proteins from patient sera as well as HIV proteins. HIV positivity can therefore only be confirmed by the presence of the following types of proteins: gp160 gp120 viral envelope precursor (env) viral envelope protein (env) binds to CD4 p24 p31 viral core protein (gag) reverse transcriptase (pol) Quels sont les sujets positifs? Négatifs? De statut intermédiaire?