Maladies Peroxysomales

06/10/15 GAVAZZA Sophie L2 CR : Orianne Dodier Bases Moléculaires et Cellulaires des Pathologies Dr. M.GASTALDI 15 pages BMCP : Introduction / Maladies peroxysomales Plan : Maladies Peroxysomales A. Rappels sur le peroxysome I. Définition II. Historique B. Biogenèse et dynamique des peroxysomes C. Fonctions métaboliques chez l'homme D. Maladies héréditaires du métabolisme peroxysomal E. Stratégies diagnostiques des pathologies peroxysomales F. Approches du mécanisme cellulaire et moléculaire A. Rappels sur le peroxysome I. Définitions Le peroxysome est un organite cellulaire de limite par une seule membrane. Il est pre sent dans toutes les cellules animales et ve ge tales, sauf les e rythrocytes (globules rouges). Il est particulierement abondant dans deux types cellulaires : les hepatocytes (CR : qui sont spécialisés dans la désintoxication) les cellules epitheliales renales (cellules des tubules re naux). Il ne possede pas de ge nome et donc pas d'adn. II. Historique En 1954, Rhodin re alise l'identification ultra-structurale des peroxysomes qu'il de crit comme de petits corps cellulaires appele s "microbodies". Dans les anne es 60, l'e quipe de Deduve et Coll re alise la caracte risation biochimique des peroxysomes (identification des enzymes) : les oxydases produisent l'eau oxygénée H 2 O 2. la catalase utilise la H 2 O 2 produite. Les peroxysomes sont caracte rise s par la catalase. En 1976, la chaine complete de la β-oxydation est identifie e dans les peroxysomes de foie de rat. 1/10

B. Biogenèse et dynamique des peroxysomes BMCP : Introduction / Maladies peroxysomales Les peroxysomes sont formés a partir de vésicules membranaires préexistantes. En 2005 on a montré que ces membranes provenaient du RE. Les peroxines : Il s'agit de protéines nécessaires à la biogenèse des peroxysomes. Elles permettent à la fois l'assemblage de la membrane, l'import des protéines de la lumière, la prolifération des peroxysomes et l'héritage des peroxysomes. Ces peroxines sont codées par des gènes PEX. Toutes les protéines du peroxysome (environ 23) sont codées par le génome nucléaire. Leur synthèse débute dans le cytosol. L'adressage au peroxysome est réalisé par deux peptides signal PTS1 et PTS2, à la fois pour les protéines membranaires et pour les protéines matricielles. PTS1 correspond à trois acides aminés en C-terminal, il est reconnu par la peroxine 5 (PEX 5). PTS2 correspond à neuf acides aminés en N-terminal, il est reconnu par la peroxine 7 (PEX 7). Le système d'importation au peroxysome est un complexe multiprotéique différent pour les protéines membranaires et matricielles. Exemple : Importation des protéines matricielles. 2/10

Dynamique des peroxysomes : Il y croissance des peroxysomes préexistants, puis fission de ces derniers. Les peroxysomes se reproduisent en se coupant en deux. C. Fonctions métaboliques chez l'homme Fonction d'oxydation : Il y a plusieurs oxydases dans la matrice peroxysomale. Ces oxydases sont impliquée dans le métabolisme lipidique ainsi que dans le catabolisme de la lysine. Elles produisent l'eau oxygénée H 2 O 2. On note aussi la présence de catalase qui a pour rôle l'oxydation en utilisant l'eau oxygénée produite par les oxydases. Elle permet la détoxification, donc elle a un rôle de protection cellulaire (foie, rein). Exemples des fonctions métaboliques chez l'homme : α oxydation des acides gras : Acide phytanique. β oxydation des acides gras : Acides gras a tres longue chaîne (C26, C24, C22). Acide pristanique, provenant de l'oxydation de l'acide phytanique. Acide dicarboxyliques (nombre impair de C). /!\ La mitochondrie est spe cialise e dans l'oxydation des chaines courtes, moyennes et longues, jusqu'a C22. Il y a coope ration entre les mitochondries et les peroxysomes. Syntheses (fonction de cooperation) : Synthese des plasmalogenes (etherphospholipides) en coope ration avec le RE. Synthese des interme diaires des sels biliaires en coope ration avec le cytosol, la mitochondrie, le RE. Synthèse des acides gras essentiels (DHA, acide arachidonique). Synthese du choleste rol en coope ration avec le cytosol et le RE. 3/10

Detoxification du glycoxylate (me tabolisme d'acides amine s). Autres fonctions : Oxydation de l'acide pipe colique (acide amine ). De gradation des prostaglandines. De gradation H2O2 (catalases). L'H2O2 est produit et de grade dans cet organite (catalase). Antioxydant. D. Maladies héréditaires du métabolisme peroxysomal Il y a trois groupes de pathologies : 1- Défaut de biogenèse des peroxysomes : Défaut total avec perte de toutes les fonctions du peroxysome. Défaut sélectif (par exemple affectant la reconnaissance de PST2 seulement). 2- Déficit sélectif isolé des fonctions peroxysomales. 3- Désordre de la dynamique peroxysomale (récemment décrit, il affecte l'élongation, la constriction, la fission). Ce sont des pathologies qui peuvent se developper en periode prenatale, neonatale, et durant toute la vie. Plus les symptomes sont precoces, plus la maladie est grave. Les maladies peroxysomales sont des pathologies rares. 1. Maladies résultant d'un déficit dans la biogenèse du peroxysome : On les appelle des Peroxysome Biogenesis Disorder (PBDs). Ces maladies (létales) affectent toutes les voies métaboliques du peroxysome. Elles peuvent résulter de n'importe quelle mutation dans un au moins des 13 gènes PEX connus. Il s'agit par exemple : - du groupe du syndrome de Zellweger (affectant divers gènes PEX). - de la chondrodysplasie rhizomélique ponctuée (RCPD) qui affecte PEX 7. 2. Maladies résultant d'un déficit d'une seule enzyme peroxysomale : Ces maladies affectent en général une seule voie métabolique. Il s'agit par exemple : de l'adrénoleucodystrophie liée à l'x. d'autres déficits de la β oxydation. de la maladie de Refsum adulte. d'un déficit de synthèse des plasmalogènes. d'un déficit du métabolisme du glyoxalate. 3. Maladies résultant d'un déficit de la dynamique du peroxysome ( fission/ élongation ) : déficit en DLPI déficit en PEX 11β 4/10

E. Stratégies diagnostiques des pathologies peroxysomales 1. Éléments d orientation clinique. 2. Investigations biochimiques dans les fluides biologiques (il n'existe pas de test unique). 3. Confirmation du déficit par études des biochimiques sur des fibroblastes : exploration des fonctions peroxysomales. 4. Caractérisation moléculaire du déficit : tests de complémentation sur les fibroblastes screening des gènes pex les plus souvent retrouvés Les maladies peroxysomales : Elles appartient aux maladies héréditaires du métabolisme, et plus précisément au groupe des pathologies des molécules complexes (troisième groupe, auquel appartiennent les maladies de surcharge, les désordres de la glycosylation des protéines et les maladies peroxysomales). Ces maladies ont différentes caractéristiques : il n'y a pas de cause déclenchante. la maladie évolue par elle même. il y a des méthodes de diagnostic spécifiques. Il y a seulement des approches thérapeutiques (pas de traitement). 1. présentation clinique des maladies peroxysomales : Les maladies peroxysomales sont caractérisées par : Des traits dysmorphiques du crâne, de la face et du squelette. Une atteinte neurologique (hypotonie néonatale sévère, encéphalopathie, crises d épilepsie, neuropathies périphériques, trouble de la marche, leucodystrophies). Une atteinte oculaire et une surdité. Des dysfonctionnements hépatiques et gastro-intestinaux. Un retard de développement. Elles peuvent se présenter sous trois formes cliniques : Les atteintes néonatales. Les atteintes infantiles précoces. Les atteintes plus tardives. 2. Investigations biochimiques - bilan de première intention : Ces investigations ont pour but l'exploration des principales fonctions du peroxysome. On peut doser : les acides gras à très longue chaine (AGTLC) (β oxydation) : C26:0 C24:0 C22:0. l'acide phytanique (α oxydation) qui dérive de l'alimentation (phytol). l'acide pristanique (β oxydation) qui dérive aussi de l'alimentation. 5/10

Exemples d'investigations biochimiques : Plasma : acide pipecolique. intermédiaires de sels biliaires. synthèse des plasmalogenes. Urines : acide pipecolique. chromatographie des acides organiques. glycuroconjugués des sels biliaires. BMCP : Introduction / Maladies peroxysomales 3. Confirmation du déficit par études biochimiques sur fibroblastes - exploration des fonctions peroxysomales : Exemple de la phytanoyl-coa hydrolase qui est déficiente dans la maladie de REFSUM : 4. Caractérisation moléculaire du déficit : a. Tests de complémentation sur des fibroblastes de patients : Ce test est indiqué en cas de suspicion d'un déficit de biogenèse du peroxysome (altération de l'assemblage) par défaut d'incorporation des protéines PEX qui resteront dans le cytosol et seront rapidement dégradées. Dans ce cas les peroxysomes sont absents ou très diminués en nombre. Expérience de ''sauvetage'' in vitro : On apporte in vitro la protéine X suspectée déficitaire avec un moyen de visualisation. Si la protéine X est déficitaire, il y aura restauration de l assemblage des peroxysomes du patient : quand on observera les cellules on visualisera un marquage punctiforme. Si une autre protéine que la protéine X est déficitaire, le ''sauvetage '' de l'assemblage des peroxysomes n'est pas réalisé et il n'y a pas de visualisation des peroxysomes. Exemple d'un test de complémentation sur les fibroblastes d'un patient : 6/10

b. Screening des gènes PEX : Il s'agit du séquençage des exons les plus fréquemment mutés des gènes PEX les plus souvent rencontrés dans les PBD (PEX1, PEX6, PEX12, PEX26, PEX10, PEX2). On peut identifier dans 70 a 80% des cas la peroxine en cause Le screening est réalisable directement sur l'adng. Les diagnostics prénataux : Ce sont des tests biologiques. On peut tester : Les acides gras a très longues chaînes dans les villosités choriales ou dans des amniocytes cultivés ainsi que dans le sang fœtal. La β-oxydation des C24 et des C26 dans les villosités choriales ou dans des amniocytes cultivés. Les plasmalogènes dans les villosités choriales ou dans des amniocytes cultivés. Par biologie moléculaire : dans les villosités choriales ainsi que dans des amniocytes en direct ou cultivés. Approches thérapeutiques : Ces approches sont très limitées et ne sont (plus ou moins) efficaces que si il n'y pas de forme cérébrale. Régimes pauvres en acide phytaniques (efficacité très incertaine). Supplémentation en DHA (idem, efficacité incertaine). Huile de Lorenzo (c'est un mélange de C18:1 et C22:1 qui diminue la synthèse des AGTLC, cette huile normalise les taux mais il y a tout de même peu d'effets cliniques). Acides biliaires : acide cholique, acide ursodésoxycholique. Vitamines liposolubles. Prévention et traitement de l'hyperoxalurie. Traitement hormonal si il y a une insuffisance surrénale. Transplantation de cellules hématopoïétiques dans le cas de l'x-ald. Si il y a une forme cérébrale, rien ne marche. F. Approches du mécanisme cellulaire et moléculaire 1. Exemple de l'x- ALD (Adrénoleucodystrophie liée a l'x) Il s'agit d'une mutation sur le gène ABCD1 codant pour une protéine ATP binding cassette, ou transporteur ABC (CR : ce transporteur ABC est utilisé pour l'internalisation des acides gras à très longue chaîne). Cette anomalie constitue un déficit isolé d'une fonction peroxysomale. L'incidence de cette mutation est de 1/17000 garçons. CR : on dénombre plus de 600 mutations pouvant être la cause de cette maladie. Il s'agit du plus fréquent des déficits du peroxysome et des leucodystrophies monogéniques. 7/10

C'est un maladie hétérogène avec différents phénotypes : Forme médullaire : dégénération axonale. Forme cérébrale : neuroinflammation et démyélinisation des hémisphères cérébraux. Il peut y avoir aussi, en plus, une insuffisance surrénalienne (CR : cette insuffisance surrénalienne peut aussi être isolée). Il n'y a aucune corrélation entre le génotype et le phénotype. Dans tous les cas, l'x-ald se caractérise par une diminution de la β-oxydation des acides gras à très longue chaïne, ainsi que par leur accumulation plasmatique et tissulaire. Hétérogénéité clinique de l'x-ald : Formes adultes : Formes médullaires : Adrénomyéloneuropathie (environ 40% des malades, dont 1/3 développeront une forme cérébrale). Les formes médullaires de l'adulte débutent entre 20 et 40 ans chez l'homme, et elles apparaissent après 40 ans chez la femme. Elles entraînent un trouble de la marche, des paraparésies spastiques (raideurs des jambes) progressives, et des troubles urinaires. Elles peuvent être associées à une insuffisance surrénale. Formes limitées à une insuffisance surrénalienne (8 % des malades). Formes cérébrales adulte (touchant 10 % des malades). Les formes cérébrales toucheront 1/3 des patients atteints d'une forme médullaire. Elles ne touchent que les hommes, ne surviennent jamais chez les femmes mais 40% des femmes sont conductrices. Formes cérébrales de l'enfant (40% des malades) : Elles touchent les enfants entre 5 et 12 ans et sont caractérisées par : Des troubles cognitifs, visuels, auditifs. Un syndrome pyramidal. Un syndrome cérébelleux. Des convulsions. Il peut y avoir une insuffisance surrénale. L'atteinte IRM précède les signes cliniques (la surveillance par l'irm est donc très importante). Diagnostic : On diagnostique l'x-ald par la mesure de l'accumulation des acides gras a très longue chaîne. Cette technique est fiable à 100% chez l'homme et à 90-95% chez la femme. La quantité d'acides gras à très longue chaîne n'est pas corrélée au phénotype. Neuropathologie : Forme médullaires : axonopathie caractérisée par : La perte des axones myélinisés des faisceaux ascendants et descendants de la moelle. Une polyneuropathie des nerfs périphériques avec perte des fibres myélinisées de petit et gros diamètre. 8/10

Forme cérébrale : maladie inflammatoire caractérisée par : Une perte myélinique pariéto-occipitale. Un front de démyélinisation : réaction inflammatoire importante périvasculaire. X-ALD et bio marqueurs du stress oxydant : Il y a une augmentation du taux basal des ROS dans les lymphoblastes. Il y a aussi une modification de l'activité de la glutathion peroxydase, de la catalase et de la SOD sur les fibroblastes (CR : ces enzymes ont normalement un rôle de protection contre le stress oxydant). On constate aussi une modification de la structure des composants cellulaires, notamment une carbonylation des protéines et une peroxydation des lipides. X-ALD et bio marqueurs de l'inflammation : On observe dans des tissus tels que des cerveaux humains, et notamment dans leurs lymphoblastes, une augmentation des cytokines et des chémokines. Bases moléculaires de l'x ALD et '' three hit hypothesis '' : CR : L'inactivation d'abcd1 engendre le stress oxydant (déséquilibre représenté par la balance). Cela entraîne une peroxydation des lipides, une carbonylation des protéines et, à terme, un dysfonctionnement et la mort cellulaire. C'est le premier coup, qui est modulé par des facteurs environnementaux, épigénétiques et génétiques. Lors du deuxième coup, l'inflammation provoque le passage à la forme cérébrale. Au troisième coup, il y a finalement atteinte de la fonction peroxysomale. 2. Exemple de la mutation PEX 1 La mutation PEX 1 est la plus fréquente des PBD (59%). C'est une mutation privée. (CR : cela signifie qu'il n'y a pas qu'une seule mutation pouvant affecter PEX 1). Les deux mutations les plus fréquemment retrouvées sont : c.2528g>a (p.g843d) : instabilité de la protéine et perte partielle de fonction, dans le cas d'une mutation homozygote la maladie sera de phénotype modéré. c.2097_2098inst (p.1700fsx41) : protéine tronquée et perte totale de fonction PEX 1, dans le cas d'une mutation homozygote la maladie sera de phénotype sévère. 9/10

Effet de la température sur la biosynthèse d'un mutant PEX1 : La conformation est liée à la température : à 30 C la protéine mutée a 60% de l'activité de la protéine normale. à 37 C 10% la protéine mutée a 10% de l'activité de la protéine normale. à 40 C il y a une perte totale de l'activité de la protéine. Ceci est faux pour les autres mutations. Un shift en température (de 37 C a 30 C) augmente non seulement le nombre de peroxysomes mais aussi leur activité. Effet de l'augmentation des concentrations en arginine sur les peroxysomes des patients présentant des mutations de PEX1 : L'addition d'arginine en culture augmente l'activité de PEX1. L'arginine fonctionne comme une chaperonne pour permettre le repliement correct de PEX1. Il y a des études en cours, in-vivo sur un modèle animal (souris). Informations données par la prof en début de cours : marguerite.gastaldi@univ-amu.fr Premier semestre : 20h de cours magistraux 2 ECTS ( système européen de transfert et cumul des crédits ) Contrôle des connaissances : QR courtes de 10 minutes chacune ; épreuve de 30 minutes notée sur 20 note éliminatoire si elle est inférieure a 10 ENT : on y trouvera le plan et les schémas des cours ou les power point. Deuxième semestre : 20h de cours magistraux 6h d'ed à présence obligatoire (1 seule absence autorisée avec un certificat médical) 3 ECTS Contenu plus intégré avec des pathologies centrées sur le cancer Contrôle des connaissances : Question courte (problème expérimental avec question de cours inclus) notée sur 14 durée de 30 minutes au total ED comptant pour 6 points donc total sur 20 : note éliminatoire si elle est inférieure a 10 pas de compensation possible avec la note du premier semestre et dette impossible en raison des ED ENT : - plan et schéma du cours ou ppt - prérequis pour les ED - problèmes résolus ( annales, épreuves de 45 minutes ) 3 ED : - dosage plasmatique et urinaire des protéines - imagerie et microscopie - potentiel thérapeutique des cellules souches Pré requis aux ED 2 et 3 : documents sur l'ent et articles (peut-être une inscription à un mooc pour l'ed 3). 10/10