Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR

Décembre 2014 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Version 1 24 Utilisation prévue pour le diagnostic in vitro À utiliser avec les instruments Rotor-Gene Q MDx 870311 QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Royaume-Uni R1 1090234 Sample & Assay Technologies

Technologies d échantillonnage et de dosage QIAGEN QIAGEN est le premier fournisseur de technologies novatrices d échantillonnage et de dosage permettant d isoler et de détecter le contenu de n importe quel échantillon biologique. Nos produits et services avancés de haute qualité garantissent le succès, de l échantillon jusqu au résultat. QIAGEN fixe les normes en matière de : Purification d ADN, d ARN et de protéines Dosages d acides nucléiques et de protéines Recherche micro-arn et ARNi Automatisation des technologies d échantillonnage et de dosage Notre mission consiste à permettre à notre clientèle de réussir et d accomplir des progrès décisifs. Pour plus d informations, visiter www.qiagen.com.

Sommaire Utilisation prévue 4 Résumé et explication 4 Principe de la procédure 5 Matériel fourni 7 Contenu du kit 7 Matériel nécessaire mais non fourni 7 Avertissements et précautions 9 Informations de sécurité 9 Précautions générales 9 Stockage et manipulation des réactifs 10 Stockage et manipulation des prélèvements 11 Procédure 12 Protocoles 1 : détection des mutations EGFR 13 2 : configuration du Rotor-Gene Q EGFR 17 Guide de dépannage 32 Contrôle qualité 33 Limitations 33 Caractéristiques des performances 34 Références 41 Symboles 41 Coordonnées 42 Annexe A : informations concernant la mutation 43 Pour commander 44 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 3

Utilisation prévue Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est un test de diagnostic in vitro destiné à la détection de délétions dans l exon 19 et de substitutions dans les exons 20 et 21 (T790M et L858R respectivement) dans le gène du récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR), et fournissant une évaluation qualitative de l état mutationnel. Les résultats doivent aider le clinicien à identifier les patients atteints de CPNPC pouvant bénéficier d un traitement à base d IRESSA (géfitinib), lorsqu un échantillon de tissu ne peut pas être évalué. Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR doit être utilisé par un personnel formé, dans un environnement professionnel de laboratoire, avec des échantillons d ADN extraits de plasma obtenu à partir de sang de patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC). Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est destiné à une utilisation pour le diagnostic in vitro. Résumé et explication Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est un kit prêt à l emploi utilisé pour détecter les mutations de l oncogène EGFR à l aide de la technique de réaction en chaîne par polymérase (PCR) sur les instruments Rotor-Gene Q MDx. Grâce aux technologies Scorpions et ARMS, le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR permet de détecter les mutations suivantes du gène EGFR par rapport à un bruit de fond d ADN génomique de type sauvage. Délétions au niveau de l exon 19 T790M L858R Les méthodes utilisées sont hautement sélectives et, en fonction de la quantité totale d ADN présente, permettent de détecter un faible pourcentage de mutants dans un bruit de fond d ADN génomique de type sauvage. Ces limites de sélectivité et de détection sont supérieures aux technologies telles que le séquençage avec marquage fluorescent. 4 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Principe de la procédure Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR utilise 2 technologies (ARMS et Scorpions) pour détecter les mutations dans la PCR en temps réel. ARMS L amplification spécifique d allèle ou de mutation s effectue par le biais du système ARMS (système de mutation réfractaire par amplification). La Taq ADN polymérase (Taq) permet d établir une distinction efficace entre un appariement et un mésappariement à l extrémité 3' d une amorce de PCR. Des séquences aux mutations spécifiques sont sélectionnées pour être amplifiées, même dans des échantillons où la majorité des séquences ne porte pas la mutation. Lorsque l amorce est entièrement appariée, l efficacité de l amplification est maximale. Lorsque la base 3' est mésappariée, seule une amplification entraînant un faible bruit de fond peut se produire. Scorpions La détection de l amplification s effectue par le biais de la technologie Scorpions. Les Scorpions sont des molécules bi-fonctionnelles contenant une amorce de PCR qui comporte une liaison covalente avec une sonde. Le fluorophore de cette sonde interagit avec un quencher, lui aussi intégré à la sonde, ce qui diminue la fluorescence. Au cours d une PCR, lorsque la sonde s hybride à l amplicon, le fluorophore et le quencher se séparent. La fluorescence du tube de réaction augmente. Format du kit 4 tests sont fournis dans le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR : 1 test de contrôle (Ctrl) 3 tests de mutation Tous les mélanges réactionnels contiennent des réactifs destinés à détecter les cibles marquées FAM et un test de contrôle interne marqué HEX. La présence d inhibiteurs pouvant entraîner des faux négatifs peut ainsi être détectée par le test de contrôle interne. L amplification FAM peut surpasser l amplification par contrôle interne, dont le but est simplement de montrer qu en l absence d amplification FAM, le résultat est un vrai négatif et non un échec de la PCR. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 5

Tests : Test de contrôle Le test de contrôle, marqué FAM, est utilisé afin d évaluer l ADN total d un échantillon. Ce test amplifie une région d exon 2 du gène EGFR. L amorce et la sonde ont été conçues de façon à éviter tout polymorphisme connu du gène EGFR. Tests de mutation Chaque test de mutation contient une sonde Scorpion marquée FAM et une amorce afin de distinguer l ADN de type sauvage de l ADN mutant spécifique. Contrôles Remarque : toutes les analyses de contrôle doivent inclure les contrôles suivants. Contrôle positif Chaque analyse doit contenir un contrôle positif dans les tubes 1 à 4. Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR contient un contrôle positif (PC) EGFR à utiliser en tant que matrice dans la réaction du contrôle positif. Les résultats du contrôle positif sont évalués pour garantir que le kit fonctionne conformément aux critères d acceptation donnés. Contrôle négatif Chaque analyse doit contenir un contrôle négatif («no template control», NTC) dans les tubes 9 à 12. Le NTC contient de l eau sans nucléase (H2O) à utiliser en tant que «matrice» pour le contrôle négatif. Le contrôle négatif est utilisé pour évaluer toute contamination potentielle durant la configuration de l analyse et pour évaluer les performances de la réaction du contrôle interne. Évaluation de la réaction du contrôle interne Chaque mélange réactionnel contient un contrôle interne en plus de la réaction cible. Un échec indique la présence éventuelle d inhibiteurs, susceptibles d entraîner des faux négatifs, ou la survenue d une erreur de configuration de l opérateur pour ce tube. En cas d échec du contrôle interne dû à l inhibition de la PCR, la dilution de l échantillon peut réduire l effet des inhibiteurs, mais il faut noter que l ADN cible serait alors lui aussi dilué. L amplification FAM peut surpasser l amplification par contrôle interne, de sorte que la valeur CT du CI (HEX) peut se trouver en dehors de l intervalle spécifié. Les résultats FAM demeurent valides pour ces échantillons. 6 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Matériel fourni Contenu du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit (24) N de référence 870311 Nombre de réactions 24 Rouge Violet Orange Rose Beige Menthe Blanc Blanc Control Reaction Mix (mélange réactionnel de contrôle) T790M Reaction Mix (mélange réactionnel T790M) Deletions Reaction Mix (mélange réactionnel délétions) L858R Reaction Mix (mélange réactionnel L858R) EGFR Positive Control (contrôle positif EGFR) Taq DNA Polymerase (Taq ADN polymérase) Nuclease-Free Water for No Template Control (eau sans nucléase pour NTC) Nuclease-Free Water for Dilution (eau sans nucléase pour dilution) Ctrl 2 600 µl T790M 600 µl Del 600 µl L858R 600 µl PC 300 µl Taq 2 80 µl NTC 1 1,9 ml Dil 1 1,9 ml Matériel nécessaire mais non fourni Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées, disponibles auprès du fournisseur du produit. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 7

Kit d extraction d ADN (voir «Procédure», page 12) Pipettes dédiées* (adaptables) pour la préparation des échantillons Pipettes dédiées* (adaptables) pour la préparation du master mix PCR Pipettes dédiées* (adaptables) pour la distribution de l ADN matrice Pointes de pipette exemptes de DNAse, de RNAse et d ADN avec filtres (pour éviter la contamination croisée, nous recommandons des pointes de pipette avec des filtres anti-aérosols) Bain-marie ou dispositif similaire capable de maintenir des tubes de centrifugeuse de 50 ml à 60 C Bloc chauffant ou dispositif similaire capable d incuber à 56 C* Glace pilée Centrifugeuse de paillasse* avec rotor pour tubes de réaction de 2 ml Agitateur Instrument Rotor-Gene Q MDx* avec canaux de fluorescence pour Cycling Green et Cycling Yellow (pour détecter FAM et HEX, respectivement) Logiciel Rotor-Gene Q version 2.3 Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (barrettes de tubes et de capuchons de 0,1 ml) à utiliser avec un rotor de 72 puits (n réf. 981103 ou 981106) Tubes de microcentrifugeuse exempts de DNAse, de RNAse et d ADN pour la préparation des master mix Loading Block 72 0.1 ml Tubes (bloc de chargement de tubes de 72 0,1 ml) : bloc en aluminium pour préparation de réaction manuelle avec pipette à canal unique (QIAGEN, n réf. 9018901) * S assurer que les instruments ont été vérifiés et calibrés conformément aux recommandations du fabricant. Il s agit d une liste incomplète de fournisseurs. Ne pas utiliser d alcool dénaturé, qui contient d autres substances, telles que le méthanol ou la méthyléthylcétone. Dans certains pays, le cas échéant, il est possible d utiliser l instrument Rotor-Gene Q 5plex HRM avec, comme date de production, mai 2011 ou une date ultérieure. La date de production est contenue dans le numéro de série à l arrière de l instrument. Le numéro de série présente le format «mmaannn», où «mm» désigne le mois de production en chiffres, «aa» les deux derniers chiffres de l année de production et «nnn» l identifiant d instrument unique. 8 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Avertissements et précautions Utilisation prévue pour le diagnostic in vitro Réservé à un usage professionnel Informations de sécurité Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées. Celles-ci sont disponibles en ligne dans un format PDF pratique et compact sur le site www.qiagen.com/safety répertoriant les FDS imprimables pour chaque kit QIAGEN et chaque composant. Précautions générales L utilisateur doit toujours faire attention aux éléments suivants : Utiliser des pointes de pipette exemptes de DNAse, de RNAse et d ADN avec filtres et s assurer que les pipettes ont été calibrées conformément aux instructions du fabricant. Conserver et extraire le matériel positif (prélèvements et contrôles positifs) séparément de tous les autres réactifs puis l ajouter au mélange réactionnel dans un emplacement suffisamment distant. Décongeler complètement tous les composants à température ambiante (de 15 à 25 C) avant de commencer un test. Lorsqu ils sont décongelés, mélanger les composants en retournant 10 fois chaque tube et les passer brièvement à la centrifugeuse. Remarque : faire preuve d une extrême vigilance pour éviter la contamination des PCR avec le matériel de contrôle synthétique. Nous recommandons d utiliser des pipettes séparées et dédiées pour préparer les mélanges réactionnels et ajouter l ADN matrice. La préparation et la distribution des mélanges réactionnels doivent être effectuées dans une zone séparée de la zone utilisée pour l ajout de l ADN matrice. Les tubes du Rotor-Gene Q ne doivent pas être ouverts une fois l analyse PCR terminée. Cela permet d éviter toute contamination de laboratoire avec les produits ultérieurs à la PCR. Remarque : les réactifs sont validés pour une préparation manuelle. Dans le cadre d une méthode automatique, le nombre de réactions possibles peut être diminué en raison d un réactif censé remplir les «volumes morts» de ces instruments. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 9

Remarque : tous les réactifs du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ont été formulés pour être utilisés spécifiquement avec les tests donnés. Tous les réactifs fournis dans le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR sont destinés à être utilisés uniquement avec les autres réactifs du même kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Afin de garantir des performances optimales, les réactifs de ce kit ne doivent pas être remplacés. Remarque : utiliser uniquement la Taq ADN polymérase (Taq) fournie dans le kit. Ne pas la remplacer par la Taq ADN polymérase d autres kits du même type ou de type différent ni par de la Taq ADN polymérase d un autre fournisseur. Remarque : les réactifs du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ont été dilués de manière optimale. Nous ne recommandons aucune dilution supplémentaire des réactifs : celle-ci pourrait entraîner une baisse des performances. L utilisation de volumes réactionnels inférieurs à 25 µl n est pas recommandée compte tenu du risque d augmentation des faux négatifs. Stockage et manipulation des réactifs Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est expédié sur un lit de glace sèche. Si un des composants du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR n est pas congelé dès l arrivée, que l emballage extérieur a été ouvert au cours du transport, que le colis ne contient pas de notice d emballage, d instructions d utilisation ou de réactifs, prière de contacter l un des départements de support technique ou l un des distributeurs locaux de QIAGEN (visiter le site www.qiagen.com). Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR doit être stocké dès réception à une température comprise entre -15 et -30 C dans un congélateur à température constante et à l abri de la lumière. Lorsqu il est stocké dans les conditions de conservation spécifiées, le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est stable jusqu à la date de péremption indiquée. Une fois ouverts, les réactifs peuvent être conservés dans leur emballage d origine à une température comprise entre -15 et -30 C pendant 90 jours ou jusqu à la date de péremption indiquée, selon la première éventualité. Éviter la congélation et décongélation à répétition. Ne pas dépasser un maximum de 8 cycles de congélation/décongélation. Les réactifs doivent être décongelés à température ambiante pendant 1 à 4,5 heures. Une fois les réactifs prêts à l utilisation, les PCR peuvent être configurées. Les tubes Rotor-Gene Q, qui contiennent les master mix et les 10 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

échantillons d ADN, peuvent être immédiatement chargés sur l instrument Rotor- Gene Q MDx. La durée totale précédant l analyse une fois les PCR configurées ne doit pas excéder : 7 heures en cas de conservation à température ambiante Remarque : cette durée inclut la configuration et le stockage de la PCR. 18 heures en cas de conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 C) Remarque : cette durée inclut la configuration et le stockage de la PCR. Remarque : les molécules Scorpions (comme toutes les molécules marquées en fluorescence) présentes dans les réactifs du mélange réactionnel sont photosensibles. Placer les réactifs de contrôles et du mélange réactionnel à l abri de la lumière afin d éviter tout photoblanchiment. Les réactifs du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ont été dilués de façon optimale et aucune purification ni aucun traitement supplémentaire ne sont requis avant l analyse, conformément aux instructions d utilisation (manuel) du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Il est important de respecter les dates de péremption et les conditions de conservation imprimées sur les boîtes et les étiquettes de tous les composants. Ne pas utiliser de composants périmés ou mal conservés. Stockage et manipulation des prélèvements Remarque : tous les échantillons doivent être traités comme des substances présentant un risque potentiel d infection. Les substances des échantillons doivent être constituées d ADN génomique humain extrait de plasma. Les prélèvements doivent être transportés conformément à la méthodologie standard de pathologie pour garantir leur bonne qualité. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 11

Procédure Extraction d ADN Les caractéristiques de performances de ce kit ont été déterminées à l aide d ADN extrait avec le kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (n réf. 55114). En cas d utilisation du kit QIAamp Circulating Nucleic Acid, procéder à l extraction de l ADN conformément aux instructions du manuel en prenant en compte les remarques suivantes : Le volume de plasma de départ est de 2 ml. Avant l extraction de l ADN, 2 ml de plasma doivent être centrifugés à 3 000 tr/min pendant 2 minutes et le surnageant doit être transféré dans un tube propre. Le volume de protéinase K doit être de 250 µl. La digestion de la protéinase K doit être effectuée pendant 1 heure à 60 C. L ADN génomique purifié doit être élué dans 55 µl de tampon AVE (fourni dans le kit QIAamp Circulating Nucleic Acid). Conserver l ADN génomique purifié à une température comprise entre -15 et -30 C. Remarque : tous les tests du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR génèrent des produits PCR courts. Toutefois, le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR ne fonctionnera pas avec de l ADN fortement fragmenté. 12 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Protocole 1 : détection des mutations EGFR Points importants avant de commencer Avant de commencer la procédure, prière de lire les «Précautions générales», page 9. Prendre le temps de se familiariser avec l instrument Rotor-Gene Q MDx avant de commencer le protocole. Voir le manuel de l utilisateur de l instrument. Ne pas faire passer la Taq ADN polymérase (Taq) ou tout autre mélange contenant de la Taq ADN polymérase dans l agitateur : l enzyme risquerait d être désactivée. Jusqu à 16 échantillons peuvent être analysés sur une plaque. Pipetter la Taq en plaçant la pointe de la pipette juste sous la surface du liquide pour éviter le risque d enrobage de la pointe dans une quantité excessive d enzyme. Pour chaque échantillon d ADN, les tests de contrôle et de mutation doivent être analysés avec la même analyse PCR afin d éviter toute variation. À effectuer avant de commencer Avant chaque utilisation, tous les réactifs doivent être mis à décongeler complètement pendant une durée comprise entre 1 heure et 4,5 heures à température ambiante (entre 15 et 25 C), mélangés en les retournant 10 fois et passés brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu au fond du tube. S assurer que la Taq est à température ambiante (entre 15 et 25 C) avant chaque utilisation. Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. Procédure 1. Décongeler complètement tous les mélanges réactionnels, l eau sans nucléase pour le NTC et le contrôle positif (PC) EGFR à température ambiante (entre 15 et 25 C) pendant au moins 1 heure. Une fois les réactifs décongelés, les mélanger en retournant chaque tube 10 fois pour éviter les concentrations locales de sels, puis les passer brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu se trouvant au fond du tube. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 13

Tableau 1. Temps de décongélation, temps de configuration de la PCR et températures de stockage Temps de décongélation Minimum Maximum Température de stockage après configuration de la PCR 1 heure 4,5 heures Température ambiante (15 à 25 C) Durée maximale de configuration et de stockage de la PCR 7 heures 1 heure 4,5 heures 2 à 8 C 18 heures Remarque : la configuration de la PCR doit s effectuer à température ambiante. Le terme «stockage» désigne la durée entre l achèvement de la configuration de la PCR et le début de l analyse par PCR sur l instrument Rotor-Gene Q MDx. Remarque : porter la Taq ADN polymérase (tube Taq) à température ambiante (15 à 25 C) en même temps que les autres réactifs (voir «Stockage et manipulation des réactifs», page 10). Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. 2. Marquer 4 tubes de microcentrifugeuse (non fournis) selon chaque mélange réactionnel correspondant indiqué au Tableau 2. Préparer suffisamment de master mix (mélange réactionnel de contrôle ou de mutation [tube CTRL, T790M, délétions, L858R] plus la Taq ADN polymérase [Taq]) pour les échantillons d ADN, une réaction de contrôle positif (tube PC) EGFR et de l eau sans nucléase pour la réaction du contrôle négatif (tube NTC) selon les volumes indiqués au Tableau 2. Inclure des réactifs pour 1 échantillon supplémentaire pour disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. Les master mix contiennent tous les composants nécessaires pour la PCR excepté l échantillon. Tableau 2. Préparation des master mix* Test Tube de mélange réactionnel Volume de mélange réactionnel Volume de la Taq ADN polymérase (Taq) Contrôle CTRL 19,50 µl (n+1) 0,50 µl (n+1) T790M T790M 19,50 µl (n+1) 0,50 µl (n+1) Délétions Del 19,50 µl (n+1) 0,50 µl (n+1) L858R L858R 19,50 µl (n+1) 0,50 µl (n+1) * Lors de la préparation, préparer suffisamment de master mix pour un échantillon supplémentaire afin de disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. 14 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Remarque : lors de la préparation du master mix, le volume nécessaire de mélange réactionnel de contrôle ou de mutation est ajouté en premier au tube correspondant et la Taq ADN polymérase est ajoutée en dernier. 3. Placer le nombre approprié de barrettes de 4 tubes de PCR (chaque barrette contient 4 tubes) dans le bloc de chargement comme indiqué au Tableau 3. Ne pas boucher les tubes. Remarque : laisser les bouchons dans le conteneur en plastique le temps nécessaire. 4. Boucher le tube de master mix et le retourner 10 fois afin de mélanger le master mix, puis procéder à une brève centrifugation pour s assurer que le mélange se trouve au fond du tube. Ajouter immédiatement 20 µl de master mix dans chaque tube de PCR correspondant. 5. Ajouter immédiatement 5 µl d eau sans nucléase (H2O) aux tubes PCR de contrôle négatif (tubes de PCR 9 à 12) et boucher les tubes. 6. Ajouter 5 µl de chaque échantillon aux tubes d échantillon (tubes de PCR n 5 à 8, 13 à 16 et 17 à 72) et boucher les tubes. 7. Ajouter 5 µl de contrôle positif (PC) EGFR aux tubes de contrôle positif (tubes de PCR n 1 à 4). Chaque échantillon d ADN doit être testé avec le contrôle et avec tous les tests de mutation. La disposition est présentée dans le Tableau 3. Tableau 3. Disposition pour les tests de contrôle et de mutation Contrôles Numéro de l échantillon Test PC NTC 1 2 3 4 5 6 7 Ctrl 1 9 17 25 33 41 49 57 65 T790M 2 10 18 26 34 42 50 58 66 Délétions 3 11 19 27 35 43 51 59 67 L858R 4 12 20 28 36 44 52 60 68 Numéro de l échantillon Test 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Ctrl 5 13 21 29 37 45 53 61 69 T790M 6 14 22 30 38 46 54 62 70 Délétions 7 15 23 31 39 47 55 63 71 L858R 8 16 24 32 40 48 56 64 72 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 15

8. À l aide d un marqueur permanent, identifier le couvercle des tubes se trouvant dans les positions numériques les plus faibles pour chaque barrette de 4 tubes de PCR (par ex. positions 1, 5 et 9, etc.) pour indiquer l orientation de chargement des tubes dans le rotor à 72 puits de l instrument Rotor-Gene Q MDx. 9. Placer toutes les barrettes de 4 tubes de PCR dans les positions appropriées du rotor à 72 puits et vérifier que les tubes contiennent tous le même volume. Remarque : s assurer que les barrettes de tubes ne sont pas inversées lors de leur transfert dans le rotor. 10. Si le rotor n est pas plein, remplir les espaces restants avec des tubes vides bouchés. 11. Placer immédiatement le rotor dans l instrument Rotor-Gene Q MDx. Vérifier que la bague de fermeture (accessoire de l instrument Rotor-Gene Q MDx) est placée au-dessus du rotor pour que les tubes ne bougent pas lors de l analyse. 12. Se reporter aux instructions de préparation de l instrument Rotor-Gene Q MDx (voir «Protocole 2 : configuration du Rotor-Gene Q EGFR», page 17) pour créer le profil de température et démarrer l analyse. 16 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Protocole 2 : configuration du Rotor-Gene Q EGFR Pour résumer, les paramètres de cycle se présentent de la manière suivante. Tableau 4. Paramètres de cycle Cycles Température Durée Acquisition des données 1 95 C 15 minutes Aucune 40 95 C 30 secondes Aucune 60 C 60 secondes Vert et jaune 1. Double-cliquer sur l icône du logiciel Rotor-Gene Q Series Software 2.3 sur le bureau de l ordinateur portable connecté à l instrument Rotor-Gene Q MDx. Sélectionner l onglet «Advanced» (avancé) dans la boîte de dialogue «New Run» (nouvelle analyse) qui apparaît. 2. Pour créer un nouveau modèle, sélectionner «Empty Run» (analyse vide) puis cliquer sur «New» (nouvelle) pour ouvrir le «New Run Wizard» (assistant nouvelle analyse). 3. Sélectionner «72-Well Rotor» (rotor 72 puits) comme type de rotor. Confirmer la bonne fixation de la bague de fermeture en cochant la case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). Cliquer sur «Next» (suivant) (voir Figure 1). 1 2 3 Figure 1. Boîte de dialogue «New Run Wizard» (assistant nouvelle analyse). Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 17

4. Saisir le nom de l opérateur. Ajouter toutes les remarques et définir le volume réactionnel sur 25. S assurer que «Sample Layout» (disposition d échantillon) affiche «1, 2, 3...». Cliquer sur «Next» (suivant) (voir Figure 2). 1 2 3 4 5 Figure 2. Entrer le nom de l opérateur et les volumes réactionnels. 18 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

5. Cliquer sur le bouton «Edit Profile» (modifier profil) dans la boîte de dialogue «New Run Wizard» (assistant nouvelle analyse) (voir Figure 3) puis programmer les paramètres de l analyse conformément aux informations contenues dans les étapes suivantes. 1 Figure 3. Modification du profil. 6. Cliquer sur le bouton «Insert After» (insérer après) puis sélectionner «New Hold at Temperature» (nouvelle température d attente) (voir Figure 4). 1 2 Figure 4. Insertion d une étape d incubation initiale. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 19

7. Régler «Hold Temperature» (température d attente) sur 95 C et «Hold Time» (temps d attente) sur 15 min 0 sec. Cliquer sur le bouton «Insert After» (insérer après) puis sélectionner «New Cycling» (nouveau cycle) (voir Figure 5). 1 2 3 Figure 5. Étape d incubation initiale à 95 C. 8. Régler le nombre de répétitions de cycles sur 40. Sélectionner la première étape et régler sur 95 C et sur 30 secondes (voir Figure 5). 1 3 2 Figure 6. Étape du cycle à 95 C. 20 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

9. Mettre en surbrillance la seconde étape et régler sur «60 C for 60 secs» (60 C pour 60 secondes). Autoriser l acquisition de données lors de cette étape en sélectionnant le bouton «Not Acquiring» (pas d acquisition) (voir Figure 7). 2 1 Figure 7. Étape du cycle à 60 C. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 21

10. Régler «Green» (vert) et «Yellow» (jaune) comme «Acquiring Channels» (canaux d acquisition) en sélectionnant le bouton «>» pour les transférer depuis la liste «Available Channels» (canaux disponibles). Cliquer sur «OK» (voir Figure 8). 1 2 Figure 8. Acquisition à l étape du cycle à 60 C. 22 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

11. Mettre la troisième étape en surbrillance et la supprimer en cliquant sur le bouton «-». Cliquer sur «OK» (voir Figure 9). 2 1 Figure 9. Suppression de l étape supplémentaire. 3 12. Dans la boîte de dialogue suivante, cliquer sur le bouton «Gain Optimisation» (optimisation de l augmentation) (voir Figure 10). 1 Figure 10. Optimisation de l augmentation. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 23

13. Cliquer sur le bouton «Optimise Acquiring» (optimiser l acquisition). Les paramètres des canaux sont affichés pour chaque canal. Accepter ces valeurs par défaut en cliquant sur «OK» pour les deux canaux (voir Figure 11). 1 2 Figure 11. Optimisation automatique de l augmentation pour le canal vert. 24 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

14. Cocher la case «Perform Optimisation before 1st Acquisition» (effectuer optimisation avant 1 ère acquisition) puis cliquer sur le bouton «Close» (fermer) pour retourner dans l assistant (voir Figure 12). 1 2 Figure 12. Sélection des canaux vert et jaune. 15. Cliquer sur «Next» (suivant) pour sauvegarder le modèle dans un emplacement approprié en sélectionnant «Save Template» (sauvegarder modèle). Analyse des données d évaluation des mutations Une fois l analyse terminée, analyser les données conformément à la procédure suivante. Paramètres d analyse du logiciel 1. Ouvrir le fichier approprié à l aide du logiciel Rotor-Gene Q series, version 2.3. 2. Si les échantillons n ont pas encore été nommés avant l analyse, cliquer sur «Edit Samples» (modifier échantillons). 3. Insérer le nom des échantillons dans la colonne «Name» (nom). Remarque : les noms des puits vides doivent être laissés vierges. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 25

4. Cliquer sur «Analysis» (analyse). Sur la page de l analyse, cliquer sur «Cycling A, Yellow» (cycle A, jaune) pour vérifier le canal HEX. 5. Vérifier que «Dynamic Tube» (tube dynamique) est mis en surbrillance. Cliquer sur «Slope Correct» (pente correcte) et «Linear Scale» (échelle linéaire). 6. Cliquer sur «Take Off Adj.» (ajustement cycle) et saisir 15.01 et 20.01 comme indiqué dans la Figure 13. 1 2 3 4 Figure 13. Paramètres de normalisation de l analyse EGFR. 1 = bouton «Dynamic Tube» (tube dynamique), 2 = bouton «Slope Correct» (pente correcte), 3 = bouton «Take Off Adj.» (ajustement cycle), 4 = boîte de dialogue «Take Off Point Adjustment» (ajustement cycle) avec valeurs des paramètres. 7. Régler le seuil sur 0,02 puis vérifier les valeurs CT de HEX. 8. Sur la page de l analyse, cliquer sur «Cycling A, Green» (cycle A, vert) pour afficher le canal FAM. Définir les paramètres comme indiqué dans la Figure 13 ci-dessous. 9. Le tube dynamique doit être mis en surbrillance. Cliquer sur «Slope Correct» (pente correcte) et «Linear Scale» (échelle linéaire). 10. Régler le seuil sur 0,075 puis vérifier les valeurs CT de FAM. 26 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Exécuter l analyse de contrôle Une fois l analyse terminée, analyser les données de la manière suivante. Contrôle négatif : pour garantir l absence de contamination du modèle, le NTC ne doit pas générer une valeur CT inférieure à 40 dans le canal vert (FAM). Pour garantir le bon paramétrage de l analyse, le NTC doit afficher une amplification de 29,85 à 35,84 dans le canal jaune (HEX) (contrôle interne). S il y a une amplification positive dans le canal vert et/ou une amplification hors de l intervalle 29,85 à 35,84 dans le canal jaune, l échantillon n est pas valide. Contrôle positif : le contrôle positif (PC) EGFR doit présenter un CT pour chaque mélange réactionnel se trouvant à l intérieur de l intervalle (valeurs minimales et maximales incluses) indiqué au Tableau 5. Une analyse comportant une valeur de contrôle positif en dehors de cet intervalle indique un problème de paramétrage du test et doit être marquée en tant qu échec. Si le contrôle positif présente un CT compris dans l intervalle (FAM) mais que le contrôle interne présente un CT (HEX) en dehors de l intervalle de 29,85 à 35,84, poursuivre l analyse. Remarque : les données des échantillons ne doivent pas être utilisées en cas d échec d un des contrôles d analyse positif ou négatif. Tableau 5. Intervalle de valeurs CT acceptables pour les contrôles d analyse Contrôle réactionnel Test Canal Limites CT Contrôle positif Contrôle Vert (FAM) 28,13 à 34,59 T790M Vert (FAM) 30,22 à 34,98 Délétions Vert (FAM) 28,90 à 34,90 L858R Vert (FAM) 29,97 à 34,81 Contrôle négatif Ensemble des 8 mélanges réactionnels Vert (FAM) 40,00 Jaune (Hex) 29,85 à 35,84 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 27

Valeur C T FAM du contrôle négatif Valeur C T FAM < 40? NON Valeur C T HEX entre 29,85 et 35,84? OUI Contrôle négatif valide OUI ÉCHEC DE L ANALYSE NON Valeur C T FAM du contrôle positif Tube C T FAM du contrôle entre 28,13 et 34,59? OUI Tube C T FAM T790M entre 30,22 et 34,98? OUI Tube C T FAM de délétions entre 28,90 et 34,90? NON NON NON ÉCHEC DE L ANALYSE ÉCHEC DE L ANALYSE ÉCHEC DE L ANALYSE OUI NON Effectuer l analyse de l échantillon Contrôle positif valide OUI Tube C T FAM L858R entre 29,97 et 34,81? Figure 14. Déroulement de l analyse de contrôle. Sous réserve que les deux contrôles d analyse soient valides, chaque valeur CT de test de contrôle de l échantillon doit être comprise entre 23,70 et 31,10 dans le canal vert (FAM). Voir Tableau 6. Tableau 6. Intervalle de valeurs CT FAM acceptables pour la réaction de contrôle d échantillon Intervalle de valeurs CT FAM acceptables pour la réaction de contrôle d échantillon Mélange réactionnel Canal Limites acceptables de CT Contrôle Vert (FAM) 23,70-31,10 28 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Si l échantillon se trouve en dehors de ces limites, les critères suivants sont utilisés. CT de test de contrôle de l échantillon < 23,70 : les échantillons avec un CT de contrôle inférieur à 23,70 surchargeront les tests de mutation et doivent être dilués. Pour détecter chaque mutation à un faible niveau, les échantillons surconcentrés doivent être dilués afin d être compris dans l intervalle mentionné, en considérant que la dilution de moitié augmentera le CT d 1. CT de test de contrôle de l échantillon > 31,10 : l échantillon ne contient pas suffisamment d ADN pour permettre l analyse. Sous réserve que les deux contrôles d analyse soient valides et que le test de contrôle soit à l intérieur de l intervalle indiqué au Tableau 6, chaque valeur CT de mutation d échantillon doit se trouver à l intérieur de l intervalle indiqué au Tableau 7 dans le canal vert (FAM). Si l échantillon se trouve en dehors de ces limites, les critères suivants sont utilisés. Tableau 7. Valeurs de réaction de mutation d échantillon acceptables Valeurs de réaction de mutation d échantillon acceptables Réaction Mélange réactionnel Canal Limites CT T790M Vert (FAM) 0,00-40,00 Réaction de mutation Délétions Vert (FAM) 0,00-40,00 L858R Vert (FAM) 0,00-40,00 Ensemble des 3 mutations Jaune (HEX) 29,85-35,84 Remarque : si un échantillon ne génère pas de CT (c est-à-dire CT > 40), cela peut être dû à la présence d un inhibiteur, d une erreur dans la configuration du test ou à l absence d ADN amplifiable d EGFR. Valeur CT de contrôle interne comprise entre 29,85 et 35,84 : pas d ADN amplifiable d EGFR. Valeur CT de contrôle interne non comprise entre 29,85 et 35,84 : pourrait indiquer une erreur dans la configuration du test ou la présence d un inhibiteur. Il est possible de réduire l effet d un inhibiteur en diluant l échantillon, mais l ADN sera alors lui aussi dilué. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 29

Diluer l échantillon L échantillon doit être dilué OUI Valeur CT FAM du contrôle de l échantillon Valeur CT FAM test de contrôle entre 23,70 et 31,10? NON Valeur CT FAM < 23,70? OUI Valeurs CT HEX des tests de mutation du contrôle interne de l échantillon NON Valeurs CT FAM des tests de mutation de l échantillon Valeur CT FAM de chaque test de mutation entre 00,00 et 40,00? NON Valeur CT HEX du contrôle interne de mutation entre 29,85 et 35,84? OUI Valeur CT FAM < 31,10? NON OUI Le tube est positif à l amplification FAM NON Échantillon non valide Mutation non détectée L échantillon peut ne pas contenir d ADN amplifiable ou peut contenir un inhibiteur. Calculer les valeurs CT pour chaque mutation CT = CT mutation - CT de contrôle Comparer les valeurs CT aux valeurs seuil par mutation Des valeurs CT se trouvent-elles dans l intervalle de valeurs CT défini pour le test? NON Mutation non détectée OUI Mutation EGFR détectée pour le test de mutation Figure 15. Organigramme relatif à l analyse des mutations. Valeur CT FAM des tests de mutations des échantillons Les valeurs FAM des trois mélanges réactionnels de mutation doivent être vérifiées par rapport aux valeurs énumérées dans le Tableau 7. Calculer la valeur de CT de chaque échantillon de mutation indiquant une amplification positive de la manière suivante, tout en s assurant que les valeurs de CT du contrôle et de la mutation proviennent du même échantillon. CT = CT mutation - CT de contrôle Comparer la valeur CT de l échantillon avec le point seuil du test en question (voir Tableau 8) en s assurant que le point seuil correct est bien appliqué à chaque test. 30 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Tableau 8. Valeurs seuil du test de mutation Test de mutation Seuils CT T790M 7,40 Délétions 8,00 L858R 8,90 Le point seuil est le point au-dessus duquel un signal positif peut éventuellement provenir du signal de bruit de fond de l amorce ARMS sur l ADN de type sauvage. Si la valeur CT de l échantillon est supérieure au point seuil, elle est classée comme «mutation not detected» (mutation non détectée) ou hors des limites de détection du kit. Si la valeur de l échantillon est inférieure ou égale au point seuil, l échantillon est considéré comme positif pour une mutation détectée par ce test. Remarque : pour les échantillons n indiquant aucune valeur CT FAM de mutation, une évaluation du CT du contrôle interne (HEX) est nécessaire afin de déterminer si la mutation n est pas détectée ou si le test est invalide. Si la valeur CT HEX est comprise entre 29,85 et 35,84, la mutation n est pas détectée. Si la valeur CT HEX est en dehors de cet intervalle, l échantillon n est pas valide. En résumé, pour chaque échantillon, un état de mutation détectée, mutation non détectée ou mutation non valide sera attribué à chaque réaction de mutation à l aide des critères suivants. Mutation détectée : l amplification FAM est positive et les valeurs CT sont inférieures ou égales à la valeur seuil. Si plusieurs mutations sont détectées, elles peuvent toutes être rapportées. Mutation non détectée : l amplification FAM est positive, la valeur CT est supérieure à la valeur seuil et HEX (contrôles internes) est entre 29,85 et 35,84. L amplification FAM est négative et HEX (contrôle interne) est entre 29,85 et 35,84. Non valide : l amplification FAM et l amplification HEX sont hors des intervalles spécifiés. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 31

Guide de dépannage Ce guide de dépannage peut vous aider à résoudre les problèmes qui pourraient se poser. Pour de plus amples informations, consulter également la page de foire aux questions dans notre Centre d assistance technique à l adresse suivante : www.qiagen.com/faq/faqlist.aspx. Les techniciens de QIAGEN sont toujours heureux de répondre aux questions concernant les informations et les protocoles contenus dans ce manuel ou à propos des technologies d échantillonnage et de dosage (pour les coordonnées, voir la quatrième de couverture ou visiter le site www.qiagen.com). Commentaires et suggestions Aucun signal avec le contrôle positif EGFR (PC) dans le canal de fluorescence Cycling Green a) Le canal de fluorescence sélectionné pour l analyse des données de la PCR ne correspond pas au protocole Pour l analyse des données, sélectionner le canal de fluorescence Cycling Green pour la PCR analytique d EGFR et le canal de fluorescence Cycling Yellow pour la PCR du contrôle interne. b) Programmation incorrecte du profil de température sur l instrument Rotor- Gene Q c) Configuration incorrecte de la PCR d) Les conditions de conservation pour au moins un kit de composants ne respectaient pas les instructions données dans «Stockage et manipulation des réactifs» (page 10) e) Le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR a expiré Comparer le profil de température avec le protocole, répéter l analyse s il est incorrect. Vérifier les étapes de travail à l aide du schéma de pipettage et répéter la PCR si nécessaire. Vérifier les conditions de conservation et la date de péremption (voir l étiquette du kit) des réactifs et utiliser un nouveau kit si nécessaire. Vérifier les conditions de conservation et la date de péremption (voir l étiquette du kit) des réactifs et utiliser un nouveau kit si nécessaire. 32 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Commentaires et suggestions Signaux avec les contrôles négatifs dans le canal de fluorescence Cycling Green de la PCR analytique a) La contamination s est produite lors de la préparation de la PCR Répéter la PCR avec de nouveaux réactifs. Si possible, fermer les tubes de PCR directement après y avoir ajouté les échantillons à tester. S assurer que l espace de travail et les instruments sont décontaminés régulièrement. Contrôle qualité Conformément au système de gestion de la qualité certifié ISO de QIAGEN, chaque lot de kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR est testé selon des spécifications prédéterminées afin de garantir une qualité constante du produit. Limitations Les résultats obtenus avec le produit doivent être interprétés en tenant compte de tout autre résultat clinique ou de laboratoire correspondant et ne doivent pas être utilisés seuls pour établir le diagnostic. Le produit est destiné à être utilisé uniquement par le personnel ayant reçu les instructions et la formation spécialement liées aux procédures de diagnostic in vitro et à l instrument Rotor-Gene Q MDx. Les études de validation analytique ont été effectuées à l aide d ADN humain extrait d échantillons de plasma. Le produit est destiné à être utilisé uniquement sur l instrument de PCR en temps réel Rotor-Gene Q MDx. Il est nécessaire de se conformer strictement au Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR pour obtenir des résultats optimaux. Il n est pas recommandé de diluer les réactifs d une autre manière que celle décrite dans ce manuel dans la mesure où les performances en seraient affectées. Il est important de respecter les dates de péremption et les conditions de conservation imprimées sur les boîtes et les étiquettes de tous les composants. Ne pas utiliser de composants périmés ou mal conservés. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 33

Caractéristiques des performances Sensibilité analytique - limite du blanc (LoB) Afin d évaluer les performances du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR en l absence de matrice et d assurer qu un blanc d échantillon ou un échantillon contenant de l ADN de type sauvage ne génèrent pas de signal analytique pouvant indiquer une faible concentration de mutation, l ADN de type sauvage d EGFR de plasma CPNPC a été évalué sur 59 échantillons différents. Le critère d acceptation pour cette étude (au moins 95 % des échantillons de type sauvage doivent présenter une valeur CT supérieure au seuil respectif) était rempli. Limite de détection (LoD) La LoD est le pourcentage minimal d ADN mutant pouvant être détecté dans un bruit de fond d ADN de type sauvage lorsque l ADN amplifiable total (à l intérieur de l intervalle d entrée) a entraîné des détections de mutation correctes dans 95 % des cas pour chaque échantillon présentant une mutation positive (C95). L intervalle de fonctionnement d entrée d ADN pour le test est défini par le CT de contrôle à l intervalle préspécifié de 23,70 à 31,10. La LoD a été déterminée à des niveaux d entrée d ADN bas (CT de contrôle d environ 30,10) à l aide d ADN dérivé de tissu FFPE pour le kit therascreen EGFR RGQ PCR. La LoD a été déterminée à l aide d échantillons cliniques FFPE et de lignée cellulaire FFPE à des niveaux d entrée d ADN bas pour ces mutations EGFR. Les valeurs de la LoD établies à l aide de tissu FFPE ont été vérifiées pour le kit therascreen EGFR plasma RQG PCR avec de l ADN dérivé d échantillons de plasma positifs mutants artificiels. Les revendications finales de LoD répertoriées au Tableau 9 ci-dessous indiquent le pourcentage de mutation ayant donné une probabilité prédictive de détections correctes de 95 % pour chacune des mutations. 34 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Tableau 9. LoD pour chacun des tests de mutation EGFR Exon Mutation ID COSMIC* Revendication de LoD en % 20 T790M 6240 17,5* 6223 6,4* 13551 4,24* 12728 2,43 12419 16,87 12422 3,24 6218 9,83 6210 7,44 6254 10,2* 12370 8,1* 19 Délétions 12678 10,40 12367 4,39 12384 7,54 6225 6,5* 6220 2,7* 6255 0,81* 12382 1,45* 12383 4,58* 12387 4,91 12369 4,94* 21 L858R 6224 5,94* * Revendications de LoD vérifiées dans le plasma dans le cadre de l étude de confirmation de la LoD du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Ces mutations n ont pas été confirmées dans le plasma. Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 35

Sensibilité analytique - seuils CT Une approche fondée sur l analyse des risques a été adoptée en ce qui concerne les taux de faux positifs lors de la définition des seuils de test, et les valeurs de LoB estimées ont été utilisées en tant que composant dans le développement des valeurs seuil. Les seuils CT respectifs pour chaque test de mutation dans le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR sont indiqués au Tableau 10. Tableau 10. Seuils CT du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Test de mutation Seuils CT T790M 7,40 Délétion 8,00 L858R 8,90 Répétabilité et reproductibilité La répétabilité et la reproductibilité ont été évaluées en testant le niveau de mutation à 3 LoD dans un bruit de fond d ADN génomique de type sauvage sur trois sites de test, à l aide de plusieurs lots de kit, en faisant intervenir plusieurs opérateurs et analyses sur plusieurs jours, avec deux réplicats de chaque échantillon. Pour chacun des trois tests de mutation, 100 % des échantillons d ADN mutant ont présenté un résultat de mutation positif. Les échantillons de type sauvage ont donné un résultat de mutation négatif dans tous les tests et sur tous les sites. Effet de la concentration d ADN d entrée Cette étude a été réalisée à l aide d ADN extrait de tissu FFPE. Pour déterminer l effet de la modification de la concentration d ADN d entrée sur les résultats produits par le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR proches de la LoD, un ensemble d échantillons a été développé pour toutes les mutations, en mélangeant de l ADN mutant synthétique avec de l ADN génomique de type sauvage pour produire des échantillons présentant des niveaux totaux faibles, moyens et élevés d ADN d entrée. Les niveaux faibles et élevés d ADN d entrée ont été ciblés pour représenter l intervalle de valeurs CT du test de contrôle (23,70 à 31,10). Une évaluation de l ensemble des données de l ADN d entrée (à des concentrations proches de la LoD et à trois niveaux d ADN d entrée différents) ont révélé un taux de mutation positive de 95,44 %. 36 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Ces données indiquent que la variation du niveau de l ADN d entrée, au sein de l intervalle de fonctionnement du test, n a pas d influence sur la valeur CT ou sur la détection d une mutation d un échantillon. Substances interférentes Substances interférentes endogènes Les substances potentiellement interférentes ont été dopées dans des échantillons de plasma positifs mutants artificiels à 3 LoD. Les échantillons ont ensuite été testés avec le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Les échantillons contenant les substances potentiellement interférentes ont été comparés aux échantillons de plasma positifs mutants artificiels à 3 LoD ne contenant aucune substance interférente dopée. Chaque substance interférente a été testée avec 4 réplicats. Une différence > 2 écarts-types (à partir de l étude de précision) entre le CT du «test» et celui du «contrôle» (aucune substance interférente) a été interprétée comme indiquant une interférence potentielle. Dans ces cas, la différence observée en CT est fournie. Les concentrations de test fournies au Tableau 11 ont été sélectionnées sur la base des directives du protocole EP07-A2 du CLSI. Elles sont représentatives des concentrations maximales pouvant être observées dans un échantillon clinique. Remarque : ces composés endogènes ont été dopés dans des échantillons de plasma positifs mutants artificiels comprenant du plasma de donneurs sains. Ainsi, ces composés endogènes auraient été naturellement présents dans les échantillons à des concentrations inconnues avant le dopage. La concentration finale de chaque substance potentiellement interférente endogène testée serait probablement supérieure à la concentration de test. Tableau 11. Substances potentiellement interférentes endogènes Substance potentiellement interférente Bilirubine non conjuguée Hémoglobine (humaine) Triglycérides Concentration de test 150 mg/dl 2 g/dl 3 g/dl Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 37

Test T790M Il a été démontré que les composés endogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 11 ont un effet > 2 écarts-types (0,40 CT) sur les performances du test T790M : Triglycérides, différence de 1,37 CT Test de délétions Il a été démontré que les composés endogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 11 ont un effet > 2 écarts-types (0,71 CT) sur les performances du test de délétions : Hémoglobine, différence de 0,80 CT Test L858R Il a été démontré que les composés endogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 11 ont un effet > 2 écarts-types (0,56 CT) sur les performances du test L858R : Bilirubine, différence de 1,13 CT Triglycérides, différence de 1,53 CT Substances interférentes exogènes Les substances potentiellement interférentes ont été dopées dans des échantillons de plasma positifs mutants artificiels à 3 LoD. Les échantillons ont ensuite été testés avec le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Les échantillons contenant les substances potentiellement interférentes ont été comparés aux échantillons de plasma positifs mutants artificiels à 3 LoD ne contenant aucune substance interférente dopée. Chaque substance interférente a été testée avec 4 réplicats. Une différence > 2 écarts-types (à partir de l étude de précision) entre le CT du «test» et le CT du «contrôle» (aucune substance interférente) a été interprétée comme indiquant une interférence potentielle. Dans ces cas, la différence observée en CT est fournie. Les concentrations de test fournies au Tableau 12 ont été sélectionnées sur la base des directives du protocole EP07-A2 du CLSI. Elles dépassent la concentration thérapeutique dans chaque cas. 38 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Tableau 12. Substances potentiellement interférentes exogènes Substance potentiellement interférente Concentration de test (µg/ml) Bromhydrate de citalopram 0,75 Chlorhydrate hémihydrate de paroxétine 1,14 Chlorhydrate de sertraline 0,67 Chlorhydrate de fluoxétine 3,87 Acétaminophène 200,7 K2 EDTA 3600 Test T790M Il a été démontré que les composés exogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 12 ont un effet > 2 écarts-types (0,40 CT) sur les performances du test T790M : Bromhydrate de citalopram, différence de 0,52 CT Chlorhydrate de sertraline, différence de 0,47 CT Chlorhydrate de fluoxétine, différence de 0,48 CT Test de délétions Il a été démontré que les composés exogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 12 ont un effet > 2 écarts-types (0,71 CT) sur les performances du test de délétions : Fluoxétine, différence de 0,73 CT Test L858R Il a été démontré que les composés exogènes suivants aux concentrations indiquées au Tableau 12 ont un effet > 2 écarts-types (0,56 CT) sur les performances du test L858R : Bromhydrate de citalopram, différence de 0,72 CT Chlorhydrate hémihydrate de paroxétine, différence de 0,92 CT Chlorhydrate de sertraline, différence de 0,82 CT Chlorhydrate de fluoxétine, différence de 0,98 CT Acétaminophène, différence de 0,81 CT K2 EDTA, différence de 0,57 CT Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 39

Performances cliniques L essai clinique NCT01203917 était une étude ouverte à un seul bras de phase IV destinée à évaluer l efficacité et l innocuité/la tolérabilité du géfitinib de première intention chez les patients caucasiens atteints de CPNPC de phase IIIA/B/IV, positif à la mutation EGFR. L admissibilité des patients à l essai clinique NCT01203917 a été déterminée en fonction de la présence de mutations EGFR sensibilisantes. L état mutationnel du gène EGFR des patients atteints de CPNPC a été évalué à l aide du test clinique (CTA pour Clinical Trial Assay) et avec de l ADN provenant d échantillons de tissu et de plasma correspondants. L étude comprenait un objectif exploratoire de biomarqueur déjà planifié en vue de déterminer si les échantillons de plasma pouvaient être considérés pour l analyse de la mutation en cas d indisponibilité des échantillons de tissu. Les résultats ont démontré des taux de concordance élevés entre les échantillons de tissu et de plasma correspondants à 94,3 %, avec une spécificité du test de 99,8 % et une sensibilité de 65,7 % 1. Des tests rétrospectifs d échantillons de plasma issus de patients dépistés avec l essai clinique NCT01203917 ont été effectués à l aide du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR. Une étude de transition a été réalisée afin d évaluer la concordance du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR avec le CTA utilisé pour sélectionner les patients admis à l essai clinique NCT01203917. L équivalence entre le CTA et le kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR a été établie. 40 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Références 1. Douillard, J.Y., et al. (2014). First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients: a phase-iv, open-label, single-arm study. Br J Cancer 110(1), 55. Symboles Les symboles suivants peuvent apparaître sur l emballage et l étiquetage : <N> Contient des réactifs pour <N> tests À utiliser avant Dispositif médical de diagnostic in vitro Numéro de référence Numéro de lot Numéro de matériel Composants Contient Nombre Code article international (GTIN) Limite de température Fabricant Consulter les instructions d utilisation Avertissement Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 41

Coordonnées Pour obtenir une assistance technique et plus d informations, consulter notre Centre d assistance technique à l adresse www.qiagen.com/support ou contacter l un des services techniques de QIAGEN ou l un des distributeurs locaux (voir quatrième de couverture ou le site www.qiagen.com). 42 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Annexe A : informations concernant la mutation Les identifiants COSMIC sont tirés du Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (catalogue des mutations somatiques associées au cancer, http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/). Tableau 13. Liste des mutations et des identifiants COSMIC Mutation Exon Changement de base ID COSMIC T790M 20 2369C>T 6240 L858R 21 2573T>G 6224 2235_2249del15 6223 2235_2252>AAT (complexe) 13551 2236_2253del18 12728 2237_2251del15 12678 2237_2254del18 12367 2237_2255>T (complexe) 12384 2236_2250del15 6225 2238_2255del18 6220 2238_2248>GC (complexe) 12422 Délétions 19 2238_2252>GCA (complexe) 12419 2239_2247del9 6218 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 (complexe) 2239_2258>CA (complexe) 12387 2240_2251del12 6210 2240_2257del18 12370 2240_2254del15 12369 2239_2251>C (complexe) 12383 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 43

Pour commander Produit Sommaire N réf. therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit (24) Rotor-Gene Q et ses accessoires Pour 24 réactions : 1 test de contrôle, 7 tests de mutation, contrôle positif, Taq ADN polymérase 870311 Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM System Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Rotor-Gene Q 5plex HRM System Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Instrument de PCR en temps réel et analyseur de fusion haute résolution à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre) plus canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre, installation et formation non comprises Instrument de PCR en temps réel et analyseur de fusion haute résolution à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre) plus canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre, installation et formation Instrument de PCR en temps réel et analyseur de fusion haute résolution à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre) plus canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre, installation et formation non comprises Instrument de PCR en temps réel et analyseur de fusion haute résolution à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre) plus canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre, installation et formation 9002033 9002032 9001650 9001580 44 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

Produit Sommaire N réf. Loading Block 72 0.1 ml Tubes Bloc en aluminium pour préparation de réaction manuelle avec pipette à canal unique dans des tubes de 72 0,1 ml 9018901 Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Produits connexes QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 250 barrettes de 4 tubes et capuchons pour 1 000 réactions 10 250 barrettes de 4 tubes et capuchons pour 10 000 réactions Pour 50 préparations : colonnes QIAamp Mini, extensions de tube (20 ml), protéinase K QIAGEN, ARN entraîneur, tampons, VacConnectors et tubes de prélèvement (1,5 ml et 2 ml) 981103 981106 55114 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014 45

Cette page est intentionnellement laissée vierge. 46 Manuel du kit therascreen EGFR Plasma RGQ PCR 12/2014

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