Place des outils virologiques dans la prise en charge de l hépatite chronique B Role of virological tools in the management of chronic hepatitis B Stéphane Chevaliez, Jean-Michel Pawlotsky Centre national de référence des hépatites B, C et delta, Laboratoire de Virologie, Inserm U841, Hôpital Henri Mondor, Université Paris 12, Créteil <jean-michel.pawlotsky@hmn.aphp.fr> Résumé. Les outils virologiques, sérologiques et moléculaires, sont aujourd hui indispensables dans la prise en charge de l hépatite chronique virale B, à la fois pour le diagnostic de l infection, la mise en place du traitement antiviral, et le suivi de la réponse virologique au traitement. De nouveaux tests, comme la détermination du génotype du VHB ou l identification des substitutions amino-acidiques associées à la résistance du VHB aux analogues nucléos(t)idiques, pourraient trouver bientôt une application clinique. Mots clés : virus de l hépatite B, PCR en temps réel, résistance, suivi de la réponse virologique Abstract. Virological tools (molecular and serological) are essential for the management of chronic hepatitis B, not only for diagnostic purpose, but also for making treatment decision and assessing antiviral therapy efficacy. New tests, such as HBV genotype determination and identification of amino-acid mutations associated with HBV resistance to nucleos(t)ide analogues, are becoming available for implementation in clinical practice. Key words : hepatitis B virus, real-time PCR, resistance, follow-up of virological response L e diagnostic et le suivi virologiques de l hépatite chronique B font appel à deux types de tests : les tests directs qui permettent la mise en évidence du virus ou de l un de ses constituants et les tests indirects qui permettent la mise en évidence de marqueurs sériques témoignant d un contact du malade avec le virus. Les outils virologiques Six marqueurs virologiques ont une utilité en pratique clinique : l antigène (Ag) de surface du virus de l hépatite B (AgHBs), les anticorps anti-hbs, l antigène HBe (AgHBe), les anticorps anti-hbe, les anticorps dirigés contre la protéine de capside (anticorps anti-hbc totaux et IgM anti-hbc) et l ADN viral. Détection des antigènes et anticorps du VHB La détection des antigènes viraux et des anticorps spécifiques dans les fluides biologiques est fondée sur l utilisation de tests immunoenzymatiques de type ELISA (enzyme-linked immunosorbentassay). Ces tests sont appelés «sandwich» car l antigène ou l anticorps recherchés sont pris en «sandwich» entre deux anticorps lorsqu il s agit d un antigène ou entre un antigène et un antianticorps lorsqu il s agit d un anticorps. Les méthodes immunoenzymatiques sont faciles à utiliser, automatisables et, de ce fait, permettent de traiter un grand nombre d échantillons. Elles sont en outre peu coûteuses. doi: 10.1684/hpg.2007.0140 16
Antigène HBs La présence de l AgHBs dans le sérum ou le plasma pendant plus de 6 mois définit l infection chronique par le VHB. La sensibilité et la spécificité des tests de détection de l AgHBs ont été récemment améliorées [1]. Les résultats faussement positifs sont extrêmement rares. Ils peuvent être observés lorsque les échantillons sanguins ont été recueillis sur héparine, sont hémolysés (hémoglobine supérieure à 1,4 g/dl) ou ictériques (bilirubine supérieure à 30,9 mg/dl) [2], ou parfois chez certaines femmes enceintes, ou chez des patients atteints d infections aiguës ou chroniques, de maladies auto-immunes ou d hépatites chroniques d autres causes [2-4]. En pratique, une première détection de l AgHBs doit être obligatoirement confirmée par un test de neutralisation afin d éliminer un éventuel faux positif. Dans certaines circonstances, l AgHBs peut ne pas être détecté au cours d une infection chronique par le VHB : chez un porteur inactif du VHB avec un très faible niveau de réplication virale ; lorsque des substitutions amino-acidiques de l AgHBs empêchent sa détection par les tests sérologiques (hépatite B occulte) [5-12] ; chez des patients ayant une hépatite chronique B et recevant une chimiothérapie antivirale efficace ; chez des patients ayant une infection par le virus de l hépatite delta associée à l infection par le VHB, qui inhibe la réplication de ce dernier [13, 14]. Anticorps anti-hbs La présence d anticorps anti-hbs signe la guérison de l infection chronique B lorsqu ils sont associés aux anticorps anti-hbc. Leur titre peut fluctuer au cours du temps et ils peuvent devenir indétectables plusieurs années après la résolution d une infection aiguë B. Anticorps anti-hbc Les anticorps anti-hbc sont des marqueurs sériques précoces de l infection par le VHB. Les IgM anti-hbc, présentes à un fort titre au cours de l infection aiguë, peuvent également être présentes à un faible titre au cours de la phase d immuno-élimination de l hépatite chronique B et peuvent également réapparaître en cas de réactivation. Les IgG anti-hbc sont le témoin du contact avec le VHB et persistent toute la vie (tableau 1). Les résultats faussement positifs de détection des anticorps anti-hbc sont rares. La caractérisation plus fine des anticorps anti-hbc, comme la détermination des sous-classes d IgG ou l étude de l avidité des anticorps, n a pour l instant pas d utilité en pratique clinique [15-17]. Antigène HBe et anticorps anti-hbe L antigène HBe est un marqueur indirect de la réplication virale. Il est détecté précocement au cours de l infection aiguë et disparaît rapidement chez les patients qui guérissent. Il persiste initialement chez les patients qui développent une infection chronique (tableau 1). Deux types d hépatites chroniques B peuvent être observées : les hépatites chroniques à AgHBe positif et les hépatites chroniques à AgHBe négatif, liées à une infection par un VHB portant des substitutions nucléotidiques dans la région pré-c du gène pré-c/c et/ou dans la région promotrice du core. La clairance de l AgHBe est suivie de l apparition d anticorps anti-hbe au cours de la phase de séroconversion HBe. Au cours de l infection chronique, le taux moyen de séroconversion HBe spontanée est d environ 6 % par an [18]. Quantification de l ADN du VHB Différentes méthodes de biologie moléculaire permettent la détection et la quantification de l ADN du VHB dans les liquides biologiques, afin d évaluer le niveau de la réplication virale. Deux types de techniques d amplification peuvent être utilisées pour quantifier l ADN du VHB : les méthodes d amplification de la cible, de type polymerase chain reaction (PCR) et les méthodes d amplification du signal, comme la capture d hybrides ou la technique des ADN branchés (tableau 2). Quelle que soit la technique utilisée, l expression des résultats en unités internationales par Tableau 1. Marqueurs virologiques au cours des différentes phases de l infection par le VHB. Stades de l infection VHB AgHBs Anti-HBs AgHBe Anti-HBe Anti-HBc ADN VHB b IgM IgG Hépatite chronique B AgHBe-positif, + - + - - a + >2 10 4 UI/ml Réplicant AgHBe-négatif, + - - + - a + >2 10 3 UI/ml Réplicant Porteur inactif + - - + - + <2 10 3 UI/ml Réactivation + - +/- +/- +/- + >2 10 4 UI/ml a Les IgM anti-hbc peuvent être détectables à de faibles titres. b Valeurs seuils de charge virale définies par les sociétés savantes (EASL, AASLD et APASL). 17
Tableau 2. Tests de détection et de quantification de l ADN du VHB (UI : unité internationale). Test Fabricant Méthode Seuil inférieur de détection Amplification du signal HBV Hybrid-Capture II Ultra-sensitive HBV Hybrid-Capture II Versant HBV DNA 3.0 Assay Digene Corp., Gaithersburg, Maryland Digene Corp., Gaithersburg Maryland Siemens Medical Solution Diagnostics Tarrytown, New York Amplification de la cible Amplicor HBV Monitor Roche Molecular Systems Pleasanton, Californie Cobas Amplicor HBV Monitor Cobas Taqman HBV Real-Art HBV PCR assay Roche Molecular Systems Pleasanton, Californie Roche Molecular Systems Pleasanton, Californie Qiagen, Hamburg Allemagne millilitre (UI/mL) est indispensable afin d homogénéiser les résultats entre laboratoires de diagnostic et d appliquer les résultats des essais thérapeutiques à la pratique clinique. Les techniques classiques de détection et d amplification de l ADN du VHB sont progressivement remplacées dans les laboratoires de virologie par les techniques de PCR dite «en temps réel» [19]. Ces dernières bénéficient d un intervalle de quantification linéaire étendu, adapté à la mesure des charges virales observées en pratique clinique chez les patients traités ou non traités. Les techniques de PCR en temps réel sont plus sensibles que les techniques de PCR classiques, n exposent pas au risque de faux positifs liés à des contaminations et ont la possibilité d être entièrement automatisées, ce qui réduit considérablement le temps d analyse (moins de 6 heures) [19]. Plusieurs trousses de PCR en temps réel sont d ores et déjà disponibles : Cobas Ampliprep -Cobas TaqMan HBV (CAP/CTM, Roche Molecular Systems, Pleasanton, Californie), dont les performances intrinsèques sont satisfaisantes (Chevaliez et al., manuscrit soumis), et Real-Art HBV PCR Assay (Qiagen, Hambourg, Allemagne) (tableau 2). D autres trousses sont en cours de développement. Analyse de la séquence du génome du VHB L analyse des séquences génomiques est fondée soit sur le séquençage direct des produits d amplification de la région d intérêt après PCR, soit sur des méthodes Intervalle de quantification Capture d hybrides 142 000 copies/ml 142 000-1 700 000 000 copies/ml Capture d hybrides 4 700 copies/ml 4 700-57 000 000 copies/ml ADN branchés semi-automatisés PCR compétitive manuelle PCR compétitive semi-automatisée 357 UI/mL 357-17 857 000 UI/mL 180 UI/ml 180-715 000 UI/mL 35 UI/mL 35-35 700 UI/mL PCR temps réel Extraction automatique AmpliPrep possible 12 UI/mL 54-110 000 000 UI/mL PCR temps réel 4 UI/mL 4-100 000 000 UI/mL qui permettent d identifier des substitutions à des positions nucléotidiques particulières. L analyse de la séquence nucléotidique ou aminoacidique d une partie du génome viral est la méthode de référence. Elle permet la détermination du génotype du VHB par analyse phylogénique, ainsi que l identification des substitutions amino-acidiques associées à la résistance au traitement par les analogues nucléos(t)idiques (figure 1). Elle permet également l identification des variants viraux porteurs de polymorphismes nucléotidiques au niveau de la région pré-c ou de la région promotrice du core associés à un blocage ou à une réduction de la production de la protéine HBe, qui n a pas d application en pratique clinique. Une trousse commerciale, Trugene HBV Genotyping Kit (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Tarrytown, New York) a été développée et permet la détermination du génotype de la souche de VHB et l identification des mutations de résistance par séquençage d une portion de la région codant pour la polymérase virale et l antigène HBs. En dehors du séquençage des produits de PCR, la technique la plus utilisée est la technique du «Line Probe Assay» (INNO-LiPA, Innogenetics, Gand, Belgique), fondée sur l hybridation inverse de produits de PCR à des sondes oligonucléotidiques fixées sur un support solide [20-22]. Le test INNO-LiPA HBV DR permet de détecter la présence de mutations connues pour être associées à la résistance à la lamivudine et à l adéfovir, mais pour l instant pas des mutations décri- 18
Protéine terminale Spacer POLYMÉRASE TRANSCRIPTASE INVERSE Rnase H 1 183 349 (rt1) 692 (rt344) 845 a.a. GVGLSPFLLA YMDD I(G) II(F) A B C D E Résistance lamivudine Résistance adéfovir Résistance entécavir* Résistance telbivudine tes pour conférer la résistance à l entécavir (figure 1). Le test INNO-LiPA HBV Genotyping permet d identifier le génotype du VHB à partir du même produit d amplification [20, 23]. Le test INNO-LiPA HBV Precore permet la détection des substitutions nucléotidiques dans les régions pré-c et promotrice du core à partir d un produit d amplification différent. De nouvelles techniques sont en développement, comme la spectrométrie de masse ou les technologies utilisant des puces à ADN [24, 25]. Ces nouvelles techniques présenteront l avantage de détecter simultanément un grand nombre de mutations et d identifier des variants viraux très minoritaires au sein des populations virales circulantes. Utilisation pratique des outils virologiques au cours de l hépatite chronique B Diagnostic de l hépatite chronique B * Les mutations rtl180m et rtm204v doivent être préexistantes L infection chronique par le VHB est définie par la persistance pendant plus de 6 mois de laghbs dans le rtl180m rtv173l rta181v rtt184 S/A/I/LT rtl180m rtm204 V/I/S S202G/C rtm204i rtn236t rtm250 I/V Figure 1. Substitutions amino-acidiques du domaine transcriptase inverse de l ADN polymérase du VHB associées à la résistance aux quatre analogues nucléos(t)idiques utilisés dans le traitement de l hépatite chronique B. Les différents sous-domaines de la transcriptase inverse (A à G) sont représentés. Le domaine catalytique YMDD du sous-domaine C est figuré. sérum ou le plasma des patients infectés. Celle-ci peut être associée à la persistance d anomalies biologiques (augmentation de l activité sérique des aminotransférases : ALAT > 19 UI/L pour les femmes et > 30 UI/L pour les hommes [26, 27]) ou cliniques. Chez un porteur chronique du VHB, le niveau de la charge virale et l activité sérique des aminotransférases sont généralement corrélés à la sévérité de l atteinte hépatique et au pronostic évolutif de celle-ci [26, 27]. La figure 2 montre la cinétique d évolution des marqueurs virologiques au cours d une infection par le VHB évoluant vers la chronicité. Au cours de l infection chronique virale B, l AgHBs et les anticorps anti-hbc totaux sont présents. La charge virale doit être systématiquement mesurée afin d évaluer le niveau de la réplication virale [28]. Deux phénotypes peuvent être observés : les hépatites chroniques à AgHBe positif et les hépatites chroniques à AgHBe négatif. Les malades ayant un AgHBe présent en l absence d anticorps anti-hbe sont infectés par une souche virale dite «sauvage». Ces sujets ont le plus souvent un niveau de réplication virale élevé (>2x10 4 UI/mL). Les malades ayant des anticorps anti-hbe en l absence d AgHBe 19
AgHBe ADN VHB Anti-HBe Titre Infection aiguë IgM anti-hbc AgHBs Infection chronique Anticorps anti-hbc totaux 0 4 8 12 16 20 24 32 28 36 52 sont infectés par une souche dite «mutante», c est-àdire présentant une ou plusieurs substitution(s) nucléotidique(s) dans la région pré-c ou dans la région promotrice du core, dont la conséquence est un blocage ou une diminution de la synthèse de la protéine HBe. En règle générale, les patients AgHBe-négatifs ont une réplication virale plus faible que les patients AgHBe-positifs. En France, les patients AgHBe-négatifs représentent plus de 60 % des patients atteints d hépatite chronique B [29]. Les porteurs inactifs du VHB ont en général des niveaux de réplication virale faibles (< 2 x 10 3 UI/mL), avec une activité sérique des aminotransférases normale et des anticorps anti-hbe présents en l absence d AgHBe. Évaluation de la sévérité de l atteinte hépatique et pronostic Le niveau de la charge virale et l activité sérique des aminotransférases sont des critères importants d évaluation de la sévérité de l atteinte hépatique. L étude REVEAL, qui a porté sur plus de 3 000 patients taïwanais ayant une infection chronique par le VHB, a montré qu une charge virale élevée était associée à une incidence plus élevée de cirrhose et de carcinome hépatocellulaire [30, 31] et ce, indépendamment du statut HBe ou d autres paramètres comme l activité sérique des aminotransférases. Le risque de cancer primitif du foie est faible en l absence d ADN du VHB détectable, excepté chez les patients cirrhotiques qui peuvent développer un carcinome hépatocellulaire malgré l absence de réplication virale. Semaines après contage Années Figure 2. Cinétique des marqueurs virologiques du VHB au cours de l hépatite aiguë B qui devient chronique. Traitement de l hépatite chronique B L objectif du traitement antiviral est d éliminer ou de réduire significativement la réplication virale afin de prévenir la progression de la maladie hépatique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Décision de traiter. Chez les malades ayant une hépatite chronique B, la décision thérapeutique est fondée sur l évaluation de multiples paramètres cliniques, biologiques et pronostiques, dont les plus importants sont le niveau de la charge virale, le niveau d activité sérique des aminotransférases, et la sévérité de l atteinte hépatique. Le traitement antiviral est indiqué chez les malades ayant une charge virale supérieure à2x10 4 UI/mL et une activité sérique des aminotransférases supérieure à deux fois la limite supérieure de la normale [26, 32-34]. Chez les malades ayant une activité sérique des aminotransférases modérément augmentée (entre 0,5 et 2 fois la limite supérieure de la normale) et une charge virale comprise entre 2x10 3 UI/mL et 2x10 4 UI/mL, l évaluation histologique ou non invasive de l atteinte hépatique est recommandée, particulièrement chez les sujets de plus de 40 ans. Si une activité nécrotico-inflammatoire et/ou une fibrose modérée à sévère est (sont) observée(s), le traitement antiviral est indiqué [26, 32-34]. La décision de traiter est difficile chez les malades ayant un AgHBe négatif, un ADN du VHB détectable et une fibrose minime à modérée, car aucun seuil de réplication au-dessus duquel le traitement est indiqué n a été clairement défini. Des études prospectives sont 20
nécessaires pour déterminer les valeurs de charge virale au-dessus desquelles les patients atteints d hépatite chronique B devraient être traités, ou en-dessous desquelles les patients ne devraient pas être traités. Choix du schéma thérapeutique. Le traitement de l hépatite chronique B est fondé sur l utilisation de deux classes de molécules antivirales : l interféron alpha pégylé et les analogues nucléos(t)idiques, inhibiteurs puissants et sélectifs de la transcriptase inverse de l ADN polymérase virale. Quatre analogues nucléos(t)idiques sont autorisés en France dans le traitement de l hépatite chronique B : la lamivudine (Zeffix, GlaxoSmithKline), l adéfovir dipivoxil (Hepsera, Gilead Sciences), l entécavir (Baraclude, Bristol- Myers Squibb) et la telbivudine (Tyzeka, Novartis). Il n existe pour l instant pas de consensus sur le traitement de première intention de l infection chronique par le VHB. Les patients infectés par un virus sauvage (AgHBe positif) ayant une charge virale modérée et une activité sérique des ALAT élevée (> 2-5 fois la limite supérieure de la normale) sont de bons candidats au traitement par l interféron alpha pégylé. Les génotypes A et B semblent mieux répondre à l interféron alpha pégylé que les génotypes C et D [35, 36]. Néanmoins, aucune étude n a montré à ce jour l intérêt individuel de la détermination du génotype pour orienter le traitement antiviral. Les patients ayant un AgHBe positif et n ayant pas répondu au traitement de première ligne par l interféron alpha pégylé, ainsi que les malades ayant une hépatite chronique B à antigène HBe négatif, sont candidats à un traitement prolongé, probablement à vie, par les analogues nucléos(t)idiques. La combinaison de plusieurs molécules antivirales en première intention permet de retarder la survenue de la résistance par rapport aux monothérapies ou aux traitements séquentiels. Suivi de l efficacité antivirale du traitement. Quels que soient le statut sérologique HBe et le traitement entrepris, l évaluation de l efficacité du traitement antiviral est fondée sur des mesures répétées de la charge virale et de l activité sérique des ALAT, en principe tous les 3à6mois [37]. Chez les patients ayant un AgHBe positif, l efficacité du traitement antiviral est attestée par la perte de l antigène HBe, suivie de l apparition des anticorps anti-hbe (séroconversion HBe), une réduction de la charge virale au-dessous de 2x10 4 UI/mL et une normalisation de l activité sérique des ALAT. Chez les patients infectés à la naissance ou au cours de la petite enfance ayant eu une phase d immunotolérance très longue (10 à 40 ans), la séroconversion HBe pourrait ne pas être le critère de réponse le plus adapté, car des données récentes ont suggéré que la maladie hépatique continuait de progresser après la séroconversion HBe. Chez ces patients, l objectif du traitement doit être un ADN du VHB indétectable par une méthode sensible et une normalisation de l activité sérique des ALAT [38]. Chez les patients ayant un AgHBe négatif ou chez les patients AgHBe-positifs n ayant pas obtenu de séroconversion après un traitement à court terme, qui reçoivent des analogues nucléos(t)idiques, l objectif du traitement est que l ADN du VHB soit indétectable par une méthode de PCR sensible avec un seuil de détection de 10-15 UI/mL et que l activité sérique des ALAT soit normale [26, 32-34]. Néanmoins, cet objectif n est pas toujours atteint et il est recommandé que la réplication virale soit maintenue au niveau le plus bas possible pendant le plus longtemps possible (idéalement à vie). Dans tous les cas, lorsqu une réponse virologique au traitement a été observée (réduction significative de la charge virale) et qu elle est suivie d une rechute caractérisée par une augmentation de la charge virale d au moins 1 Log 10 UI/mL par rapport au nadir, une résistance virale au traitement doit être suspectée, après vérification de l observance thérapeutique [37]. La mise en évidence des substitutions aminoacidiques associées à la résistance n a pas d indication claire en pratique clinique aujourd hui, mais elle pourrait devenir indispensable dans un avenir proche pour guider la prescription thérapeutique de molécules de plus en plus nombreuses, à condition que des algorithmes décisionnels consensuels soient établis, permettant d orienter la thérapeutique en fonction des résultats de cet examen. Suivi des hépatites B non traitées Le traitement n est habituellement pas recommandé lorsque l ADN viral est indétectable ou inférieur à 2 x 10 4 UI/mL, avec une activité sérique des ALAT normale [26]. La surveillance régulière des hépatites B non traitées est conseillée. Elle comprend la surveillance biologique de l activité sérique des aminotransférases tous les 3 à 6 mois. L évaluation de l atteinte hépatique est recommandée, à l aide d une méthode invasive (biopsie hépatique) ou non invasive (marqueurs de fibrose ou élastométrie) lorsque l activité sérique des aminotransférases augmente de façon intermittente ou permanente. La quantification de l ADN du VHB est utile tous les 3 à 6 mois afin de détecter une augmentation de la charge virale et de reconsidérer l indication thérapeutique. Chez les patients ayant une cirrhose, la détermination du taux de prothrombine et la surveillance de la survenue du carcinome hépatocellulaire par échographie et dosage de l a-fœtoprotéine sont indispensables. 21
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