Valeur prédictive de la surexpression/

revue Valeur prédictive de la surexpression/ amplification de Her2/neu pour un traitement ciblé du cancer du sein Rev Med Suisse 2009 ; 5 : 1525-9 H.-A. Lehr S. C. Schaefer J.-F. Delaloye Pr Hans-Anton Lehr Dr Stephan C. Schaefer Institut universitaire de pathologie Pr Jean-François Delaloye Département de gynécologie et d obstétrique CHUV, 1011 Lausanne hans-anton.lehr@chuv.ch Predictive value of Her2/neu expression/ amplification for the targeted treatment of breast cancer Her2/neu is a tyrosine kinase receptor which stimulates cell growth. The receptor is overexpressed in about 20% of breast cancers. Her2/neu expression is an indicator of poor prognosis but also the target of the treatment of breast cancer using humanised anti-her2/ neu antibodies. Only cancers overexpressing the protein will respond to this therapy, but which has significant (cardiac) side effects and is expensive. It is therefore important to test for the overexpression of the protein on breast cancer cells. This paper discusses how this can be done and ongoing research into new therapeutic options targeting the involved signaling pathways. Her2/neu est un récepteur tyrosine kinase qui favorise la croissance cellulaire. Il est surexprimé dans environ un quart des cancers du sein. Her2/neu n est pas seulement un facteur pronostique (négatif), mais en même temps la cible pour une thérapie anti-her2/neu utilisant des anticorps humanisés (trastuzumab). Il est donc important de démontrer correctement la surexpression de Her2/neu sur les cellules tumorales car le traitement par trastuzumab est très cher et s accompagne d importants effets indésirables cardiaques. Cet article présente la situation actuelle de ce diagnostic (par immunohistochimie et par hybridation in situ), ainsi que plusieurs lignes de recherche qui tentent d améliorer dans un futur proche la valeur prédictive de Her2/neu pour un traitement dirigé contre les voies de signalisation contrôlées par ce récepteur. introduction Dans les pays industrialisés, plus d une femme sur dix va développer un cancer du sein et beaucoup vont décéder de leur maladie. A côté des chimiothérapies classiques, censées détruire non spécifiquement les cellules se divisant rapidement, attaquer les voies spécifiques qui initient ou maintiennent la croissance et l invasion des cellules cancéreuses se révèle très prometteur pour traiter plus efficacement le cancer du sein. Le gène du cancer Erb2 contrôle la quantité de Her2/neu, une protéine favorisant la croissance et exprimée à la surface des cellules du cancer du sein. Her2 signifie human epidermal growth factor receptor 2 et code pour un récepteur tyrosine kinase transmembranaire de 185 kda. Amplifié, ce gène produit des taux élevés de Her2/neu à la surface des cellules, ainsi que des taux anormalement élevés de tyrosine kinase. L amplification et la surexpression de Her2/neu s observent dans environ 20% des carcinomes canalaires in situ ou invasifs du sein, alors qu elles sont absentes dans les lésions prémalignes. 1 La surexpression de Her2/neu par les cancers primaires est plus fréquemment associée à une taille tumorale plus grande, à des métastases ganglionnaires, à un plus mauvais pronostic et elle diminue la survie globale. 1 Les patientes, dont les tumeurs sont positives pour Her2/neu, tendent à répondre moins bien à l hormonothérapie, mais une certaine évidence suggère que l effet prédictif négatif de Her2/neu se limite aux traitements modulant les récepteurs aux œstrogènes (le tamoxifène), alors que les médicaments inhibant la synthèse des œstrogènes (les inhibiteurs de l aromatase) ne sont pas affectés négativement par la positivité de Her2/neu. Sur un autre plan, les tumeurs se caractérisant par une surexpression de Her2/neu ou par une amplification de son gène tendent à mieux répondre aux chimiothérapies à base d anthracyclines, même si cet effet est peut-être indirect et associé à la coamplification fréquente de Her2/neu et de la topo-isomérase II alpha, cible directe de ces agents. Des résultats récents suggèrent que la positivité pour Her2/neu peut prédire la réponse Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 1525

et l effet bénéfique d un traitement de paclitaxel sur un cancer primaire ou métastatique.2 Plus important peut-être, les cancers Her2/neu positifs peuvent être traités avec une très grande efficacité grâce à une thérapie ciblée, le trastuzumab (Herceptin).3 Le tras tuzumab est un anticorps monoclonal dirigé contre le do maine extracellulaire des récepteurs Her2/neu ; il a été hu manisé, ce qui diminue l immunité associée aux anticorps monoclonaux murins.4 Après des premiers tests promet teurs, le trastuzumab fut approuvé par la Food and Drug Association des Etats-Unis (FDA) comme médicament de deuxième ligne destiné aux patientes métastatiques.5 Les résultats excellents de trois essais cliniques de phase III indépendants 6-8 ont favorisé une approbation par la FDA, de sorte que ce médicament peut être utilisé maintenant aussi en première ligne pour traiter les cancers du sein sur exprimant Her2/neu. Par rapport à une chimiothérapie seule, la combinaison du trastuzumab et d une chimiothérapie diminue considérablement les récidives, rallonge l inter valle avant progression et réduit significativement la mor talité due au cancer du sein, que ce soit en situation adju vante ou néoadjuvante. pourquoi devons-nous prédire la réponse au traitement? L identification des patientes éligibles pour un traite ment au trastuzumab se base sur le status Her2/neu du cancer primaire du sein.9 Sélectionner rigoureusement les patientes susceptibles de recevoir le trastuzumab s im po se du fait des effets secondaires potentiellement sévères de ce médicament. Aux effets indésirables relativement peu spécifiques (asthénie, maux de tête et nausées notamment) s ajoute la cardiotoxicité bien connue du tras tuzu mab ; cel le-ci se manifeste par une insuffisance cardiaque chez un nombre significatif de patientes.10 Si environ 5 à 15% des patientes voient leur fonction cardiaque altérée, 1% à 4% d entre elles vont souffrir d une insuffisance cardiaque si gnificative. L analyse récente de l étude HERA (HERceptin in Adjuvant breast cancer) montre que le trastuzumab, prescrit de manière adjuvante à 55 femmes, fait vivre une patiente supplémentaire à deux ans alors qu une patiente sur 51 développe une insuffisance cardiaque con ges ti ve.11 Nous ne pouvons pas ignorer non plus que la plupart des systèmes de santé publique se trouvent con frontés à des problèmes de trésorerie et que le financement d un médi cament peut signifier l arrêt du remboursement d autres traitements (parfois moins chers et pourtant efficaces). Cette situation rend très difficile la justification des coûts du trastuzumab, qu on estime à environ 40-60 milles francs suisses pour une année de traitement. Cependant, tandis que la valeur prédictive négative de l expression de Her2/neu (signifiant l absence de bénéfice d un traitement de trastuzumab) est suffisamment grande, la valeur prédictive positive demeure insuffisante. Ainsi malgré une surexpression de Her2/neu, toutes les patien tes ne vont pas bénéficier d un traitement de trastuzu mab, vraisemblablement à cause d altérations cellulaires que modifie la voie de signalisation de Her2/neu ou ren dent l interaction avec le trastuzumab inefficace. 1526 Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 comment prédire la réponse au traitement? Les guides de pratique en vigueur suggèrent que Her2/ neu devrait être détecté soit par hybridation in situ en fluo rescence (FISH), pour étudier l amplification du gène Her2/ neu, soit par immunohistochimie (IHC), pour détecter la surexpression de la protéine. On combine ces deux mé thodes dans les cas ambigus.12 Ces tests devraient se faire dans des laboratoires dont la casuistique et l expérience sont suffisantes, et dans lesquels il existe des procédures de contrôle de qualité internes et externes. hybridation in situ en fluorescence (fish) Pour l hybridation in situ en fluorescence, on utilise une sonde d ADN marquée d un colorant fluorescent, afin de savoir si l ADN ne contient pas de copies supplémentaires de Her2/neu. Cette détermination de l amplification du gène Her2/neu, quantifiant le nombre de copies du gène pour Her2/neu sur le chromosome 17, a été considérée comme le gold standard pour déterminer la réponse au trastuzu mab.13 Le résultat est positif quand plus de six copies du gène Her2/neu sont détectées par cellule ou lorsque le ra tio entre Her2/neu spécifique et les signaux spécifiques du centromère dépasse 2,2 (figure 1A). Un ratio compris entre 1,8 et 2,2 est considéré comme indéfini, alors qu un résul tat inférieur à 1,8 ou un nombre total de copies de 4 qua lifient un résultat négatif. Si le FISH requiert un équipe ment sophistiqué un microscope à fluorescence de gran de qualité et une expérience en cytogénétique ce test a l avantage d offrir une lecture plus objective, notamment du nombre de copies pour le chromosome 17, que la déter mination de l intensité par immunohistochimie (voir plus bas). Les limitations techniques du test de FISH peuvent être contournées par le recours à une hybridation chromo génique in situ (CISH), pour laquelle on emploie un sys tème de détection du signal à base d enzymes (et non un système de fluorescence). A B Figure 1A et B. Images représentatives de l amplification (A) et de la surexpression (B) de Her2/neu dans un cancer du sein, mis en évidence par hybridation in situ (A) et par immunohistochimie (B) Multiplications des signaux pour Her2/neu (A, plus de 6 petits points verts au sein des noyaux colorés en bleu par dapi) et le fort immunomarquage membranaire et circonférentiel des cellules tumorales cohésives (B). A noter l absence d immunomarquage cytoplasmique non spécifique des cellules tumorales et l absence d immunomarquage du tissu stromal péritumoral. Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 0

immunohistochimie (ihc) Se basant sur l expérience ample de l immunohistochimie pour la détermination de Her2/neu comme marqueur pronostique et prédictif de la réponse au trastuzumab, l immunoréactivité membranaire suffit pour une interprétation positive du signal IHC (figure 1B). Nous avons confirmé ce fait dans une étude comparative conduite dans notre laboratoire en montrant que la corrélation linéaire entre les deux tests (IHC versus FISH) était significativement améliorée après correction pour l immunoréactivité cytoplasmique, non membranaire. 14 L immunoréactivité Her2/neu est scorée sur une échelle arbitraire, le score le plus élevé (+++ ; immunomarquage fort, circonférentiel, dans un minimum de 30% des cellules tumorales) étant considéré comme positif, alors que n importe quel autre résultat est considéré comme négatif (score 0 ou +) ou ambigu (++). La distinction entre le score le plus élevé (+++) et le score ambigu (++) est cliniquement significative, puisque les cas (+++) s associent à des taux de réponses au trastuzumab de 35% contre seulement 2% pour les cas (++). 5 Des résultats similaires ont été rapportés par Burstein et coll., qui ont observé des rémissions cliniques dans 34% des cas (+++) et seulement 13% des cas (++). 15 Seul un quart environ des cas ambigus (++) montrait une amplification du gène par FISH, bénéfique lors d un traitement de trastuzumab. Des données préliminaires provenant du seul essai randomisé prescrivant le trastuzumab aux patientes, dont le status Her2/neu non amplifié était (0) et (+), suggèrent que le trastuzumab n offre pas plus d avantages que le paclitaxel administré en monothérapie aux femmes dont le cancer du sein est Her2/neu négatif. Le système de 0 à +++ pour l interprétation du résultat de l immunomarquage Her2/neu a été standardisé et validé, et les contrôles de qualité ont été effectués par différentes agences (par exemple : UKNEQAS). La corrélation entre le nombre de copies du gène (déterminé par FISH) et les résultats immunohistochimiques a, elle aussi, été validée et jugée excellente. Les premières études suggèrent que 30% des cancers du sein surexpriment Her2/neu. Cependant, la positivité Her2/neu fut surestimée puisque ces résultats provenaient essentiellement de séries de cancers du sein débutants de mauvais pronostic et de cancers métastatiques. Depuis lors des analyses enrôlant de nombreuses patientes (n = 2913 et n = 6556) 16,17 ont montré que Her2/neu n est amplifié que dans respectivement 18% et 22,7% des cas et ce, grâce au test de FISH et au choix d un cut-off pour le ratio Her2/neu/ centromère 17 supérieur à 2. Afin d ajuster la réduction du pourcentage de positivité de Her2/neu, le seuil de l analyse immunohistochimique de la surexpression de Her2/ neu a été relevé ; du 10% initial de cellules tumorales nécessaires pour montrer une immunoréactivité circonférentielle qualifiant un résultat (+++), on est passé maintenant à 30% de cellules tumorales. 12 dans quelle mesure les tests her2/neu sont-ils fiables? Des études prospectives provenant d essais randomisés sur le trastuzumab ont démontré que 20% environ des analyses Her2/neu effectuées en périphérie étaient considérées comme fausses lorsqu elles étaient refaites dans un grand laboratoire central. 18,19 Malgré les tentatives au sein de la communauté internationale de pathologie pour améliorer la manière d analyser Her2/neu dans la pratique quotidienne, les erreurs représentent un problème majeur, que l on recoure au FISH ou à l immunohistochimie. 12 C est pour cette raison que le College of American Pathologists et l American Society of Clinical Oncology ont rédigé des guides de pratique pour tester Her2/neu dans le cancer du sein. 12 Ces guides de pratique définissent sans ambiguïté ce que l on considère comme un résultat Her2/neu positif (voir plus haut) et comment le tissu doit être préparé et fixé avant d être examiné ; ils précisent les mesures minimales à prendre pour les contrôles de qualité internes et externes, tout en incluant les procédures opératoires standards et la documentation nécessaire à la formation continue des pathologistes et du personnel technique. comment mieux prédire la réponse au trastuzumab? Comme il a été précisé plus haut, nous devons faire face à un dilemme, à savoir que toutes les patientes dont le cancer surexprime Her2/neu ne vont pas bénéficier d un traitement de trastuzumab. Statistiquement, un traitement de trastuzumab améliore la survie sans maladie chez environ 30-40% des patientes. Un grand nombre de patientes, dont la tumeur surexprime Her2/neu, ne tire donc aucun bénéfice de ce traitement, tout en subissant les mêmes risques d effets secondaires et les énormes conséquences financières. A propos de l amélioration de la prédiction de la réponse aux traitements ciblant Her2/neu, nous devons reconnaître que tous les mécanismes d action du trastuzumab ne sont pas connus. Nous savons qu il inhibe les voies de signalisation qui dépendent de Pi3K-Akt, 20 qu il induit un arrêt du cycle cellulaire en G1, de même qu il inhibe le clivage de l ectodomaine de Her2/neu. 21 D autres agents ciblant Her2/neu ont été développés, qui ont un mécanisme d action distinct du trastuzumab ; ils sont aujourd hui testés dans des essais cliniques. Le géfitinib (Iressa) est un inhibiteur de la tyrosine kinase qui cible Her2/neu, et le lapatinib (Tyverb), administré par voie orale, est un inhibiteur qui cible Her/neu et EGFR. Ajouté à une chimiothérapie standard, le lapatinib améliore le devenir clinique des patientes présentant une maladie avancée. 22 Enfin, on a constaté que si le trastuzumab échoue dans son action, beaucoup de cancers du sein surexprimant Her2/neu dépendent encore de cette signalisation, les rendant sensibles à d autres inhibiteurs ciblant Her/neu et ses partenaires de dimérisation. 23 Au cours de ces dernières années, plusieurs marqueurs biologiques ont été étudiés pour leur potentiel à mieux prédire la réponse au trastuzumab. L activation du récepteur Her2/neu est initiée par deux mécanismes distincts, qui ont été étudiés comme des marqueurs biologiques potentiels : Her2/neu peut entrer en contact avec lui-même ou avec d autres membres de la famille Her tels que EGFR ou Erb3, afin de former des homo- et/ou des hétérodimères (figure 2). Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 1527

Homodimère Her2/neu Her2/neu Formation d un hétérodimère entre Her2/neu et EGFR/ErbB3 suite à l interaction avec un ligand Clivage de la partie extracellulaire de Her2/neu Prolifération, résistance médicamenteuse, migration, angiogenèse, antiapoptose Figure 2. Mécanismes de l activation de Her2/neu et des signaux de transduction ci-dépendantes (Adaptée de réf. 24 ). Formation d homodimères (milieu) ou d hétérodimères avec EGFR, ErbB3, ou d autres membres de la famille Her (gauche), ou clivage de son domaine extracellulaire par des métalloprotéinases ADAM10 (droit). Avec autorisation du journal. Alternativement, l initiation de la transduction du signal via Her2/neu peut être introduite via le clivage de son domaine extracellulaire par les métalloprotéinases ADAM, débouchant sur la production d un fragment lié à une membrane tronquée constitutivement activé de 95 kda tandis que le domaine extracellulaire répandu peut être détecté dans le sérum jusque chez 45% des patientes présentant un cancer du sein métastatique. 25 Plusieurs études ont montré que la réduction graduelle des taux sériques de ce domaine extracellulaire de Her2/neu peut servir de marqueur valable de l efficacité du traitement par trastuzumab. 26 Rechercher des marqueurs permettant d identifier les patientes qui bénéficieraient d un traitement de trastuzumab a focalisé l attention sur l activation de Her2/neu. En plus de la détection de la fraction extracellulaire circulante de Her2/neu, 25 la phosphorylation des résidus de tyrosine a été étudiée : plus de vingt sites de phosphorylation ont été identifiés sur les membres de la famille du récepteur tyrosine kinase, incluant le résidu tyroside Her2 y1248 et le site EGFR y1173, qui paraît avoir une importance biologique particulière. 27 La survie sans maladie et la survie globale des patientes souffrant d un cancer du sein sont significativement moins bonnes lorsqu on détecte y1248 Her2/neu phosphorylé dans les tumeurs. 28,29 Partant du principe que les tumeurs contenant le signal Her2/neu pourraient être particulièrement sensibles au traitement de trastuzumab, Hudelist et coll. testèrent le status de phosphorylation y1248 de 62 tumeurs positives pour Her2/neu et trouvèrent que quinze patientes, dont les tumeurs montraient un Her2/neu phosphorylé en position y1248, avaient significativement mieux répondu au trastuzumab et survécu significativement plus longtemps sans maladie. 30 Les mêmes auteurs ont rapporté plus tard que l efficacité du trastuzumab était significativement liée à la présence de l EGFR activé (phosphorylé). 30 1528 Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 D autres activités de recherche ont été entreprises en direction des partenaires de dimérisation de Her2/neu (EGFR par exemple), ainsi qu envers les composants des voies de signalisation induites par Her2/neu et cruciales pour l effet inhibiteur de trastuzumab sur la croissance (PTEN et Pi3K par exemple). Ainsi, les mutations du gène codant Pi3K et la faible expression de PTEN aboutirent à une activation de la voie Pi3K ; elles furent associées à un mauvais pronostic après un traitement de trastuzumab. 31 Nagata et coll. montrèrent que le trastuzumab augmentait le PTEN membranaire et l activité phosphatase, alors que la réduction du PTEN dans les cellules cancéreuses du sein conférait une résistance au trastuzumab. Par voie de conséquence, ces auteurs étudièrent la relation entre PTEN et l efficacité du traitement au trastuzumab et trouvèrent que les cancers déficients en PTEN répondaient significativement moins bien au traitement. 32 Plus récemment, la coamplification topo-isomérase II alpha et c-myc a été proposée comme prédicteurs potentiellement utiles de la réponse à une chimiothérapie basée sur le trastuzumab. 33 La coamplification topo-isomérase, trouvée dans environ un tiers des cancers du sein positifs pour Her2/neu, est associée à une survie sans récidive significativement meilleure chez les patientes traitées par FEC (fluoro-uracile, epirubicine, cyclophosphamide) à doses progressives. Tandis que le bénéfice de ces marqueurs prédictifs a bien été exploré chez les patientes métastatiques, leur utilité en situation adjuvante est encore largement inconnue. tester her2/neu dans les tumeurs primaires et/ou métastatiques La surexpression/amplification de Her2/neu est généralement considérée comme un phénomène statique, demeurant stable au cours du temps. Pourtant plusieurs groupes Revue Médicale Suisse www.revmed.ch 15 juillet 2009 0

ont rapporté que Her2/neu peut être surexprimé dans les métastases de cancers primaires négatifs pour Her2/neu. Une analyse systématique par immunohistochimie de l expression Her2/neu, chez 400 patientes environ, a révélé que seuls deux tiers des cancers primaires du sein montraient une concordance entre l expression Her2/neu des tumeurs primaires et celle des métastases ; dans un quart des cas, les métastases des tumeurs Her2/neu positives étaient négatives elles-mêmes, alors que 10% environ des tumeurs Her2/neu négatives se révélaient positives dans les métastases seulement. 34 Ces auteurs conclurent que Her2/neu devrait être analysé systématiquement, non seulement dans les tumeurs primaires, mais aussi dans les métastases, afin de ne pas manquer une chance de proposer une thérapie ciblée anti-her2/neu à ces patientes. Pourtant ces mêmes auteurs observèrent un bénéfice significatif en termes de survie chez les patientes présentant des métastases positives pour Her2/neu de cancers primaires par ailleurs négatifs pour Her2/neu ; ils relevèrent que l améliora tion de la survie était entièrement due au traitement par trastuzumab. 34 Aucun bénéfice sur la survie n a été enregistré quand les patientes traitées par trastuzumab étaient exclues de l analyse. Implications pratiques Le diagnostic de Her2/neu doit suivre des règles bien établies et doit être effectué dans un laboratoire qui respecte les contrôles de qualité internes et externes Le diagnostic d une surexpression/amplification de Her2/neu dans un cancer du sein donne une information pronostique négative mais en même temps sert à un but prédictif (effet thérapeutique de trastuzumab) Plusieurs axes de recherche tentent à améliorer encore la valeur prédictive de Her2/neu en tant que cible de traitement antitumoral spécifique, utilisant trastuzumab ou d autres molécules similaires Bibliographie 1 Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 1989;244:707-12. 2 Konecny GE, Thomssen C, Lück HJ, et al. Her-2/neu gene amplification and response to paclitaxel in patients with metastatic breast cancer. J Natl Cancer Inst 2004; 96:1141-51. 3 ** Hudis CA. 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