ANALYSE DU CD 203c EN CYTOMETRIE EN FLUX POUR DETECTER L ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L ALLERGIE AUX MEDICAMENTS INTERET ET LIMITES J. BIENVENU, A.L. DEBARD, A. ROZIERES, M.C. GUTOWSKI, D. GAUJAC, G. MONNERET J.F. NICOLAS, N. SAAD, Y. BENOIT, G. COZON Laboratoire d Immunologie et UF d immunoallergologie Centre Hospitalier Lyon-Sud Consultation d Allergo-Anesthésie Hôpital Edouard-Herriot
POURQUOI ETUDIER LE BASOPHILE? Activation des mastocytes et des basophiles à l origine des réactions d hypersensibilité immédiate Les basophiles sont présents dans le sang circulant contrairement aux mastocytes dont ils présentent la majorité des propriétés en particulier pour détecter une sensibilisation Ces cellules sont caractérisées par la présence de récepteurs de forte affinité pour les IgE (Fc εri). Après «pontage» de ces récepteurs par l allergène, les médiateurs libérés déclenchent les phénomènes allergiques La cytométrie en flux représente une technique de choix pour étudier une population faiblement représentée comme les basophiles
PRINCIPE DU TEST D ACTIVATION DU BASOPHILE Reproduire in vitro, après incubation en présence d allergène de basophiles sensibilisés, les conditions ayant conduit aux phénomènes allergiques cliniques observés chez le patient exposé à cet allergène L allergène doit posséder au moins deux épitopes distincts pour créer un pontage entre deux molécules d IgE fixées sur les Fc εri. N.B. Les médicaments sont assimilés à des haptènes monovalents.
MARQUEURS DE L ACTIVATION DES BASOPHILES Libération d histamine Libération de cytokines : IL-4, IL-13 ExpressionduCD63 Sur expression du CD203c
LE CD 63 CD63 (gp53) membre de la superfamille des protéines transmembranaires de type 4 Antigène exprimé sur des plaquettes, les basophiles, les mastocytes, les monocytes et les monocytes/macrophages Les basophiles au repos n expriment que très peu l antigène CD63 car il est lié aux granules intracytoplasmiques L activation des basophiles entraîne la fusion des granules avec la membrane plasmique et donc l expression du CD63 à la surface des cellules
LE CD 203c CD 203C : ectonucléotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP3) qui agit sur les déoxynucléotides, le NAD Initialement détecté dans l utérus, la prostate et certains carcinomes du côlon, le CD 203c a été mis en évidence à la surface des basophiles et des mastocytes de manière sélective et constitutive (AC monoclonal 97 A6) Fonction inconnue dans la physiopathologie du basophile et de l allergie L activation des basophiles, en particulier par un allergène, induit une surexpression rapide (5 min) du CD 203c L IL-3 augmente l expression de CD 203c, mais processus lent (90 min)
COMPARAISON DES PROPRIETES DU CD 203c ET DU CD 63 Le CD 63 n est pas exprimé de manière constitutive sur le basophile contrairement au CD 203c Après stimulation par un allergène, l expression du CD 63 est plus lente (15 min) que celle du CD 203c (5 min) : processus de signalisation et de stockage différents pour ces deux molécules
Higher range of variation of CD203c in comparison with CD63 % activated basophils MFI (% increase / control) 60 50 40 30 20 10 500 400 300 200 100 CD203c CD63 CD203c CD63 1/5000 1/1000 1/500 1/100 Neg Latex dilutions
Basophil activation test by flow cytometry (principle of triple staining in whole blood) Anti IgE Anti IgE Anti CD45 Anti CD45 Anti CD63 Monneret et al., Clin Exp Immunology 1999
SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU CD63 Allergie Se CD63 Sp IgE spécifiques Se Sp Alimentaires 80-82% 63-100% 69-79% 78% Latex 90-93% 100% 70-88% 100% Pollendecyprès 91% 100% 76% 100% Myorelaxants 54% 100% 62% 100% β-lactamines 42-50% 93% 25-39% 86% d après N. Abuaf
IDENTIFICATION DES BASOPHILES PAR LE CRTH2 CRTH2 (chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells, Hirai H. et al. J. Exp Med 2001) est le second récepteur de la prostaglandine D2 Exprimé sur les Th2, les éosinophiles et les basophiles CRTH2 améliore l identification des basophiles par rapport au marquage anti IgE très variable d un sujet à l autre
Whole blood ungated cells Eosinophils Gated cells from A TH2 lymphocytes SSC CD3 basophils CRTH2 CD203c
PROTOCOLE D ETUDE DE L ACTIVATION DES BASOPHILES EN CYTOMETRIE EN FLUX (CD 203c) Témoin négatif Témoin positif tests PBS 20 μl Anti-IgE ou fmlp 20 μl Allergène dilué 20 μl CRTH2 FITC 10 μl 10 μl 10 μl CD203cPE 10 μl 10 μl 10 μl CD3 PC5 10 μl 10 μl 10 μl Solution d activation 100 μl 100 μl 100 μl Sang EDTA 100 μl 100 μl 100 μl Vortexer et incuber 15 min à 37 C. Ajouter 2mL de solution de lyse Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver au PBS Reprendre avec du PBS / 0;1% paraformaldéhyde Vortexer 5s et analyser au cytomètre
POPULATION ETUDIEE 47 patients (16 hommes, 31 femmes) se présentant à la consultation d Allergologie du CHLS entre mars 2005 et juin 2006 pour réactions secondaires à la prise d antibiotiques Prise en charge : interrogatoire, examen clinique, tests cutanés, analyse du CD203c Molécules en cause 38 Amoxicilline (Clamoxyl) 13 Ceftriaxone (Rocéphine) 4 Ofloxacine (Oflocet) 2 Pristinamycine (Pyostacine) 2 Penicilline G
RESULTATS (47 patients) Diagnostic clinique - 27 réactions d intolérance - 1 réaction d HS type III - 5 réactions d HSR type IV - 14 réactions d hypersensibilité immédiate * 11 HSI Amoxicilline * 1 HSI Bacampicilline (Penglobe) * 1 HSI Pristinamycine (Pyostacine) * 1 HSI Cefatrizine (Cefaperos) Test CD 203c négatif (n = 27) négatif (n = 1) négatif (n = 5) positif (n = 6) douteux (n = 1) négatif (n = 4) négatif (n = 1) positif (n = 1) négatif (n = 1) Caractéristiques du test CD 203c Spécificité = 100% sensibilité = 50 %
HYPERSENSIBILITE A L AMOXICILLINE CD 203c et RAST CD 203c négatif douteux négatif négatif positif positif positif négatif positif positif RAST Amoxicilline (C6) (k U/L) 1,03 <0,35 <0,35 0,42 <0,35 0,45 <0,35 0,65 <0,35 <0,35 Sensibilité = 50 % Sensibilité = 40 % CD 203 + Rast Sensibilité = 80 %
AGE ( mois ) 0,5 MFI CD203c 34,5 40 1 2 2 2 3 3 4 4 4 6 7 28,7 23,7 27,4 26,4 21,5 23,8 16,9 20,7 18,9 15,8 10,5 MFI CD203c 35 30 25 20 15 10 5 0 adulte R 2 =0,7426 7 8 9 15,6 11,4 14,4 0 5 10 15 AGE (mois) 14 12,7 15 7,2 Adulte 5
EN CONCLUSION Mettre au point un test d activation des basophiles pour les médicaments, haptènes monovalents le plus souvent, est un sujet très difficile. La sensibilité des différents tests reste faible, mais la spécificité est excellente.
PERSPECTIVES Nécessité d une standardisation : Consensus sur le plan du diagnostic clinique Amélioration de la présentation de l haptène médicamenteux au système immunitaire Choix de l anticoagulant Sang total ou couche leucocytaire «buffy coat» Utilisation d IL-3 Mode d identification des basophiles (IgE, CRTH2 ) Choix du marqueur d activation CD 203c/CD 63 ou nouveaux marqueurs (CD 13, CD 164, CD 107 ) Mode d expression des résultats (MFI, pourcentage de basophiles dépassant un seuil) Il est urgent de mettre en place des études multicentriques