ème échec de COS: a qui la faute?

ème échec de COS: a qui la faute? Samir Hamamah Professor of Reproductive Medicine Chair: ART/PGD Department Head: INSERM U 1040 Early embryo developement and embryo stem cells ART/PGD Department Arnaud de Villeneuve hospital University-hospital of Montpellier INSERM U 1040 Montpellier-34295, France

Nombreux cycles de FIV annulés pour une réponse ovarienne inadaptée La plupart du temps, mauvaise réponse ovarienne (10%) et la proportion augmente avec l âge de la femme, dans 2% des cas, hyper réponse Annulations = Surcroît du coût des tentatives supporté par les couples ou l assurance maladie en fonction des pays mais aussi un abandon de tout traitement Le choix du meilleur protocole et des doses adaptés à chacune des patientes doivent pouvoir minimiser ces risques L AMH comme le CFA semblent être les 2 marqueurs les plus performants pour choisir un traitement sur mesure pour une patiente donnée.

AMH et MATURATION FOLLICULAIRE

Expérimentation animale (Durlinger et al., Endocrinology, 1999) Souris knock out pour le gène de l AMH Stock de follicules primordiaux normal à la naissance En quelques semaines stock nettement altéré: 2 à 3 fois plus de follicules en croissance à chaque cycle/ souris témoins En l absence d AMH, les follicules primordiaux sont plus rapidement recrutés Rôle autocrine dans la maturation folliculaire Empêche la transition des follicules primordiaux vers les follicules primaires

Expérimentation animale AMH inhibe la croissance des follicules primordiaux (Durlinger et al., Endocrinology, 2001, - Durlinger et al., Endocrinology, 2002 - Reproduction, 2006) Entre 16 et 17 mois 56% des souris KO ont un arrêt des cycles ovulatoires vs 18% pour le phénotype sauvage Addition d AMH dans des cultures d ovaires de souris nouveaux-nés: Diminution du recrutement des follicules primordiaux de 40 à 50% après 2 à 3j ZP3 (marqueur ovocytaire) et GDF9 (facteur sécrété par l ovocyte) non modifiés mrna AMHRII présents (essentiel pour l expression de l AMH) Effet paracrine probable (pré granulosa cells) et non systémique (hors feed-back)

AMH ET PERSONNALISATION DES TRAITEMENTS Quelle réponse ovarienne peut-on espérer?

Dosage de l AMH (La Marca et al., JOR 2012 Broer et al., HRU 2013) Etudes publiées ces dernières années utilisait soit le kit de Immunotech Beckman Coulter (IBC) soit Diagnostic System Lab (DSL). Les anticorps utilisés différents, Mesures par IBC supérieures à celles dosées par le kit DSL Beckman Coulter est détenteur de tous les brevets: kit AMH Generation II assay (spécificité du kit DSL et calibré selon les standards du kit IBC) Les valeurs obtenues avec le kit DSL peuvent être converties vers le kit IBC en multipliant la valeur par 1.39 Kit «nouvelle génération» tend à rendre des valeurs similaires au «vieux» kit IBC

AMH MARQUEUR DE LA RESERVE OVARIENNE

Etudes chez la femme Réserve ovarienne AMH est un bon marqueur du pool folliculaire (Scheffer et al., 1999 Nelson etal, 2013) AMH corrélée au nombre de follicules antraux (Van Rooij, 2002 Li et al, 2013) AMH et CFA débutent leur décroissance 3 ans avant l augmentation de la FSH et inhibine B chez les femmes normo ovulantes (De Vet et al., 2002 ) AMH marqueur du vieillissement ovarien (Seifer et al., 2011)

Etudes chez la femme AMH marqueur de l âge ovarien

Etudes chez la femme AMH marqueur de l âge ovarien AMH nettement diminuée chez les fumeuses (Freour et al., 2008) AMH est aussi un marqueur précoce de la réserve ovarienne chez les patientes jeunes traitées pour un cancer dans l enfance ( Bath et al., 2003) Perte du capital des follicules primordiaux Chute des taux d AMH AMH n est pas un facteur prédictif indépendant du taux de naissances vivantes AMH = Quantité Age = Qualité (Oudendjik et al., 2012 Wang et al., 2012)

AMH Et CIRCONSTANCES CLINIQUES

AMH et circonstances cliniques Chez certaines patientes, les valeurs de l AMH et leurs variations sont bien documentées, les connaitre : Adapter les traitements dès les premières tentatives Eviter ainsi les annulations de cycles et les drop-out L AMH non FSH-dépendante et non modifiée dans les circonstances ou les gonadotrophines endogènes sont diminuées comme la grossesse, les traitements contraceptifs ou par analogues de la GnRH Chez les patientes obèses, non PCOS, les taux d AMH moins élevés que chez les patientes de poids normal, avec cependant un compte de follicules antraux conservé Ce taux plus faible ne semble pas être pour autant chez ces patientes un marqueur de l altération de la réserve ovarienne mais est plutôt le reflet de l anomalie de la stéroïdogénèse La consommation d alcool et de tabac réduit aussi les taux d AMH

AMH et PCOS Taux circulants d AMH sont 2 à 3 fois plus élevés dus au nombre de follicules antraux plus important mais aussi à un plus haut niveau de sécrétion des cellules de la granulosa Plus importants quand Syndrome plus sévère Insulino résistance Hyperandrogénie PCOS en aménorrhée. La restauration des cycles ovulatoires sera plus aisée après une perte de poids chez les patientes qui ont un niveau d AMH moins élevé dans ce groupe de patientes

AMH et Endométriose Taux d AMH sont plus faibles que dans les groupes contrôles que les patientes aient été opérées ou non Tabagisme associé Phénomènes inflammatoires ou l expression des récepteurs de la FSH Expression récepteur de la FSH et expression des gènes PAPP/Cyp19A diminuée chez les patientes atteintes d endométriose «mauvaises répondeuses» alors que l expression est normale chez les patientes atteintes d endométriose «bonnes répondeuses» Inégalité de réponse ovarienne en cas d endométriose indépendamment de la chirurgie réalisée (Gonzalez-Fernandez,2011) Cependant, malgré une réserve et parfois une réponse ovarienne plus faible, les taux de grossesses sont comparables (Matalliotakis., 2007)

AMH MARQUEUR QUANTITATIF DE LA REPONSE OVARIENNE AUX GONADOTROPHINES

MAUVAISE REPONSE ATTENDUE (Critères de Bologne Ferraretti., 2011) 10 à 20% des cas et prévalence augmente avec l âge Prévue sur l anamnèse ie antécédents de la patiente, BMI et âge surtout Valeur seuil de l AMH la plus prédictive de la mauvaise réponse difficile à dégager de publications basées sur de faibles échantillons le plus souvent Les 2 plus grandes études ont inclus autour de 350 patientes. Nelson place le cut-off à 5 pmol/l (0.7 ng/l) - Azemi à 9.7 pmol/l (1.36ng/l) avec chacun une bonne sensibilité et spécificité. Ainsi, le seuil en deçà duquel une mauvaise réponse peut être attendue se situe autour de 0.7-1.36 ng/l Ce seuil est généralement accompagné d un CFA autour de 5-7

HYPER REPONSE ATTENDUE (Nelson et al., 2013) Pour Nelson: plus de 20 ovocytes recueillis et plus de 15 pour La Marca Cet état se rencontre dans 7% des FIV et à peu près 15% des tentatives réalisées chez des patientes de moins de 30 ans Le risque est au syndrome d hyperstimulation sévère qui peut mettre en danger la patiente AMH et CFA sont aussi des marqueurs suffisamment précis pour prédire le risque Concernant l AMH, le seuil mesuré avec le kit AMH Gen II assay au-delà duquel la forte réponse est attendue est estimé entre 3.5 et 3.9ng/l En ce qui concerne le CFA, ce seuil se situe autour de 15

AMH et QUALITE DE LA REPONSE OVARIENNE

AMH et qualité ovocytaire La littérature est controversée concernant la corrélation de l AMH avec la qualité ovocytaire et embryonnaire (Silberstein et al., 2006 - Smeenk et al., 2007 Nelson et al, 2007) En 2007 Fanchin montre que les taux d implantation embryonnaire et les taux de grossesse sont d autant plus élevés que les taux d AMH mesurés dans les follicules dont sont issus les ovocytes le sont Les dosages sériques d AMH qui ne sont pas corrélés avec la qualité ovocytaire, la qualité embryonnaire, le taux d implantation embryonnaire et le taux de naissances vivantes La corrélation n est qu indirecte par le biais de l intensité de la réponse ovarienne Age ++++

AMH AU QUOTIDIEN

CHOIX DU PROTOCOLE Utilisation de modèles

Personnalisation: Buts recherchés Nombre adéquat d ovocytes matures Risque minimal du traitement Meilleure compliance Diminution des drop out Meilleure information des couples pour et à chaque étape

1 Information des patients Leur situation sur le diagramme = le Pronostic

Choix stratégique Choix du protocole En cas de mauvaise réponse attendue Agoniste ou antagoniste: Equivalent (Sunkara, ESHRE London 2013) Taux de grossesses: 11 (ago) à 16% (antago) Choix dépend du pays (gonadotrophines disponibles, Centre, coût) En cas d hyper réponse attendue (Broer et al., 2013) Antagoniste Déclenchement par agnrh Vitrification

2 Choix stratégique Protocole / Dose Nelson Yates

2 Choix stratégique Plus de précisions: Dosigramme de La Marca AMH

2 Choix stratégique Plus de précisions: Dosigramme de La Marca CFA

Conclusion AMH outil de choix en A.M.P Réserve ovarienne mais AGE++++ Réponse ovarienne (Recrutement oui et qualité non) Dépistage des femmes à risque d OHSS Permet une stratégie diagnostique et thérapeutique Permet une réelle personnalisation des traitements: diminution des coûts et augmentation des naissances Faut-il la demander à toutes les patientes? Oui Modèles : Nécessité absolue de validation interne++

Objectives - To chracterize and compare gene expression profiles in CCs obtained from patients stimulated whith HP-hMG or rfsh in a GnRH antagonist cycle - To explore their relationship with in vitro embryo development using humangenome U133 plus2.0 microarray

Cell-to-cell interaction Lipid metabolism (energy source) Cellular assembly and organization Assou et al, 2013

COS protocols revealed a specific molecular signature associated to HP-hMG and rfsh in CCs issued from mature MII oocytes. It is interesting to note that gene expression of CCs under stimulated cycle was more homogenous with HP-hMG compared with rfsh. Conversely, antagonist-rfsh protocol showed to have 2 sub groups CCs gene expression profile compared.

HP-hMG treatment Assou et al, 2013

rfsh treatment Assou et al, 2013

Common to both HP-hMG/rFSH treatments Assou et al, 2013

Assou et al, 2013

These results are in line with our previously published data showing a general reduction in transcriptomic activity of CCs associated with poor oocyte competence and negative clincal outcome Assou et al, 2008

Analysis of microarray data of CCs from patients who underwent GnRH-antagonist COS, highlighs a significant difference in the gene expression profile of CCs following treatment with HP-hMG or rfsh. Components of signaling pathways (EGF, IGF, FGF and PDGF cascades) were conserved in CCs under both treatments. Some genes specific to each gonadotropin treatment or commonly expressed in both tretaments were associated with in vitro embryo development Moreover, independently of gonadotropin treatments used, the amount of amplified Mrna in each CC was associated with blastocyst grading at D5 These genes may prove valuable as biomarkers for in vitro embryo quality and can be useful for improve understanding of COS impact on oocyte-cumulus cells complex

Circulating nucleic acids could constitute new biomarkers in ART? - Apoptosis occurs in ovarian follicles: cellfree DNA released in FF (Scalici et al., HR 2014 There are micrornas in ovarian follicles: micrornas released in FF (Sang et al., 2013) Ovarian reserve and functions (of patients consulting for IVF procedure) Cell-free DNA and micrornas Blood vessel Serum - Communication between FF and plasma via the blood-follicle barrier Circulating Nucleic Acid Quantification Traver et al., Human Reproduction Update, 2014 Relationship between circulating nucleic acids and ovarian situation

cf-dna (ng/ml) cf-dna (ng/ml) Circulating cell-free DNA: new biomarker of ovarian reserve? Age AMH 2 2 1,5 1,5 1 1 0,5 0,5 0 <38 38 0 [AMH] normale [AMH] anormale At day 3 of natural cycle [AMH] normale 2 ng/ ml Cell-free DNA level in serum is higher in patients with low ovarian reserve Traver et al, unpublished data

cf-dna (ng/ml) cf-dna (ng/ml) cf-dna (ng/ml) Circulating cell-free DNA: new biomarker of ovarian functions? 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 [FSH] normale FSH [FSH] anormale 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 [LH] normale LH [LH] anormale 3 [FSH] normale 9 UI / l 2 [LH] normale 5 UI / l Estradiol 2,5 2 1,5 1 0,5 0 [E2] normal [E2] anormal [E2] 45 pg/ ml At day 3 of natural cycle Normal E2 Abnormal E2 Cell-free DNA level in serum is higher in patients with ovarian dysfunctions Traver et al, unpublished data

Let-7b (AI ) Let-7b (AI ) Circulating mir related to ovarian reserve Let-7b Age AMH 350 400 300 250 200 150 100 350 300 250 200 150 100 50 50 0 <38 38 0 [AMH] normale [AMH] anormale At day 3 of natural cycle [AMH] normale 2 ng/ ml Ovarian reserve decrease is associated with high Let-7b level in serum at day 3 of natural cycle Traver et al, unpublished data

mir-30d (AI) mir-191 (AI) mir320a (AI) Circulating mirs related to ovarian function At day 3 of natural cycle LH mir-30d mir-191 mir-320a 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 [LH] normale 16 100 14 *P<0,03 12 *P<0,02 80 *P<0,02 * [LH] anormale 10 8 6 4 2 0 [LH] normale * [LH] anormale 60 40 20 0 [LH] normale * [LH] anormale 2 [LH] normale 5 UI / l - High LH level is a marker of PCOS - Decrease of mir-320a level in follicular fluid of PCOS patients (Sang et al., 2013) mir-320a: new blood biomarker of PCOS? Traver et al, unpublished data

Nucleic acids in blood constitute promising tools: - To estimate ovarian reserve in case of discrepancy between AMH and Antral Follicle Count (AFC) Cell-free DNA and Let-7b - To estimate ovarian function Cell-free DNA mir-30d, mir-191 mir-320a (new blood PCOS biomarker?)

Cell-free Nucleic Acids as biomarkers for non-invasive tests - Apoptosis occurs in ovarian follicles: cellfree DNA released in FF (Scalici et al., HR 2014 Follicle Embryo Patent n EP13305820.6 There are micrornas in ovarian follicles: micrornas released in FF (Sang et al., 2013) Nucleic Acids Oocyte cumulus cells Endometrium Blood vessel Nucleic Acids - Communication between FF and plasma via the blood-follicle barrier Follicular fluid Serum Circulating Nucleic Acid Quantification Culture medium

The presence of high cfdna concentration in FF could be the consequence but also one of causes of poor embryo quality cfdna could be only a consequence of elevated apoptosis of GC that can t establish the dialog with oocyte and supply all the elements needed for its normal developement cfdna ans well as microrna quantification in the serum and FF samples could represent an innovative non-invasive approach for embryo selection