- Université de Nantes - - Faculté des Sciences et des Techniques - L I C E N C E d e B i o l o g i e ************** Protocoles de TP

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1 - Université de Nantes - - Faculté des Sciences et des Techniques - L I C E N C E d e B i o l o g i e L2 ************** Protocoles de TP de l'entité pédagogique Physiologie animale Méthodologie en pharmacologie et médicaments ************** Intervenants : Patrick FREMONT Laurent LESCAUDRON Emmanuelle LAVAZAIS-BLANCOU Année

2 ACTIVITE ELECTRIQUE DES CELLULES EXCITABLES - SIMULATION SUR ORDINATEUR ************* Introduction et rappels ************* Les propriétés électriques des cellules sont impliquées dans les processus physiologiques. Des stimuli divers (externes : lumière, son, ou internes : hormones, neuromédiateurs) vont agir sur les cellules cibles en provoquant le déclenchement de signaux électriques ou potentiels d action. Les potentiels d action induisent la réponse biologique qui se traduira par la sensation de vision, d audition, la contraction musculaire, la sécrétion d hormones ou de neurotransmetteurs..., selon le type de stimuli et de cellules mis en jeu. Les propriétés électriques des cellules résultent de la différence des concentrations ioniques de part et d autre de la membrane cellulaire et des caractéristiques de la perméabilité membranaire. La connaissance des propriétés électriques des cellules est donc nécessaire pour comprendre le fonctionnement et la régulation de l activité biologique d un grand nombre de tissus et d organes (impliquée dans les grandes fonctions de l organisme). Différences de concentrations de part et d autre de la membrane Les concentrations ioniques des milieux intra et extracellulaires sont représentées dans le tableau I. Ces différences de concentrations sont dues : (i) aux caractéristiques de la perméabilité membranaire ; (ii) à la présence de protéines chargées négativement et de gros anions à l intérieur de la cellule ; (iii) à l existence de systèmes d échange et de pompe au niveau de la membrane (pompe Na + /K +, pompe Ca 2+, échange Na + /Ca 2+, échange Na + /H + ). Ces mécanismes actifs permettent le passage des ions contre le gradient de concentration (du milieu le moins concentré vers le milieu le plus concentré), à l opposé de la diffusion passive, qui se fait dans le sens du gradient de concentration (du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré). 2

3 Le potentiel membranaire de repos Equation de Nernst L inégalité des charges électriques de part et d autre d une membrane perméable aux ions est responsable d une différence de potentiel entre les milieux situés de chaque côté de la membrane (figure 1). L ion X + va diffuser de 2 vers 1 jusqu à atteindre un équilibre. La différence de potentiel mesurée sera alors égale au potentiel d équilibre de l ion X +, défini par l équation de Nernst : RT [X] ext E = Ln ZF [X] int z : valeur de l ion R : constante des gaz parfaits (8,32 joules) T : température en K (273+T C) F : nb de Faraday (96500 coulombs) pour un cation monovalent à 37 C. E X+ (en mv) : 58 log [X + ] Ext / [X + ] Int Le passage des ions X + au travers de la membrane génère un courant ionique I X dont l amplitude dépend de la différence de potentiel de part et d autre de la membrane (Em ou Vm) et du potentiel d équilibre (E X ) : I X = g X (Em-E X ), où g X représente la conductance membranaire/cellulaire de l ion X. Quand Em sera égal à E X, le flux net d ions sera nul. Mesure du potentiel membranaire de repos La différence de potentiel existant de part et d autre de la membrane d une cellule au repos est appelé potentiel membranaire de repos. Il peut être déterminé par la mesure de la différence de potentiel entre une microélectrode piquée à l intérieur de la cellule et une électrode de référence placée dans le milieu extracellulaire (figure 2). Le potentiel membranaire de repos est toujours négatif : de -40 à -90 mv selon le type cellulaire. Le potentiel d action L introduction d une microélectrode dans une cellule isolée quiescente permet la mesure du potentiel de repos. La stimulation de la cellule (nerveuse, cardiaque, musculaire lisse ou squelettique) par un stimulus électrique ou chimique va provoquer des variations du potentiel de membrane. Lorsque l amplitude de la stimulation est suffisante pour que la dépolarisation membranaire atteigne une valeur seuil, une série de modification des perméabilités ioniques membranaires apparaît et permet le déclenchement d un potentiel d action. Le potentiel d action obéit à la loi du tout ou rien. 3

4 Mouvements des ions au travers des canaux Le passage des ions, dans le sens du gradient de concentration, au travers de la membrane se fait grâce à l existence, au sein de la membrane, de protéines particulières appelées canaux ioniques. La plupart de ces canaux sont spécifiques d une espèce d ion donné. Il existe ainsi des canaux sodiques, des canaux potassiques, des canaux calciques... Le fonctionnement d un grand nombre de ces canaux est régulé par le potentiel membranaire. Ils sont alors appelés canaux ioniques potentiel-dépendant. Selon la valeur du potentiel, les canaux vont se trouver à l état ouvert (O) ou à l état fermé (F) et permettre ou non le passage des ions. Il existe également pour certains canaux un état inactivé (I) au cours duquel toute nouvelle activation est impossible. La conductance unitaire (γ) d un ion traduit la facilité avec laquelle l ion traverse un canal donné ; elle évolue en fonction de la valeur du potentiel de membrane. Le passage des ions X + au travers d'un canal génère un courant unitaire i X dont l amplitude dépend de la différence de potentiel de part et d autre de la membrane (Em) et du potentiel d équilibre (E X ) : i X = γ X (Em-E X ). Technique du Patch clamp La technique du patch clamp permet d'utiliser la même électrode pour imposer un potentiel et mesurer un courant sur des petites préparations. Le principe est basé sur la propriété des pipettes de verre de coller aux membranes biologiques formant ainsi une zone de très forte résistance ("gigaseal") qui isole électriquement la portion de membrane ("patch") présente sous la pipette. Plusieurs configurations peuvent être utilisées en patch clamp (Figure 3). Lorsque la pipette est collée sur la membrane, c'est la configuration cellule-attachée ("cell-attached") qui permet des mesures de courants unitaires mais sans pouvoir ni mesurer le potentiel transmembranaire ni contrôler la composition du milieu interne. À partir de cette configuration cellule-attachée, il est possible de rompre la membrane sous la pipette par aspiration et obtenir la configuration cellule-entière ("whole-cell") qui permet de mesurer un courant global et de contrôler la composition du milieu interne. Il est possible de réaliser des "patch" excisés qui regroupent une configuration "insideout" (face interne de la membrane dans le bain) ou "outside-out" (face externe de la membrane dans le bain). Ces configurations permettent d'enregistrer des courants unitaires, c'est-à-dire traversant un seul canal. Les milieux de part et d'autre du "patch" peuvent être modulés à volonté. 4

5 SimPatch Expériences d'électrophysiologies simulées ************* Introduction SimPatch est un logiciel de simulation intéractive d'une expérience d'électrophysiologie réalisée sur un modèle de neurones de mammifères. La technique de patch clamp est utilisée pour analyser les canaux ioniques potentiel-dépendants qui sont localisés dans la membrane plasmique de ces neurones. Ces canaux ioniques jouent un rôle clé dans l'activité des cellules nerveuses en permettant leur excitabilité et en modifiant leur activité électrique en réponse à des stimuli chimiques, mécaniques ou optiques. La technique de patch-clamp a été développée par Neher et Sakmann (prix Nobel en 1991) (cf. Page 3, technique du patch clamp). Principe et but de SimPatch SimPatch permet d'appréhender la technique de patch-clamp en s'affranchissant des problèmes expérimentaux. L'utilisateur dispose d'un laboratoire virtuel qui lui permet d'analyser les courants ioniques potentiel-dépendants de différents neurones de la rétine de mammifères. Il devra déterminer quelle série de canaux ioniques potentiel-dépendants sont présents dans la membrane des différents types cellulaires de la rétine de mammifères, en mesurant et en identifiant les canaux sodiques, potassiques, calciques et chlore. Le but de SimPatch est de permettre de comprendre comment les différents canaux fonctionnent et comment ils peuvent influencer le comportement d'une cellule entière, in vivo. Caractéristiques de SimPatch 1 - SimPatch présente un équipement expérimental en 3D qui ressemble très étroitement à une installation de patch-clamp réelle. 2 - SimPatch est un logiciel qui permet de s'affranchir des problèmes rencontrés lors des expériences "réelles", comme la perte de contact entre la pipette de patch et le neurone ou la mort de la 5

6 cellule par application d'un échelon de potentiel trop important. Il permet également de changer le milieu intracellulaire sans altérer la cellule. 3 - SimPatch permet un contact électrique correct entre la pipette de patch et le neurone et il simule l'enregistrement du courant en cellule entière (whole cell) sous des conditions de potentiel imposé. 4 - Tous les courants ioniques activés par l'ouverture de canaux membranaires sous l'effet d'un échelon de potentiel, ainsi que tous les artéfacts de RC passifs (Résistance-Capacitance), sont calculés à l'aide de formules mathématiques. SimPatch permet d'ajuster ou de modifier un certain nombre de paramètres grâce à l'action sur de nombreux panneaux de contrôle. 5 - Chaque enregistrement, réalisé sur un type de neurone, présente des caractéristiques particulières : résistance de la pipette, capacité membranaire, nature des courants ioniques enregistrés, amplitude des courants etc...). Partie expérimentale SimPatch est composé de trois parties. - Overview Elle correspond à une petite introduction sous la forme d'une séquence vidéo qui décrit le principe du logiciel, les différents appareils composant le montage expérimental (oscilloscope, amplificateur, stimulateur) et les différentes options disponibles : la sélection du type de neurone à étudier (icône microscope), la sélection des solutions (icône bouteille), les stimulations à imposer (icône pulse) et la partie analyse des tracés (icône rêgle). - Introduction Cette partie illustre les différentes étapes permettant d'obtenir un enregistrement de l'activité électrique d'un neurone de la rétine, en configuration cellule entière. Elle se présente sous la forme d'une séquence vidéo et se décompose comme suit : * La mise sous tension des différents appareils : oscilloscope, stimulateur, amplificateur. * Les réglages préliminaires des artéfacts dus à la méthode (capacitance de la pipette, capacitance de la membrane, résistances en séries) et aux appareils (oscilloscope, amplificateur). Pour cela, une stimulation unique (single pulse), d'amplitude constante de -5 mv et d'une durée de 30 msec est appliquée (apply). Cette stimulation est d'intensité trop faible pour générer une activation des canaux ioniques. Les variations observées sur l'oscilloscope reflètent le courant artéfactuel à compenser, résultant de la capacitance membranaire et des résistances en séries. Il est possible 6

7 d'agrandir l'échelle d'observation sur l'oscilloscope (autoscaling). Les fonctions de réglages de la capacitante et des résistances en séries doivent être allumées puis, les valeurs de réglage choisies de façon à réduire au mieux le courant artéfactuel. * L'enregistrement de courants ioniques. Une série de stimulation (family) est appliquée à la cellule. Pour visualiser les sauts de potentiels, il faut changer la voie d'entrée du stimulateur sur l'oscilloscope : input 2 input 1. Le potentiel de maintien de la cellule (holding potential) est fixé à - 70 mv. Des sauts de potentiel de 20 mv sont imposés de -50 mv à +70 mv. Pour visualiser les courants ioniques activés suite à ces dépolarisations, il faut sélectionner la voie d'entrée de l'amplificateur sur l'oscilloscope : input 1 input 2. Le profil des courants ioniques activés est observé pour chaque stimulation. * La sélection des solutions (icône flacon). La composition des solutions extracellulaire (standard outside) et intracellulaire (standard inside) est présentée pour chaque ion ainsi que la température à laquelle se déroule l'expérience. Parallèlement, les potentiels d'équilibre des ions en présence ont été calculés. Il est possible de modifier la composition des solutions en associant des inhibiteurs de canaux ioniques : Inhibiteur de canaux calciques de type L = nifédipine Inhibiteur de canaux potassiques = TEA Inhibiteur de canaux sodiques = TTX Ion de substitution du sodium = choline L'utilisation des inhibiteurs permet de déterminer la nature des courants ioniques activés par la stimulation initiale. * La partie analytique. Les amplitudes de courants observés sont mesurées à l'aide de 2 curseurs. Il est possible de sélectionner les traces de courants 1 à 1 selon le saut de stimulation. Le logiciel intègre la variation de courant et le gain de l'amplificateur et indique une amplitude de courant en pa. A partir de l'analyse des différentes traces, il est possible d'établir une courbe I/V pour le courant considéré. * Identification de la cellule analysée. L'icône "microscope" permet de visuliser le type de neurone de la rétine analysé et de sélectionner un type à étudier. 7

8 - Practical course Cette partie correspond à un laboratoire virtuel où les expériences sont réalisées sur des cellules de la rétine de mammifères. L'amplificateur de patch-clamp est connecté par le cable rouge au préamplificateur (non visible) sur lequel est montée la pipette de patch qui sera posée sur le neurone. Par ces connections, l'amplificateur impose au neurone différentes valeurs de potentiel et en retour, permet de transporter le signal correspondant aux courants ioniques enregistrés au niveau du neurone. - Sélectionner un neurone de type ganglionnaire (il est sélectionné par défaut). - Faire les réglages de capacitante et de résistance en séries précédemment définis en simple pulse, afin d'éliminer les courants artéfactuels. Il n'est pas utile de modifier les paramètres de stimulation en single pulse. - Définir les sauts de potentiels à imposer : holding potential - 70 mv Pulse amplitude 0 mv Pulse increment à définir pour avoir suffisamment de valeurs Pulse number à définir selon l incrément Episode length 100 msec Pulse length 60 msec Pulse delay 10 msec - Sélectionner family pulse, apply. Analyser les courants, sens, les amplitudes. Première étape : Répéter le même protocole expérimental en présence de différents inhibiteurs afin de définir la nature des courants qui compose votre signal. Deuxième étape : Les courants en présence ayant été identifiés, choisissez les combinaisons d inhibiteurs à appliquer afin d isoler chaque courant, l un après l autre. Dans chacun des cas, précisez la nature de ce courant, analysez le sens, les amplitudes du courant en fonction du potentiel imposé. Tracer les courbes I/V pour chacun de ces courants. Analyser les courbes I/V. Conclure 8

9 ACTIVITE ELECTRIQUE DES CELLULES EXCITABLES - SIMULATION SUR ORDINATEUR ************* Etude du potentiel membranaire ************* Vous devez commencer par lire l introduction et les rappels mentionnés précédemment But de la Manipulation L'objectif de cette deuxième partie de logiciel est de pouvoir aborder, par des simulations d'expériences, les phénomènes électriques et ioniques à l'origine du potentiel de repos et du potentiel d'action d'un neurone. Le modèle cellulaire étudié est la cellule nerveuse. Principe Le programme que vous utiliserez mime l enregistrement de l activité électrique d une cellule isolée par une microélectrode intracellulaire. Il vous permet de choisir et de modifier les paramètres de stimulation, de faire varier les concentrations ioniques de la solution physiologique dans laquelle se trouve la cellule et d étudier l effet de substances pharmacologiques. Le programme sera chargé par l enseignant. Vous trouverez l ordinateur prêt pour l utilisation du programme de simulation pour l enregistrement des potentiels d action et des conductances membranaires. Le menu du programme sera affiché à l écran. Vous avez le choix entre 9 options. Vous n aurez à utiliser, dans cette partie, que les options 4, 5, 7, 8 pour les parties expérimentales ou l'option 9 pour quitter le programme. Tapez le chiffre correspondant à l option choisie sur le clavier numérique puis la touche enter. I - Définition des paramètres de stimulation pour déclencher un potentiel d action : option 4 Charger l option 4 (4 puis enter). 9

10 Vous devez maintenant répondre aux questions posées pour définir les paramètres de stimulation : ENTER : initial membrane potential ( return = -60) (mv = )? Vous devez définir la valeur initiale du potentiel de membrane. Durant tout le TP, cette valeur sera fixée à -60 mv (il vous suffit donc de taper enter ). FIRST STIMULUS enter. Intensity ( return" = 100) (ma = )? le clavier numérique (en milliampère) puis enter. Duration ( return" = 0.1) (msec = )? Starting time ( return = 0) (start)? Tapez 1 puis enter. SECOND STIMULUS Choisissez l intensité de la stimulation par Choisissez la durée de la stimulation puis Entrer 0 pour tous les paramètres. Enter y to display gates ; anything else for conductances? ne pas taper "y" Tapez directement enter. L affichage à l écran change. Vous pouvez alors visualiser les potentiels d action et les conductances Na + et K +. Les paramètres de stimulation que vous avez choisi sont inscrits à droite de l écran, suivis de la question : Are these correct?. Répondre par y ou n suivi de enter. La stimulation, la conductance et l enregistrement du potentiel de membrane apparaissent à l écran. Pour recommencer, répondre : y à Another run (y/n)?" y à Surimpose (y/n)? Cette fonction ne marche pas si vous souhaitez ne pas superposer vos tracés, revenez au menu initial et redemander l'option 4. Vous pouvez alors changer les paramètres de stimulation (à droite de l écran). Recommencez la procédure autant de fois que nécessaire. Enregistrements 1- Déterminer les paramètres de la stimulation permettant de déclencher un potentiel d action idéal : temps de stimulation bref, pente de dépolarisation du PA importante. 2- Estimer quel est le potentiel seuil à partir duquel se déclenche le potentiel d action. Pour cela, conserver la valeur de temps de stimulation précédemment choisie et diminuer l'intensité de la stimulation (ma). Que se passe-t-il si l intensité de la stimulation n est pas suffisante? (vous devez utiliser l option 5, similaire à l option 4, mais qui permet d observer le potentiel de membrane avec une plus grande amplification). Important : Pour la suite du TP, vous devez conserver les paramètres de stimulation optimums que vous avez choisi pour tous le reste du TP. 10

11 II - Modification des concentrations ioniques : option 8 Vous pouvez modifier les concentrations externes en Na + et K + en faisant varier le rapport : [X + ]/[X + ] normale. Utilisez toujours les mêmes paramètres de stimulation. Dans un premier temps, utilisez l échelle de temps de 10 msec. Modifications de la concentration en K+ Observez l effet de l augmentation de la concentration K + extracellulaire en faisant varier la valeur du rapport [K + ]/[K + ] normale. Utilisez les valeurs suivantes : 1, 1.5, 3, 6, 12, 17, 25 (fixez toujours le rapport [Na + ]/[Na + ] normale = 1). 1- Décrivez l effet de l augmentation de la concentration en K+ extracellulaire sur le potentiel membranaire de repos, sur le potentiel d action et sur les conductances. Qu observez-vous en utilisant l échelle de temps de 50 msec, avec un rapport des concentrations potassiques de 1.5 et de 12 (ou 17) en présence ou en absence de stimulation? Interprétez les phénomènes observés. 2- Quelles seraient les conséquences : a) d une diminution de la concentration K + extracellulaire? b) d une diminution de la perméabilité potassique de la membrane sur l activité électrique Modifications de la concentration en Na+ Observez l effet de la diminution de la concentration en Na + extracellulaire. Faites varier le rapport [Na + ]/[Na + ] normale en utilisant les valeurs suivantes : 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01 ([K + ]/[K + ] normale = 1). 1- Décrivez et interprétez les modifications observées. 2- Quel est le rôle des ions Na + dans le maintien du potentiel de repos et dans la genèse du potentiel d action? 3- Quelle serait la conséquence d une diminution de la perméabilité membranaire du Na +? IV - Pharmacologie : option 7 Utilisez toujours les mêmes paramètres de stimulation. Dans un premier temps, utilisez l échelle de 10 msec. 11

12 Effet du TEA (tétraéthylammonium) Observez l effet de l addition, dans le milieu extracellulaire, de concentrations croissantes de TEA : 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 mm (concentration en STX : 0). 1- Quelles sont les actions du TEA sur le potentiel d action et sur le potentiel membranaire de repos? 2- Sur quelle conductance agit le TEA et quel est son effet? 3- Tracez la courbe concentration-réponse de l inhibition de la conductance déterminée cidessus pour le TEA. Cette courbe s obtient en représentant le rapport [(conductance g en présence de TEA x 100)/conductance g contrôle] en fonction du logarithme décimal de la concentration (M) de TEA. Comme vous établissez un rapport, vous pouvez donc raisonner en unité arbitraire. Déterminer la concentration nécessaire pour inhiber de 50 % (IC50) la conductance. 4- Qu observez-vous en utilisant l échelle de temps de 50 msec, en présence de 3 mm de TEA? 5- Interprétez les phénomènes observés en vous reportant aux résultats obtenus lors des expériences de modifications des concentrations ioniques externes. Effets de la STX (saxitoxine) Observez l effet de l addition, dans le milieu extracellulaire de concentrations croissantes de STX : 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 nm (concentration en TEA = 0). 1- Décrivez l action de la STX sur le potentiel d action et sur le potentiel de repos. 2- Sur quelle conductance agit la STX? Quel est son effet? 3- Tracez la courbe concentration-réponse de l inhibition de la conductance déterminée cidessus par la STX et déterminez l IC Comparer les interprétations des effets de la STX sur le potentiel membranaire et le potentiel d'action avec les observations effectuées précédemment lors des expériences de modifications des concentrations en ions extracellulaires. Conclusion 12

13 ACTIVITE ELECTRIQUE DE SURFACE DE LA PREPARATION NERF-MUSCLE ************* INTRODUCTION Le stimulus normal d une fibre musculaire striée squelettique est nerveux. Un neurone moteur ou motoneurone innerve plusieurs fibres musculaires (unité motrice) mais chaque fibre musculaire reçoit une seule terminaison axonale issue d un neurone moteur (neurone efférent somatique), au niveau d une synapse neuro-musculaire, encore appelée plaque motrice (Fig.1). 1) La fibre nerveuse a - Potentiel de repos de la fibre nerveuse L'implantation d'une microélectrode à l'intérieur d'un axone permet de mettre en évidence une différence de potentiel de part et d'autre de la membrane cellulaire. Cette différence de potentiel (potentiel de repos) est de l'ordre de -70 mv (Fig. 2). 13

14 Au repos, la répartition des charges de part et d'autre de la membrane est inégale. L'intérieur de la fibre est moins chargé que ne l'est l'extérieur. Pour cette raison, l'extérieur de la membrane est représenté par des charges positives, alors que l'intérieur sera représenté négativement. b - Notion de seuil d'excitabilité des fibres nerveuses Lorsqu'on stimule une cellule nerveuse, on constate que cette stimulation pour être efficace (stimulation supraliminaire), doit être supérieure à une valeur critique appelée seuil d'excitation. La fibre nerveuse obéit à la loi de tout ou rien, car si la réponse est nulle pour une stimulation infraliminaire, elle est maximale et invariable pour toute stimulation égale ou supérieure au seuil. c - Potentiel d'action Le potentiel d action est exclusivement enregistré par une microélectrode intracellulaire. Lors d une stimulation, le neurone est le siège d un potentiel d action. (Fig.3). d - Activité électrique de surface d'un axone isolé Si l'on capte l'activité électrique d'un axone à l'aide de 2 électrodes de surface, on obtient un tracé biphasique (Fig. 4). En effet, dans ce cas, la zone dépolarisée qui se propage le long de la fibre gagne progressivement l'une puis l'autre électrode. La différence de potentiel qui apparaît entre les électrodes est donc biphasique. Le phénomène est décomposé dans le schéma de la figure 5. Ces variations de potentiel diffèrent du potentiel d'action enregistré par dérivation transmembranaire. 2) Le nerf Si on considère un nerf entier, c'est-à-dire un ensemble de fibres nerveuses, l'expérience montre qu'il ne répond pas à la loi du tout ou rien, mais à la loi du recrutement car toutes les fibres qui le composent n'ont pas rigoureusement le même seuil d excitation. 14

15 Activité électrique globale Lorsque le nerf est stimulé (électriquement) de façon efficace, la réponse enregistrée en surface par 2 électrodes représente la résultante des activités de surface de chaque fibre : on parle d'activité électrique globale. Ainsi les phénomènes observés au niveau du nerf doivent être considérés comme l'intégration d'un grand nombre de phénomènes unitaires qui se déroulent au niveau de chaque fibre. 3) La synapse neuro-musculaire La transmission de la dépolarisation entre la fibre nerveuse et la fibre musculaire se fait au niveau de la synapse, par un mécanisme chimique faisant intervenir un neurotransmetteur : l'acétylcholine La jonction neuro-musculaire est un ensemble structurel et fonctionnel constitué par : - une terminaison axonale contenant des vésicules d acétylcholine (élément présynaptique) ; - une fente synaptique ou espace inter-synaptique, où sont localisées des molécules d acétylcholinestérases, enzyme hydrolysant l acétylcholine ; - l appareil sous-neural ou plaque motrice constitué par les replis de la membrane post-synaptique c est à dire la membrane de la fibre musculaire où sont concentrés les récepteurs à l acétylcholine et où sont également localisées des acétylcholinestérases (élément postsynaptique). Au repos, l ACh est sécrétée spontanément en petites quantités. Cette libération entraîne de brèves et faibles dépolarisations de la membrane musculaire (élément postsynaptique) appelées potentiels miniatures. Ceux-ci ne sont pas propagés et ne concernent que la zone synaptique. L arrivée d un PA propagé au niveau de la terminaison nerveuse provoque la libération d une grande quantité d ACh dans la fente synaptique. Le neurotransmetteur se fixe sur les récepteurs cholinergiques de type nicotiniques. Ces récepteurs-canaux laissent passer les ions Na + et K +, mais un plus grand nombre d ions Na + pénètrent dans la fibre musculaire que d ions K + en sortent produisant une dépolarisation locale de la plaque motrice : le potentiel de plaque motrice (PPM). 15

16 L amplitude d un PPM provoqué par un seul potentiel d action nerveux suffit à atteindre le seuil d activation des canaux sodiques potentiel-dépendants et à déclencher un PA musculaire. Il n y a donc pas de sommation spatiale et temporelle des PPM pour atteindre le seuil de déclenchement du PA au niveau de la fibre musculaire contrairement aux autres synapses. Ce PPM entraîne la formation d un potentiel d action propagé de façon régénératrice sur toute la surface de la fibre musculaire. Comme antagoniste compétitif des récepteurs cholinergiques nicotiniques, il y a le curare ou la D-tubocurarine. 4) La fibre musculaire et le muscle Le muscle est composé d'un grand nombre de fibres musculaires qui, comme les fibres nerveuses, possèdent des seuils d'excitation différents. Chaque fibre répond à la loi du tout ou rien par un PA d'amplitude maximale mais l'activité électrique globale du muscle se traduit comme celle du nerf par une dépolarisation de surface qui répond à la loi du recrutement. Chaque axone innerve par ses ramifications plusieurs fibres musculaires au niveau des plaques motrices, l'ensemble constituant une unité motrice. Ainsi, quand le seuil d'excitation d'un axone est atteint, plusieurs fibres musculaires sont alors dépolarisées (Fig. 1). Le muscle squelettique (muscle strié) peut être stimulé électriquement soit directement, soit indirectement par l'intermédiaire de son nerf moteur. Les fibres du muscle squelettique comme celles du nerf et comme toute cellule excitable répondent à une excitation suffisamment intense par une inversion de leur polarisation : c'est le potentiel d'action. On peut de la même façon que pour le nerf, enregistrer le cheminement de la variation négative à la surface de chaque fibre musculaire ou à la surface externe du muscle. L'enregistrement, comme dans le cas du nerf, représente l'intégration d'un grand nombre de phénomènes unitaires se déroulant au sein de chaque fibre. On parle alors d'activité électrique globale musculaire. Outre cette activité électrique propagée qui présente des caractéristiques voisines de celles du nerf, le muscle répond aux excitations par une contraction. 16

17 Le passage de l influx, du nerf au muscle, se fait avec un certain retard du fait de l existence, entre le nerf et le muscle, de la jonction neuromusculaire ou plaque motrice. Ce retard correspond au délai synaptique. BUT DE LA MANIPULATION La préparation "nerf sciatique-muscle gastrocnémien isolés de grenouille" permet d'étudier simultanément l'activité électrique du nerf et du muscle. Le but de la manipulation est donc de : - caractériser et de comparer l'activité électrique globale du nerf sciatique et l activité électrique globale du muscle gastrocnémien ; - comprendre le fonctionnement de la synapse neuromusculaire : une approche pharmacologique permettra d identifier le type de récepteurs impliqués dans la transmission neuromusculaire ; - Et de déterminer le délai synaptique. PROTOCOLE EXPERIMENTAL 1- Dissection de la préparation nerf sciatique-muscle gastrocnémien - Détruire les centres nerveux de la grenouille (destruction de l'encéphale et de la moelle épinière). - Poser la grenouille sur le dos. Ouvrir la paroi abdominale (peau puis muscles), enlever le tube digestif et l'appareil génital. - Repérer les nerfs rachidiens. Le nerf sciatique part de la base de l'urostyle, il est relié aux 7 ème, 8 ème et 9 ème paires de nerfs rachidiens, l'ensemble constituant le plexus lombo-sacré. - Attacher un fil de 10 cm environ au niveau du plexus près de la colonne vertébrale (ligature antérieure). - Ouvrir la symphyse pubienne à l'aide d'un scalpel. - Disséquer le nerf sciatique au niveau de la cuisse, puis le nerf tibial et le nerf péronier jusqu'au genou. Veiller à ne pas étirer ou pincer les nerfs sinon l'expérience serait compromise par lésion des structures nerveuses. - Disséquer alors le muscle gastrocnémien en commençant par la partie inférieure (le nerf pénètre dans le muscle à la partie supérieure). Disséquer le tendon d'achille et y 17

18 attacher, juste à l'extrémité, un fil de 20 cm de long. Sectionner le tendon au delà de la ligature. - Soulever le muscle avec le fil et le libérer des adhérences conjonctives avec les muscles voisins. Prendre soin de ne pas léser le nerf, dont on peut suivre le trajet à la surface du muscle. Afin de ne pas léser le nerf et de pouvoir fixer l'extrémité antérieure du muscle dans la rainure de la cuve porte-électrodes, sectionner le tibia et le fémur près du genou (cf. Figure 5). - Porter la préparation ainsi isolée dans la cuve porte-électrodes. 2 - Mise en place de la préparation (figure 6) - Bloquer l'extrémité antérieure du muscle (genou) dans la rainure de la cloison de la cuve en ayant soin de ne pas comprimer le nerf à ce niveau. - Immobiliser l'autre extrémité du muscle en passant le fil dans le trou prévu à cet effet; tendre le muscle en tirant sur le fil, et coincer ce dernier avec la petite goupille. Le muscle doit être bien tendu, car lors de la contraction les mouvements du muscle sur les électrodes risquent de provoquer des artéfacts gênants. On se rapprochera ainsi autant que possible des conditions isométriques c'est-à-dire sans modification de longueur du muscle. - Arroser de temps en temps la préparation avec du liquide de Ringer afin qu elle ne se dessèche pas. 3-Montage expérimental et réglage des appareils a) Réglage de l'oscilloscope - mettre en DUAL, vous devez observer 2 traces de balayage. - Faire un montage symétrique sur les deux voies de l oscilloscope. Les 2 entrées d une même voie seront utilisées mais l une sera positive, l autre négative (entrées A +,. entrée B et entrée C+, entrée D-) - Entrées en alternatif. - Sensibilité:10 mv/division. - Vitesse de balayage : 2ms/division. - Déclenchement externe. nerf. b) Cuve à électrodes (cf. schéma de montage ) - Relier les sorties de stimulation du stimulateur à 2 électrodes placées sous le 18

19 - Relier les entrées A et B de la voie 1 de l oscilloscope aux deux électrodes réceptrices sous le nerf. - Relier les entrées C et D de la voie 2 de l oscilloscope aux deux électrodes réceptrices sous le muscle. - Placer les électrodes de terre comme indiqué sur le schéma de montage. Attention : Lorsque vous enregistrez une activité de même signe que l entrée de l oscilloscope, la déviation de la trace de balayage se fera vers le haut, si les signes sont contraires, la déviation se fera vers le bas. Vous enregistrez un champ électrique en surface. Suite à la stimulation du nerf, le champ électrique devient négatif, il faut donc brancher la première électrode située sous le nerf à une entrée négative de l oscilloscope pour obtenir une déviation vers le haut. Suite à la stimulation supraliminaire (efficace) du nerf, il y a création d un champ électrique négatif à la surface du muscle, il faut donc brancher la première électrode située sous le muscle à une entrée négative de l oscilloscope pour obtenir une déviation vers le haut. MANIPULATIONS 1-Enregistrements des activités électriques globales ATTENTION : Le neurotransmetteur (ACh) localisé dans les terminaisons nerveuses est très facilement épuisable dans un muscle privé de son irrigation sanguine. Il convient donc de ménager la préparation en ne réalisant que des stimulations en "monocoup". - En augmentant progressivement l'intensité de la stimulation, apparaîtront sur l'écran de l'oscilloscope les tracés suivants : + sur la voie 1, l'artéfact de stimulation suivi de l'activité électrique globale du nerf. + sur la voie 2, l'activité électrique globale musculaire. L'activité électrique globale musculaire est en général de grande amplitude, et de durée plus importante que celle du nerf. 19

20 - Mettre en mémoire l enregistrement - Imprimer l enregistrement et indiquer la valeur des différents paramètres. - Interpréter les résultats obtenus. 2-Variation de l'intensité de stimulation - Augmenter progressivement l'intensité de stimulation. - Noter les variations observées au niveau des activités électriques globales nerveuse et musculaire. - Imprimer les différents tracés obtenus en notant à chaque fois l'intensité de la stimulation. - Interpréter les résultats obtenus. 3- Etude du délai synaptique - Enregistrer à la fois une activité électrique globale nerveuse sur la voie 1 et une activité électrique globale musculaire sur la voie 2 d'amplitudes maximales. - Mesurer l'intervalle de temps séparant l'artéfact de stimulation du début de l'activité musculaire (lecture sur l'écran de l'oscilloscope). - Connaissant la vitesse moyenne de propagation de la variation négative (25 m/s) et la longueur de la préparation comprise entre la deuxième électrode excitatrice et la première électrode réceptrice placée sous le muscle, calculer le temps théorique (Tt) mis par la dépolarisation pour parcourir cette distance. - Constater qu'il existe une différence entre le temps théorique (Tt) et le temps lu sur l'oscilloscope (Tl). La différence (Tl Tt) correspond au délai synaptique. - Interpréter ce résultat. 4) Mise en évidence du type de récepteurs postsynaptiques : action d'un agent curarisant - Disséquer une nouvelle préparation nerf-muscle. - La placer dans une boîte de Pétri contenant une solution de D-tubocurarine pendant 15 minutes environ. - Stimuler le nerf avec une intensité de stimulation permettant d obtenir des activités électriques d'amplitude maximale. - Imprimer le tracé obtenu. 20

21 - Stimuler directement le muscle gastrocnémien. - Observer le muscle et enregistrer la réponse obtenue. - Analyser et interpréter les résultats obtenus. CONCLUSION A partir de l ensemble des résultats du TP, expliquer le fonctionnement d une synapse neuromusculaire et d une préparation nerf-muscle conduisant à la dépolarisation du muscle et donc à sa contraction. FIN DE MANIPULATION : - Débrancher les fils des divers appareils et les ranger sur la table. - Débrancher les appareils. - Nettoyer la paillasse - Mettre les déchets dans les poubelles adéquates. 21

22 Figure 5 22

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24 DESCRIPTION DES COMMANDES DE L OSCILLOSCOPE SCHLUMBERGER 5027 A MEMOIRE Touche «Marche-Arrêt» de mise en tension de l appareil. 2- Réglage de l épaisseur et de l intensité de la lumière de la trace de balayage. 3- Réglage de la vitesse de balayage du spot sur l écran. 4- Cadrage horizontal de la trace de balayage. 5- Réglage du niveau de déclenchement du balayage sur le signal de synchronisation. 6- Mémoire 7- Touche permettant de sélectionner le mode de fonctionnement de la mémoire M1 et/ou M2 STOCKAGE ENREGIST LIBRE M1 MEMOIRES M2 M1/M2 24

25 LIBRE : voyant indiquant que la mémoire est libre et l écriture possible. ENREGIST :l enregistrement s effectue dans la mémoire et passe directement en mode de stockage. STOCKAGE : L enregistrement est stocké et verrouillé dans la mémoire, la lecture est possible mais l écriture impossible. M1 : l enregistrement présent dans la mémoire M1 est seul visualisé. M2 : l enregistrement présent dans la mémoire M2 est seul visualisé. M1/M2 : les enregistrements présents dans les mémoires M1 et M2 sont visualisés. 8- Choix du mode de synchronisation : AUTOMATIQUE : le balayage a lieu en relaxe, il est délivré automatiquement par l oscilloscope. DECLENCHE : le balayage attend un signal de synchronisation. 9- «A-C» : choix de la voie où est prélevé le signal de synchronisation interne. 10- : entrée de synchronisation externe : sensibilité verticale en V ou en mv par division étalonnage : mettre sur hors. 12- cadrage vertical de la trace de balayage 13- entrée d enregistrement. 14- entrées d enregistrement en position «continu» ( ) ou «alternatif» ( ). 15- commutateur à quatre positions permettant de sélectionner le mode de fonctionnement des entrées A-B : 1 seule trace de balayage correspondant aux entrées A et B ( A+ et B- ) A-B, C-D 2 traces de balayage correspondant aux entrées A et B ( A+ et B- ) d une part et aux entrées C et D d autre part (C+ et D- ) 20- masse. 25

26 MISE EN SERVICE DE L OSCILLOSCOPE SCHLUMBERGER A MEMOIRE - Relier le cordon d alimentation à la terre. - Placer les commutateurs : 8 sur la position «auto» 6 sur «conv» 14 et 16 sur 0 - Afficher une vitesse de balayage de 2 ms ( 3) - Tourner les boutons : lumière (2) à fond à droite cadrage horizontal (4) et cadrage vertical (12 et 19) en position moyenne - Mettre le commutateur 15 sur A-B si l on enregistre sur une les voies A et B (une seule trace de balayage) ou sur A-B, C-D si on utilise les 4 voies de l oscilloscope (2 traces de balayage) - Pousser le bouton marche-arrêt (1) - Agir sur le cadrage horizontal et sur le cadrage vertical pour cadrer les traces de balayage sur l écran (4, 12 et 19) - Tourner le bouton 2 pour obtenir une trace aussi fine que possible - Régler les boutons 11et 17 de façon à obtenir le voltage désiré. 26

27 DESCRIPTION DU PANNEAU DE REGLAGE DU STIMULATEUR HARVARD 1- Interrupteur marche - arrêt. 2- Réglage de l'amplitude du choc en mv ou en V. 3- Réglage de la durée du choc en ms. 4- Choc unique. 5- Chocs multiples. 6- Réglage fin ou grossier de la fréquence de stimulation. 7- Sorties de stimulation. 8- Sorties de synchronisation. 9- Masse du stimulateur. 27

28 EFFETS DE SUBSTANCES AGISSANT SUR LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL ETUDE DES ACTIVITES EXPLORATRICES ET MOTRICES Dans la phase d étude des effets d une molécule nouvelle ou pour explorer plus spécifiquement l activité d une substance psychotrope sur le système nerveux central, de nombreux tests comportementaux peuvent être employés. Un psychotrope est une substance chimique qui agit principalement sur le fonctionnement du système nerveux central en y modifiant certains processus biochimique et physiologique cérébraux. Autant de facettes des comportements à explorer, autant de tests et de modèles développés, afin d évaluer : l activité globale de l animal, qu elle soit déprimée (tranquillisants, anesthésiques) ou augmentée (excitants), la curiosité, le comportement exploratoire, l anxiété, la dépression, les possibilités d apprentissage, de conditionnement, le tonus musculaire, l équilibre ou la coordination motrice, etc. Quelques-uns de ces tests, parmi les plus connus, sont mis en œuvre dans cette manipulation. 1. Substances testées Trois substances psychotropes seront étudiées : le diazépam, la caféine et une substance X dont la nature sera à déterminer. Ces substances seront dissoute dans un excipent (aucun effet physiologique sur le système nerveux central). Solution contenant l excipient Il s agit de la solution dans laquelle sont dissoutes les molécules dont vous étudierez les effets. Cette solution n a donc pas d effet physiologique. Les données obtenues chez l animal traité par la solution contenant l excipient seront dites «contrôles». Solution contenant le diazépam Le diazépam fait partie de la famille des benzodiazépines, appartenant aux tranquillisants mineurs ou anxiolytiques. Il agit comme agoniste non compétitif du GABA sur ses récepteurs GABA A et il favorise aussi l ouverture des canaux chlorures après fixation du médiateur. Le diazépam sera testé à la dose de 2,5 mg/kg. Solution contenant de la caféine La caféine est un inhibiteur des phosphodiestérases et un agoniste des canaux calciques sensible à la ryanodine du réticulum sarcoplasmique. Très liposoluble, elle est douée d une 28

29 action excitante non spécifique de l ensemble du système nerveux central. Elle bloque aussi les récepteurs de l'adénosine, neurotransmetteur inhibiteur d où son action excitante. Chez l homme, elle est utilisée pour limiter les effets sédatifs de certains anticonvulsivants. Elle sera testée chez les souris à la dose de 10 mg/kg. Solution contenant une substance X Vous devrez identifier la nature («caféine», «benzodiazépine», «excipient») de cette solution en comparant ses effets à ceux des 3 précédentes solutions. 2. Tests utilisés Pour disposerez d un lot différent de 4 souris pour chaque test. Pour chacun des tests utilisés, les 4 souris seront traitées par une substance différente («excipient», «diazépam», «caféine», et «substance X» 5 minutes environ avant le début du test Test de la barre fixe L opérateur accroche délicatement une des souris à un fil de fer tendu, par les membres antérieurs puis la lâche. Une souris témoin effectue un rétablissement et se retrouve au-dessus du fil en s aidant de ses membres postérieurs et de sa queue. Sous l effet d un hypnotique, elle tombe immédiatement. Sous l'effet d'un neuroleptique, elle reste accrochée sans réagir (catatonie). Sous l effet d un excitant, elle procédera comme une souris témoin mais sera beaucoup plus rapide à se retrouver au dessus du fil.son excès d activité pourra éventuellement, par la suite, la faire tomber (le noter). On mesure le temps nécessaire au rétablissement (les différences ne sont pas comptabilisées quand les souris mettent moins de deux secondes). Au-delà de 30 secondes, le test est terminé et la souris est remise dans sa cage Test de curiosité/locomotion Une planche épaisse comportant 16 trous est placée à une vingtaine de centimètres du dessus de la paillasse. Placer une souris au centre de la planche, et compter le nombre de trous qu elle explore avant de se lasser. La période d enregistrement est de cinq minutes. Vous devrez aussi reproduire le cheminement fait par chaque animal et le comparer. Dans ce cas, veuillez avoir 5 couleurs différentes (une couleur différente pour chaque minute) Test de la nage forcée La souris est placée dans le cylindre rempli d'environ 15 cm d'eau maintenue à 22. La durée du test est de 4 minutes maximum. Le temps d immobilité est enregistré à l'aide d'un chronomètre pendant les 4 minutes. D un point de vue pratique, vous pouvez comptabiliser le temps de mobilité. Le temps d'immobilité est alors déterminé à l aide de la relation suivante (240 secondes temps mobilité en secondes = temps d immobilité en secondes). Après une phase d'activité vigoureuse d environ deux minutes, l'animal «contrôle» cesse de nager et se fige. On considère que l'animal est immobile lorsqu'il flotte en position horizontale et ne réalise que des mouvements de faibles amplitudes suffisant à maintenir sa tête hors de l'eau. 29

30 3. Manipulation 3.1. Les animaux Vous aurez 4 souris, chacune marquée sur la tête avec une couleur différente correspondant aux 4 groupes «Excipient», «diazépam», «caféine» et «substance X» Injection des substances Toutes les substances sont injectées par voie IP par l enseignant. Les dilutions ont été réalisées de façon à ce que, quelle que soit la dose à administrer, le volume injecté soit le même pour tous les animaux : 0,2 ml/20 g. Le plus grand soin doit être mis dans la méthode et l injection des substances. Le lieu d injection doit être le même pour tous les animaux, et l intégralité du volume à injecter doit être administré. Le stress de contention subi par les animaux doit être le même pour tous Protocoles expérimentaux Pour chaque test, commencez avec la souris «contrôle» c est dire «l excipient». De ce fait, vous pourrez mieux comparer avec ce contrôle les effets des 3 autres substances pharmacologiques. 1 er test : Barre fixe Les animaux sont testés 5 min après l injection. Chaque souris est délicatement présentée à la barre fixe de façon à ce qu elle l agrippe avec les membres antérieurs, puis lâchée. On chronomètre le temps nécessaire à leur rétablissement. Pour tout temps inférieur à deux secondes, on note deux secondes. Au-delà de 30 secondes, les souris sont retirées et remise dans la cage. Recommencer le même protocole avec les autres souris traitées par le«diazépam», la caféine et la «solution X» 2 ème test : Curiosité/locomotion. En utilisant un autre groupe de souris, réaliser le test de curiosité/locomotion. Chaque souris est placée pendant cinq minutes au centre de la planche. Compter le nombre de trous explorés (même si le même trou est exploré plusieurs fois) et dessiner le parcours effectué par l animal. Observez la position de l animal au repos ou en phase locomotrice, s il urine, défèque, mesurez ses temps de repos. Recommencer le même protocole avec les autres souris traitées par le«diazépam», la caféine et la «solution X». Les animaux du 1 er groupe (Barre-fixe) seront eux-aussi testés dans l épreuve de la planche à trous. Donc 2 groupes de 4 souris à tester au lieu d un seul groupe. 3 ème test : Nage forcée Utiliser un autre groupe de souris. Chaque souris est placée pendant 4 minutes dans le bécher rempli d eau et y reste durant 4 minutes. Veuillez observer attentivement l animal durant les 4 minutes du test et notez ce que vous voyez. Après la souris «contrôle», recommencer le même protocole avec les autres souris traitées par le«diazépam», la caféine et la «solution X» 30

31 4. Exploitation des résultats Comparez les effets des différentes substances pharmacologiques (diazépam, caféine et solution X avec la solution «contrôle», mais aussi avec entre-elles. En analysant les tests, et en s appuyant le cas échéant sur les difficultés rencontrées, réfléchir aux points suivants : - Pour chaque test, comment doit-on calculer les paramètres et présenter les résultats? - Que dire des qualités métrologiques de ces tests? - Quelles améliorations éventuelles pourrait-on y apporter? 5-Rédaction du compte-rendu Rédiger un compte-rendu collégial reprenant ces différentes réflexions, et dans lequel les extraits significatifs des tracés auront été insérés. Analysez, interprétez et discutez vos résultats à l aide de données issues de la littérature. Schématiser les modes d action des différentes substances au niveau du SNC. 31

32 PHARMACODYNAMIE & PHARMACOCINETIQUE 1) PHARMACODYNAMIE : REALISATION DE COURBES CONCENTRATION- RESPONSE La musculature de la paroi intestinale est constituée de myocytes lisses unitaires, couplés de façon électrogénique (jonction GAP). Certaines cellules sont dites pace-maker et se caractérisent par leur auto-excitabilité. Leur potentiel membranaire est spontanément instable, déclenche des salves de potentiels d'action qui se propagent aux autres cellules musculaires et sont à l'origine des contractions musculaires. Ce phénomène d'auto-excitabilité peut être modulé par le système nerveux végétatif. Ainsi, les neurones ganglionnaires du système parasympathique libérent de l'acétylcholine qui dépolarise le muscle lisse et accélère le péristaltisme. Par opposition, le système orthosympatique a un rôle inhibiteur sur les contractions péristaltiques. Cette action s'exerce par l'intermédiaire de la noradrénaline qui en se fixant sur les récepteurs α et ß entraîne une diminution durable de la fréquence et de l'amplitude des contractions. Les récepteurs à l'acétylcholine sont classés en fonction des substances antagonistes de cette molécule et non en fonction de l'effet produit par l'ach sur la cellule cible. Ainsi, bien que l'ach induise la contraction du muscle strié comme celle du muscle lisse, les récepteurs cholinergiques de la jonction neuromusculaire squelettique sont de type nicotinique et ont pour antagonistes les curarisants alors que les récepteurs cholinergiques du muscle lisse sont de type muscarinique, leur antagoniste est l'atropine. Le mécanisme d'inhibition de cette substance est de type compétitif. Il existe également des antagonistes non compétitifs du récepteur cholinergique muscarinique comme le Quinuclididyl benzylate (QNB), qui lie le récepteur et empêche donc la fixation de l'agoniste sur ce dernier. La motilité intestinale peut être aussi stimulée par l'histamine. Il existe trois types de récepteurs, H H 1 2 et H 3. Seuls les récepteurs H 1 sont présents au niveau de l'intestin. Les antihistaminiques classiques bloquent ce type de récepteurs par inhibition compétitive (carbinoxamine, diphenhydramine, antazoline). Le principal antagoniste non compétitif des récepteurs histaminiques est la papavérine. Le logiciel modélise une expérience d'enregistrement de la contraction d'un fragment de muscle intestinal isolé. Celui-ci est placé dans une cuve à organe isolé remplie de liquide 32