Guide du système NextSeq MD 500

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1 Guide du système NextSeq MD 500 Destiné à la recherche uniquement. Ne pas utiliser dans le cadre d examens diagnostiques. EXCLUSIF À ILLUMINA Nº Rév. I FRA Mai 2015 Réf. SY DOC Avec Custom Protocol Selector, élaborez un document de référence personnalisé, court et inclusif à partir de votre flux de travail. support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

2 Ce document et son contenu sont exclusifs à Illumina, Inc. et ses sociétés affiliées («Illumina»); ils sont exclusivement destinés à l usage contractuel de son client dans le cadre de l utilisation du ou des produits décrits dans les présentes et ne peuvent servir à aucune autre fin. Ce document et son contenu ne seront utilisés ou distribués à aucune autre fin et ne seront communiqués, divulgués ou reproduits d aucune façon sans le consentement écrit préalable d Illumina. Illumina ne cède aucune licence en vertu de son brevet, de sa marque de commerce, de son copyright ou de ses droits traditionnels ni des droits similaires d un tiers quelconque par ce document. Les instructions contenues dans ce document doivent être suivies strictement et explicitement par un personnel qualifié et adéquatement formé de façon à assurer l utilisation correcte et sûre du ou des produits décrits dans les présentes. Le contenu intégral de ce document doit être lu et compris avant l'utilisation de ce ou ces produits. LE MANQUEMENT À LIRE COMPLÈTEMENT ET À SUIVRE EXPLICITEMENT TOUTES LES INSTRUCTIONS CONTENUES DANS LES PRÉSENTES POURRA CAUSER DES DOMMAGES AU(X) PRODUIT(S), DES BLESSURES AUX PERSONNES, UTILISATEURS OU AUTRES, ET DES DOMMAGES AUX AUTRES BIENS. ILLUMINA REJETTE TOUTE RESPONSABILITÉ RÉSULTANT DE L USAGE ABUSIF DU OU DES PRODUITS DÉCRITS DANS LES PRÉSENTES (Y COMPRIS LES PIÈCES DE CE OU CES PRODUITS OU DU LOGICIEL) Illumina, Inc. Tous droits réservés. Illumina, 24sure, BaseSpace, BeadArray, BlueFish, BlueFuse, BlueGnome, cbot, CSPro, CytoChip, DesignStudio, Epicentre, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, HiSeq X, Infinium, iscan, iselect, MiSeq, NeoPrep, Nextera, NextBio, NextSeq, Powered by Illumina, SeqMonitor, SureMDA, TruGenome, TruSeq, TruSight, Understand Your Genome, UYG, VeraCode, verifi, VeriSeq, la couleur orange citrouille et la conception des bases en flux continu sont des marques de commerce d Illumina, Inc. ou de ses filiales aux États-Unis ou dans d autres pays. Tous les autres noms, logos et marques de commerce appartiennent à leur propriétaire respectif. ii Nº rév. I FRA

3 Historique des révisions Nº Révision Date Description des modifications _FRA I Mai 2015 Correction de la description des réservoirs réservés sur la cartouche de réactifs H Mai 2015 Correction du volume de Tween 20 dans la solution de lavage employée pour les lavages manuels. Restructuration des renseignements portant sur les options de configuration du système. Déplacement des renseignements sur le logiciel Real- Time Analyses, qui figurent maintenant à l annexe A. Guide du système NextSeq 500 iii

4 Nº Révision Date Description des modifications G Février 2015 Mise à jour des descriptions de logiciel pour la version 1.4. du logiciel de commande NextSeq. Ajout d options de lavage manuel : Quick Wash (Lavage rapide) et Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Ajout de la description des fonctionnalités de personnalisation de l analyse afin d éliminer les consommables à la fin de l analyse et d ignorer la confirmation de la vérification avant analyse. Ajout d option permettant d annuler et de redémarrer une vérification avant analyse. Ajout d option permettant d activer le suivi de l analyse en mode autonome. Suppression des descriptions des fichiers de décalage et de mise en phase, qui ne sont plus écrits dans le dossier d analyse. Mise à jour de l image du scatter plot afin d afficher des définitions de base réparties de façon plus uniforme lors de l utilisation de la version 1.4 du logiciel du système. Ajout de la description du service de copie d analyse. Ajout d option d utilisation d un primer personnalisé pour l index 2, qui est possible avec la Trousse NextSeq 500 v2. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ). Mise à jour des instructions de préparation de réactif en vue de l utilisation de la Trousse NextSeq 500 v2 : suppression d étapes de chargement manuelles d hypochlorite de sodium et de primers à indexage double dans la cartouche de réactifs. Ces réactifs sont pré-chargés dans la cartouche de réactifs v2. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de référence des trousses NextSeq 500/550 v2 (référence ). Ajout de la section Consommables pour le séquençage qui répertorie les versions des trousses, les versions NCS compatibles, ainsi que le nom et la référence du guide de référence de la trousse associée. Mise à jour des consommables fournie par l utilisateur afin de spécifier l utilisation du NaOCl pour les options de lavage manuel introduites dans le système NCS v1.4. Correction des exigences relatives aux amplifiats passant par le filtre afin de ne pas dépasser une définition des bases en dessous de la valeur de pureté dans les 25 premiers cycles. Ajout de 120 ml d eau de laboratoire aux instructions de vérification du système _FRA F Septembre 2014 Correction des descriptions des fonctionnalités de la version 1.3 du logiciel de commande NextSeq. Mise à jour de l URL pour les fiches signalétiques : support.illumina.com/sds.html. Mise à jour des marquages des produits NextSeq de MC à MD. iv Nº rév. I FRA

5 Nº Révision Date Description des modifications E Août 2014 Mise à jour des descriptions de logiciel pour la version 1.3 du logiciel de commande NextSeq. Mises à jour des descriptions des commandes de personnalisation du système et des mises à jour du logiciel sur l écran Manage Instrument (Gérer l instrument). Mise à jour de la description de l écran Pre-Run Check (Vérification avant analyse), qui groupe les éléments vérifiés en quatre catégories extensibles. Mise à jour des instructions Live Help (Aide en direct) pour un accès Live Help (Aide en direct) à partir de l URL. L icône s affichant sur l écran d accueil n est pas disponible dans le système NCS v1.3. Ajout de la procédure de réhybridation sur instrument pour la réhybridation du primer de lecture 1. L option de réhybridation d une Flow Cell est compatible avec le NCS v1.3 ou ultérieure et nécessite une nouvelle cartouche de réactifs et une nouvelle cartouche de tampon. Ajout de la section Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ) pour énumérer des ressources supplémentaires D Juin 2014 Ajout des instructions de chargement du BP13 en position nº 18 de la cartouche de réactifs lors de la réalisation d analyses à index double. Correction du cycle auquel apparaissent les données métriques de densité des amplifiats, qui est le cycle 25. Correction des positions de la cartouche de réactifs pour les primers personnalisés en positions nº 7 (lecture 1), nº 8 (lecture 2) et nº 9 (index 1). Ajout d une remarque concernant les dommages potentiels lors du changement de l emplacement de l instrument après installation. Communiquez toujours avec votre représentant Illumina avant de changer l emplacement de votre instrument. Mise à jour de l URL pour les fiches signalétiques : support.illumina.com/sds.ilmn. Historique des révisions Guide du système NextSeq 500 v

6 Nº Révision Date Description des modifications _FRA C Avril 2014 Mise à jour des descriptions de logiciel, qui sont passées au logiciel de commande NextSeq v1.2 et au RTA v2.1 : Ajout du nom de la formule NextSeq Mid à utiliser avec la trousse de rendement moyen NextSeq 500 Suppression des instructions invitant à ajouter du NaOCl à la cartouche de lavage du tampon pour un lavage manuel. Correction du volume de NaOCl qui passe à 3 ml pour la position 28 de la cartouche de réactifs pour le lavage automatique après analyse. Mention de l affichage des noms d analyses longs dans un champ de défilement sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse). Indication selon laquelle RTA v2 n applique pas de corrections de la mise en phase et de la préphase aux lectures d index. Ajout de la description des fichiers de journaux aux listes de fichiers utilisés pour le dépannage. Ajout d instructions pour vider un réservoir à réactifs usagés plein au cours d une analyse. Ajout de la description de dossiers de formules, notamment l emplacement de formules personnalisées. Ajout de la description des vérifications thermiques des ventilateurs et des sondes thermiques. vi Nº rév. I FRA

7 Nº Révision Date Description des modifications _FRA B Février 2014 Mise à jour des descriptions du logiciel de commande NextSeq, passé à la v1.1 : Ajout de la fonction de recherche sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse) pour le filtrage des analyses disponibles. Ajout des formules disponibles, incluant NextSeq High ou NextSeq Mid, en fonction du type de Flow Cell. Note indiquant que les mises à jour du logiciel comprennent l accord de licence, les notes de mise à jour et la liste des logiciels à mettre à jour. Ajout de la description du message d erreur RAID. Note indiquant qu un bouton Exit (Quitter) ferme NSS et redémarre NCS automatiquement à la fin d un contrôle du système. Ajout d une durée de stockage des réactifs allant jusqu à une semaine à 4 C. Nouvelle inscription sur la cartouche de réactifs pour le réservoir nº 10 : Load Library Here (Charger la librairie ici). Mise à jour de la liste des consommables fournie par l utilisateur : précision de l hypochlorite de sodium à 3 à 6 % et ajout du numéro de référence du fournisseur. Mise à jour des instructions de préparation de la solution de NaOCl diluée à 0,06 % pour les lavages de l instrument : réduction de volume à 2 ml et concentration de démarrage de 3 à 6 %. Ajout d illustrations pour montrer la bonne et la mauvaise position de l attache sur la Flow Cell. Mise à jour du chapitre sur l analyse temps réel afin d inclure une présentation de RTA v2, la structure du dossier de sortie et la procédure de définition des bases. Mise à jour du chapitre sur le dépannage afin d inclure les erreurs RTA v2 et d ajouter les fichiers RunParameters.xml dans la liste des fichiers de dépannage A Janvier 2014 Publication originale. Historique des révisions Guide du système NextSeq 500 vii

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9 Table des matières Historique des révisions Table des matières iii ix Chapitre 1 Premiers pas 1 Introduction 2 Ressources supplémentaires 3 Composants de l instrument 4 Présentation des consommables de séquençage 6 Démarrage de l instrument 9 Logiciel NextSeq 11 Consommables et équipement fournis par l utilisateur 19 Chapitre 2 Séquençage 21 Introduction 22 Flux de travail de séquençage 23 Préparer la cartouche de réactifs 24 Préparer la Flow Cell 25 Préparer des librairies pour le séquençage 27 Configurer une analyse de séquençage 28 Contrôler la progression de l analyse 34 Lavage automatique après analyse 36 Chapitre 3 Entretien 37 Introduction 38 Effectuer un lavage manuel 39 Mises à jour logicielles 42 Arrêter l instrument 44 Chapitre 4 Dépannage 45 Introduction 46 Fichiers de dépannage 47 Live Help (Aide en direct) 48 Résoudre les erreurs de vérification automatique 49 Le réservoir des réactifs usagés est plein 51 Flux de réhybridation 52 Formules personnalisées et dossiers de formules 54 Vérification du système 55 Message d erreur RAID 58 Annexe A Real-Time Analysis 59 Introduction 60 Présentation de RTA v2 61 Flux de travail de l analyse temps réel 63 Fichiers de sortie de séquençage 66 Plaques de la Flow Cell 68 Structure des dossiers de sortie 71 Index 73 Assistance technique 77 Guide du système NextSeq 500 ix

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11 Chapitre 1 Premiers pas Premiers pas Introduction 2 Ressources supplémentaires 3 Composants de l instrument 4 Présentation des consommables de séquençage 6 Démarrage de l instrument 9 Logiciel NextSeq 11 Consommables et équipement fournis par l utilisateur 19 Chapitre 1 Guide du système NextSeq 500 1

12 Premiers pas Introduction Le système NextSeq MD 500 d Illumina MD allie la puissance du séquençage à haut débit à la simplicité d un séquenceur de bureau. Fonctionnalités de } Séquençage à débit élevé : le NextSeq 500 permet de réaliser un séquençage d exomes, de génomes entiers ou de transcriptomes. Il prend en charge les librairies TruSeq MD et Nextera MD. } Types de Flow Cell : les Flow Cells existent dans des configurations pour rendement élevé et pour rendement moyen. Chaque type de Flow Cell est accompagné d une cartouche de réactifs compatible pré-remplie. } Real-Time Analysis (RTA) : ce logiciel d analyse intégré effectue une analyse des données sur l instrument, dont une analyse des images et un appel des bases. Le NextSeq utilise une nouvelle version de RTA appelée RTA v2, qui comporte d importants changements en matière d architecture et de fonctionnalités. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Real-Time Analysis à la page 59. } Intégration de BaseSpace MD : le flux de travail de séquençage est intégré à BaseSpace, l environnement informatique consacré à la génomique d Illumina et destiné à l analyse des données, à leur stockage et à leur échange. Sur les instruments configurés pour BaseSpace, les renseignements des librairies et les paramètres d analyse sont spécifiés dans l onglet BaseSpace Prep (Préparation BaseSpace). Les analyses configurées dans BaseSpace s affichent dans l interface de l instrument pendant la configuration de l analyse. Au cours de l analyse, les fichiers de sortie sont transférés en temps réel vers BaseSpace ou BaseSpace Onsite. Considérations relatives à la sécurité Reportez-vous au Guide de sécurité et de conformité du système NextSeq (référence _ FRA) pour des renseignements importants en matière de sécurité. 2 Nº rév. I FRA

13 Ressources supplémentaires Les documents suivants sont disponibles en téléchargement sur le site Web d Illumina. Ressource Guide de préparation du site du système NextSeq (référence _FRA) Guide de sécurité et de conformité du système NextSeq (référence _FRA) Guide de l utilisateur du lecteur RFID, modèle TR (référence _FRA) Librairies de dénaturation et de dilution pour le système NextSeq (référence ) Description Fournit les spécifications relatives à l espace du laboratoire, les exigences électriques et les considérations environnementales. Fournit des renseignements concernant les questions de sécurité, les déclarations de conformité et l étiquetage de l instrument. Fournit des renseignements sur le lecteur RFID de l instrument, les certificats de conformité et les questions de sécurité. Fournit des instructions pour la dénaturation et la dilution des librairies préparées en vue d une analyse de séquençage ainsi que pour la préparation d une librairie de contrôle PhiX facultative. Cette étape s applique à la plupart des types de librairies. Ressources supplémentaires Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ) Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com) Fournit des renseignements concernant l utilisation de primers de séquençage personnalisés à la place de primers de séquençage d Illumina. Fournit des renseignements concernant l utilisation de BaseSpace MD et les options d analyse disponibles. Consultez la page d aide du NextSeq 500 sur le site Web d Illumina pour accéder à la documentation, aux téléchargements de logiciels, à la formation en ligne et aux foires aux questions. Guide du système NextSeq 500 3

14 Premiers pas Composants de l instrument Le système NextSeq 500 comprend un écran tactile, une barre d état et trois compartiments. Figure 1 Composants de l instrument A B C D E Compartiment d imagerie : contient la Flow Cell pendant une analyse de séquençage. Écran tactile : permet la configuration et le paramétrage sur l instrument à l aide de l interface du logiciel de commande. Barre d état : indique si l instrument est en cours de traitement (bleu), nécessite une attention particulière (orange) ou est prêt pour le séquençage (vert) ou lorsqu un lavage doit être effectué dans les prochaines 24 heures (jaune). Compartiment du tampon : contient la cartouche de tampon et le réservoir de réactifs usagés. Compartiment de réactifs :contient la cartouche de réactifs. Compartiment d imagerie Le compartiment d imagerie contient la platine, qui comprend trois broches d alignement pour positionner la Flow Cell. Après le chargement de la Flow Cell, la porte du compartiment d imagerie se ferme automatiquement et positionne les composants. Compartiments des réactifs et du tampon Le paramétrage d une analyse de séquençage sur le NextSeq 500 nécessite d accéder au compartiment des réactifs et au compartiment du tampon pour charger les consommables de l analyse et vider le récipient de réactifs usagés. 4 Nº rév. I FRA

15 Figure 2 A B C D E Compartiments des réactifs et du tampon Porte du compartiment des réactifs : elle ferme le compartiment des réactifs à l aide d'un verrou qui se trouve sous le coin inférieur droit de la porte. Le compartiment des réactifs contient la cartouche de réactifs. Les réactifs sont pompés par les dispositifs d aspiration et circulent dans le système fluidique et la Flow Cell. Cartouche de réactifs : la cartouche de réactifs est un consommable à usage unique prérempli. Cartouche du tampon : la cartouche du tampon est un consommable à usage unique pré-rempli. Réservoir à réactifs usagés : les réactifs usagés sont collectés pour leur mise au rebut après chaque analyse. Porte du compartiment du tampon : elle ferme le compartiment du tampon à l aide d'un verrou qui se trouve sous le coin inférieur gauche de la porte. Le compartiment du tampon renferme la cartouche de tampon et le récipient de réactifs usagés. Composants de l instrument Guide du système NextSeq 500 5

16 Premiers pas Présentation des consommables de séquençage Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 500, une Trousse NextSeq 500 à usage unique est nécessaire. Chaque trousse comprend une Flow Cell et les réactifs nécessaires à une analyse de séquençage. Des codes de couleurs figurent sur les composants de la trousse, afin d indiquer la compatibilité des Flow Cell avec les cartouches de réactifs. Utilisez systématiquement une Flow Cell et une cartouche de réactifs compatibles. La cartouche de tampon est universelle. La Flow Cell, la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon utilisent une identification par radiofréquence (RFID) pour un suivi précis des consommables et pour des questions de compatibilité. Étiquetage de compatibilité de la trousse Des codes de couleurs figurent sur les composants de la trousse, afin d indiquer la compatibilité des Flow Cells avec les cartouches de réactifs. Utilisez systématiquement une Flow Cell et une cartouche de réactifs compatibles. La cartouche de tampon est universelle. Chaque Flow Cell et cartouche de réactifs sont étiquetées High (Élevé) ou Mid (Moyen). Vérifiez à chaque fois l étiquette lorsque vous préparez les consommables pour une analyse. Type de trousse Indication sur l étiquette Composants de la trousse de rendement élevé Composants de la trousse de rendement moyen Présentation de la Flow Cell Figure 3 Cartouche de Flow Cell A Paire de lignes A : lignes 1 et 3 B Paire de lignes B : lignes 2 et 4 C Châssis de la cartouche de Flow Cell La Flow Cell est un substrat de verre qui sert de support à la génération des amplifiats et à la réaction de séquençage. La Flow Cell est enchâssée dans une cartouche de Flow Cell. 6 Nº rév. I FRA

17 La Flow Cell contient quatre lignes qui sont imagées par paires. } Les lignes 1 et 3 (paire de lignes A) sont imagées simultanément. } Les lignes 2 et 4 (paire de lignes B) sont imagées lorsque l imagerie de la paire de lignes A est terminée. Bien que la Flow Cell contienne quatre lignes, une seule librairie ou un seul ensemble de librairies est séquencé(e) sur la Flow Cell. Les librairies sont chargées sur la cartouche de réactifs dans un réservoir unique et transférées automatiquement sur les quatre lignes de la Flow Cell. Chaque ligne est imagée par petites zones d imagerie appelées plaques. Pour obtenir plus de renseignements, consultez Plaques de la Flow Cell à la page 68. Présentation de la cartouche de réactifs La cartouche de réactifs est un consommable à usage unique doté d un système de suivi RFID et de réservoirs scellés par un opercule en aluminium, pré-remplis de réactifs d amplification et de séquençage. Figure 4 Cartouche de réactifs Présentation des consommables de La cartouche de réactifs contient un réservoir prévu pour le chargement des librairies préparées. Après le lancement de l analyse, les librairies sont transférées automatiquement du réservoir à la Flow Cell. Plusieurs réservoirs sont réservés au lavage automatique après analyse. La solution de lavage est pompée de la cartouche du tampon vers les réservoirs réservés, puis vers le récipient de réactifs usagés. Chaque réservoir de la cartouche de réactifs est numéroté. Ne percez pas les opercules d aluminium, sauf instruction contraire afin de charger les librairies avant une analyse, par exemple. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Traitez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes gouvernementales de sécurité en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements concernant l environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. Guide du système NextSeq 500 7

18 Premiers pas Réservoirs réservés Figure 5 Réservoirs numérotés Position Description 7, 8 et 9 Réservé aux primers personnalisés facultatifs 10 Charger les librairies Pour plus de renseignements concernant les primers personnalisés, consultez la section Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ). Réservoir amovible en position nº 6 La cartouche de réactifs préremplie comprend un réactif de dénaturation en position nº 6 qui contient du formamide. Pour faciliter l élimination sûre de tout réactif non utilisé après l analyse de séquençage, le réservoir en position nº 6 est amovible. Pour obtenir plus de renseignements, consultez Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 à la page 31. Présentation de la cartouche de tampon La cartouche de tampon est un consommable à usage unique contenant trois réservoirs préremplis de solutions tampon et d une solution de lavage. Le contenu de la cartouche de tampon est suffisant pour séquencer une Flow Cell. Figure 6 Cartouche de tampon 8 Nº rév. I FRA

19 Démarrage de l instrument 1 Commutez le bouton d alimentation en position I (marche). Figure 7 Interrupteur d alimentation situé à l arrière de l instrument 2 Appuyez sur le bouton d alimentation situé au-dessus du compartiment des réactifs. Le bouton d alimentation active l alimentation de l instrument et démarre l ordinateur et les logiciels intégrés à l instrument. Démarrage de l instrument Figure 8 Bouton d alimentation situé à l avant de l instrument 3 Attendez le chargement complet du système d exploitation. Dès que le système est prêt, le NextSeq Control Software (NCS) démarre et lance automatiquement l initialisation du système. À la fin de l étape d initialisation, l écran d accueil s ouvre. Si votre système a été configuré pour vous demander des identifiants de connexion, utilisez le nom d utilisateur et le mot de passe par défaut : Nom d utilisateur : sbsuser Mot de passe : sbs123 Sinon, connectez-vous à l aide des identifiants propres à votre établissement. Bouton Marche/Arrêt Le bouton Marche/Arrêt situé sur la partie avant du NextSeq met sous tension l instrument et l ordinateur de l instrument. Il réalise les actions suivantes en fonction de l état de l alimentation de l instrument. Guide du système NextSeq 500 9

20 Premiers pas État de l alimentation Instrument hors tension Instrument sous tension Instrument sous tension Action Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre sous tension. Appuyez brièvement sur le bouton pour le mettre hors tension. Une boîte de dialogue s affiche à l écran pour confirmer que l instrument s est arrêté normalement. Appuyez et maintenez le bouton Marche/Arrêt pendant 10 secondes pour provoquer un arrêt forcé de l instrument et de l ordinateur de l instrument. Utilisez cette méthode pour mettre l instrument hors tension uniquement si l instrument ne répond pas. REMARQUE Mettre l instrument hors tension au cours d une analyse de séquençage arrête immédiatement celle-ci. L arrêt d une analyse est définitif. Les consommables de l analyse ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage de l analyse ne sont pas enregistrées. 10 Nº rév. I FRA

21 Logiciel NextSeq Le logiciel de l instrument contient des applications intégrées chargées des analyses de séquençage. } NextSeq Control Software (NCS) : le logiciel de commande vous guide tout au long du processus de configuration d une analyse de séquençage. } Logiciel Real-Time Analysis (RTA) : effectue l analyse des images et la définition des bases lors des. Le NextSeq 500 utilise RTA v2, qui comprend d importantes différences d architecture et de fonctionnalités par rapport aux versions précédentes. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Real-Time Analysis à la page 59. Logiciel NextSeq Écran d accueil L interface du NextSeq Control Software (NCS) s ouvre sur l écran d accueil. Figure 9 Écran d accueil } Sequence (Séquencer) : permet d ouvrir une série d écrans qui vous guide à travers les étapes de configuration d une analyse de séquençage. } Manage Instrument (Gérer l instrument) : fournit les options permettant de configurer les paramètres du système, d effectuer une vérification du système, de mettre à jour le logiciel et d arrêter l instrument. Consultez la section Gérer l instrument à la page 13. Si l instrument est connecté à un réseau doté d un accès à Internet, une icône d alerte s affiche lorsqu une mise à jour logicielle est disponible. } Perform Wash (Effectuer un lavage) : contient les options permettant d effectuer le lavage manuel de l instrument. Consultez la section Effectuer un lavage manuel à la page 39. Lorsqu un lavage est requis, une icône d alerte (Effectuer un lavage). Écrans Run Setup (Configuration de l analyse) s affiche sur le bouton Perform Wash Sélectionnez Sequence (Séquencer) sur l écran d accueil. Une série d écrans s ouvre afin de vous accompagner tout au long des étapes de configuration de l analyse de séquençage. Le flux de travail standard inclut les étapes consistant à se connecter à BaseSpace, à charger les consommables de l analyse, à vérifier les paramètres de l analyse, à effectuer une vérification automatique avant analyse, puis à lancer l analyse. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Séquençage à la page 21. Guide du système NextSeq

22 Premiers pas Option de chargement avancé Le flux de travail standard de configuration d une analyse de séquençage génère l ouverture d une série d écrans consacrés au chargement des consommables. L option de chargement avancé combine en un seul écran les étapes de chargement de la Flow Cell, de la cartouche de tampon et de la cartouche de réactifs, ainsi que le vidage du réservoir de réactifs usagés. Chargez les consommables de l analyse et videz le réservoir de réactifs usagés dans n importe quel ordre. Une fois cela fait, sélectionnez Load (Charger) pour mettre la Flow Cell et la cartouche de réactifs en place. Le placement automatique des consommables peut prendre jusqu à 30 secondes. Lorsque les composants de l analyse sont en place, sélectionnez Next (Suivant). Pour activer l option de chargement avancé, cochez Use Advanced Load Consumables (Utiliser le chargement avancé des consommables) sur l écran Run Customization (Personnalisation de l analyse). Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Personnalisation de l analyse à la page 16. Icônes d état Une icône d état située dans le coin supérieur droit de l écran signale toute modification des conditions pendant la configuration de l analyse ou pendant l analyse. Icône d état Nom de l état Description État OK Le système est normal. Traitement Le système est en cours de traitement. Avertissement Erreur Un avertissement a eu lieu. Les avertissements n interrompent pas une analyse et ne nécessitent pas d intervention pour la poursuite de l'analyse. Une erreur a eu lieu. Les erreurs nécessitent une intervention avant la poursuite de l analyse. En cas de modification de l état, l icône se transforme en l image pertinente et clignote pour vous alerter. Sélectionnez l'icône pour ouvrir la fenêtre d état et afficher une description de la condition. } Sélectionnez un élément indiqué pour consulter une description détaillée de l état et des instructions pour le résoudre, le cas échéant. } Sélectionnez Acknowledge (Accuser réception) pour accepter le message et Close (Fermer) pour fermer la boîte de dialogue. 12 Nº rév. I FRA

23 Gérer l instrument L écran Manage Instrument (Gérer l instrument) contient des paramètres de configuration ainsi que des commandes. Figure 10 Écran Manage Instrument (Gérer l instrument) Logiciel NextSeq Option System Configuration (Configuration du système) System Customization (Personnalisation du système) Software Update (Mise à jour logicielle) System Check (Vérification du système) Shutdown Options (Options d arrêt) Unload Consumables (Décharger les consommables) About (À propos) Volume et description Contient des options permettant de modifier les paramètres du système, tels que le nom, le domaine et la connectivité de l appareil. Consultez la section Paramètres de configuration du système à la page 14. Contient des paramètres logiciels facultatifs sur l apparence, les sons et le nom de l instrument. Consultez la section Personnalisation du système à la page 16. Contient des options permettant de mettre à jour le logiciel de l instrument. Consultez la section Mises à jour logicielles à la page 42. Contient des options de dépannage permettant de vérifier l état de fonctionnement des composants de l instrument. Consultez la section Vérification du système à la page 55. Contient des options permettant de redémarrer le logiciel du système, d arrêter l instrument ou de retourner à Windows. Consultez la section Options d arrêt à la page 17. Déclenche le déchargement de la Flow Cell et de la cartouche de réactifs et le soulèvement des dispositifs d aspiration, qui sortent de la cartouche du tampon et du réservoir des réactifs usagés. Indique les versions des logiciels, le nom de l ordinateur, l identifiant de l instrument ainsi que le nombre d analyses effectuées sur l instrument. Guide du système NextSeq

24 Premiers pas Paramètres de configuration du système Le système est configuré lors de l installation. Toutefois, utilisez les options de configuration du système si une modification est requise. Option Network Configuration (Configuration du réseau) Description Contient les options relatives aux paramètres de l adresse IP, à l adresse DNS (Domain Name Server), au nom de l ordinateur et au nom de domaine. BaseSpace Configuration (Configuration de BaseSpace) Contient les options relatives aux méthodes d analyse (BaseSpace, BaseSpace Onsite, mode autonome et suivi d analyse dans BaseSpace), aux paramètres d identifiants par défaut BaseSpace et aux rapports d état de l instrument. Les écrans de configuration du système comportent les commandes suivantes : } Back (Retour) : permet de revenir à l écran précédent. } Exit (Quitter) : permet de revenir à l écran Manage Instrument (Gérer l instrument) sans enregistrer les modifications. } Save (Enregistrer) : permet d enregistrer les modifications et de passer à l écran suivant. Network Configuration (Configuration du réseau) Option Adresse IP Adresse DNS Description Communiquez avec votre administrateur réseau pour obtenir les adresses propres à votre établissement. Obtain an IP address automatically (Obtenir automatiquement une adresse IP) : permet d obtenir une adresse IP à l aide du serveur DCHP. Use the following IP address (Utiliser l adresse IP suivante) : connecte l instrument à un autre emplacement de serveur. Saisissez l adresse IP. L adresse IP est une série de quatre nombres séparés par des points, par exemple Saisissez le masque de sous-réseau, qui est une subdivision du réseau IP. Saisissez l adresse de la passerelle par défaut, c est-à-dire le routeur du réseau qui se connecte à Internet. Obtain a DNS address automatically (Obtenir automatiquement une adresse DNS) : récupère l adresse DNS associée à l adresse IP. Use the following DNS addresses (Utiliser les adresses DNS suivantes) : connecte l instrument à un serveur qui traduit les noms de domaines en adresses IP. Saisissez les adresses DNS de votre choix. L adresse DNS est le nom du serveur utilisé pour traduire les noms de domaine en adresses IP. Saisissez l adresse DNS secondaire. L adresse secondaire est utilisée si le DNS de votre choix ne peut pas traduire un nom de domaine particulier en adresse IP. 14 Nº rév. I FRA

25 Option Nom de l ordinateur Description Computer Name (Nom de l ordinateur) : nom attribué à l ordinateur de l instrument au moment de sa fabrication. Toute modification du nom de l ordinateur peut affecter la connectivité et exige l intervention d un administrateur réseau. Member of domain (Membre du domaine) : connecte l instrument à un domaine. Le domaine est le nom associé à la connexion Internet dans votre établissement. Il faut un nom d utilisateur et un mot de passe administrateur pour effectuer des modifications de domaine. Member of work group (Membre du groupe de travail) : si l instrument n est pas connecté à Internet, indiquez un nom de groupe de travail. Le nom du groupe de travail est propre à votre établissement. Logiciel NextSeq BaseSpace Configuration (Configuration de BaseSpace) Option Analyse BaseSpace Description BaseSpace : envoie les données de séquençage à l environnement BaseSpace d Illumina. BaseSpace Onsite : envoie les données de séquençage à BaseSpace Onsite. Dans Server Name (Nom du serveur), indiquez le serveur BaseSpace Onsite. [Facultatif] Pour les options BaseSpace ou BaseSpace Onsite, cochez la case Output Folder (Dossier de sortie) puis sélectionnez Browse (Parcourir) et naviguez jusqu à l emplacement choisi. Une fois ce paramètre activé, une copie des données de séquençage (fichiers BCL uniquement) est enregistrée dans un emplacement réseau. Standalone instrument (Instrument autonome) : envoie les données de séquençage vers un emplacement sur le réseau de votre installation. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l emplacement réseau de votre choix. Le logiciel de commande génère le nom du dossier de sortie. [Facultatif] Sélectionnez Use Run Monitoring (Utiliser la surveillance de l analyse) pour surveiller l analyse en utilisant les outils de visualisation sur BaseSpace. Des identifiants de connexion BaseSpace sont requis. Saisissez vos identifiants dans User Name (Nom d utilisateur) et Password (Mot de passe) pour enregistrer l instrument sur BaseSpace. Un paramètre vous permet d instaurer des identifiants par défaut. Use default login and bypass the BaseSpace login screen (Utiliser les identifiants par défaut et ignorer l écran de connexion BaseSpace) : instaure des identifiants BaseSpace par défaut en utilisant le nom d utilisateur et le mot de passe enregistrés et ignore l écran de connexion lors de la configuration de l analyse. Send instrument health information to Illumina (Envoyer des renseignements sur l état de l instrument à Illumina) : envoie les fichiers journaux à Illumina. Cette option ne fonctionne pas avec BaseSpace Onsite ou des configurations autonomes. Guide du système NextSeq

26 Premiers pas Personnalisation du système Option Option Start-Up (Démarrage) Description Kiosk Mode (Mode kiosque) : affiche l interface du logiciel de commande en plein écran. Le logiciel est conçu pour une utilisation en mode kiosque. Windows Mode (Mode Windows) : permet d accéder à Windows sur l ordinateur de l instrument. Toute interaction avec l interface du logiciel, comme par exemple l emplacement des boutons, risque d être altérée dans ce mode. Clavier et son Avatar Image (Image de l avatar) Use on-screen keyboard (Utiliser le clavier de l écran) : active le clavier de l écran pour les entrées sur l instrument. Vous pouvez également connecter un clavier à un port USB externe. Play audio (Lire les sons) : active les signaux sonores pour les événements suivants : Initialisation de l instrument Démarrage d une analyse Apparition de certaines erreurs Interaction avec l utilisateur nécessaire Analyse terminée Avatar Image (Image de l avatar) : sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l image de votre choix pour l instrument. Saisissez le nom de votre choix pour l instrument dans le champ Name (Nom). L image et le nom apparaissent en haut de chaque écran. Personnalisation de l analyse Option Advanced Load (Chargement avancé) Purge Consumables (Éliminer les consommables) Skip Check Confirmation (Ignorer la confirmation de la vérification) Description Use Advanced Load Consumables (Utiliser le chargement avancé des consommables) : sélectionnez cette option pour charger les consommables depuis un écran unique plutôt que depuis la série d écrans de configuration de l analyse. Consultez la section Option de chargement avancé à la page 12. Purge Consumables at End of Run (Éliminer les consommables à la fin de l analyse) : activé par défaut, ce paramètre élimine automatiquement les réactifs inutilisés de la cartouche de réactifs et les dirige vers le réservoir des réactifs usagés après une analyse. Lorsque ce paramètre est désactivé, jetez les réactifs inutilisés manuellement. L élimination des consommables nécessite plus de temps. Vous pouvez désactiver ce paramètre pour une analyse de manière indépendante en utilisant la fonctionnalité Edit (Modifier) sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse). Skip Pre-Run Check Confirmation (Ignorer la confirmation de la vérification avant analyse) : sélectionnez ce paramètre pour démarrer automatiquement le séquençage après une vérification automatique réussie. Si la vérification automatique échoue pour une raison quelconque, résolvez l erreur avant de commencer. 16 Nº rév. I FRA

27 Modifier la configuration de l analyse pour éliminer les consommables Modifiez le paramètre d élimination des consommables pour une analyse de manière indépendante en utilisant la fonctionnalité Edit (Modifier) de l écran Run Setup (Configuration de l analyse). } Configuration de BaseSpace ou BaseSpace Onsite (BaseSpace sur site) : sélectionnez l icône Edit (Modifier) sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse). Lorsque vous avez terminé, sélectionnez l icône Save (Enregistrer). } Configuration autonome : sélectionnez l icône Edit (Modifier) sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse). Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer). Logiciel NextSeq Options d arrêt Les options d arrêt ne doivent pas servir lors du fonctionnement normal. Option Shut Down (Arrêter) Restart (Redémarrer) Exit to Windows (Quitter vers Windows) Description Arrête les logiciels ainsi que l alimentation de l instrument. Consultez la section Arrêter l instrument à la page 44. Redémarre Windows et le logiciel de commande, puis initialise l instrument. Cette commande est généralement utilisée au cours d un dépannage ou sur les recommandations d un représentant d Illumina. Ferme le logiciel de commande et vous dirige directement vers le système d exploitation. Utilisez l option Exit to Windows (Quitter vers Windows) pour les tâches administratives. L interface du logiciel en mode kiosque permet une utilisation normale. Visualiseur d analyse de séquençage Le visualiseur d analyse de séquençage (SAV) affiche des indicateurs de séquençage générés au cours de l analyse. Les indicateurs s affichent sous forme de diagrammes, de graphiques et de tableaux qui s appuient sur des données générées par le RTA et écrits sur des fichiers InterOp. Les indicateurs sont mis à jour pendant la progression de l analyse. Sélectionnez Refresh (Rafraîchir) à tout moment au cours de l analyse pour afficher les indicateurs mis à jour. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de l utilisateur du visualiseur d analyse de séquençage (nº ). Le SAV est inclus dans le System Suite NextSeq du logiciel installé sur l ordinateur de l instrument. Vous pouvez aussi installer le SAV sur un autre ordinateur associé au même réseau que l instrument pour surveiller les indicateurs d analyse à distance. Durée de l analyse de séquençage La durée de l analyse de séquençage dépend du nombre de cycles réalisés. La longueur d analyse maximale est atteinte par une analyse à lectures appariées de 150 cycles par lecture (soit cycles), auxquels s ajoutent les cycles des deux lectures d index (jusqu à huit cycles chacune). Pour connaître les durées attendues et les autres spécifications du système, consultez la page des spécifications du NextSeq 500 sur le site Web d Illumina. Guide du système NextSeq

28 Premiers pas Nombre de cycles dʼune lecture Au cours d une analyse de séquençage, une lecture comprend un cycle de plus que le nombre de cycles analysés. Par exemple, une analyse de 150 cycles à lecture appariée effectue des lectures de 151 cycles (2 151), pour un total de 302 cycles. À la fin de lʼanalyse, 2 x 150 cycles sont analysés. Le cycle supplémentaire est requis pour les calculs de la mise en phase et de la préphase. 18 Nº rév. I FRA

29 Consommables et équipement fournis par l utilisateur Les consommables et l équipement qui suivent sont utilisés sur le NextSeq 500 Consommables fournis par l utilisateur pour les analyses de séquençage Consommable Fournisseur Objectif NaOH 1 N (hydroxyde de sodium) Fournisseur de laboratoire général Dénaturation de la librairie, diluée à 0,2 N Tris-HCl 200 mm, ph7 Fournisseur de laboratoire Dénaturation de la librairie général Lingettes alcoolisées, isopropyle à 70 % VWR, nº de référence (ou équivalent) Nettoyage de la Flow Cell et usage général ou éthanol à 70 % Fournisseur de laboratoire général Gants jetables sans talc Fournisseur de laboratoire général Usage général Chiffon de laboratoire peu pelucheux VWR, nº de référence (ou équivalent) Nettoyage de la Flow Cell Consommables fournis par l utilisateur pour l entretien de l instrument Consommable Fournisseur Objectif NaOCI à 5 % (hypochlorite de sodium) Tween 20 Eau de laboratoire Sigma-Aldrich, nº de référence (ou équivalent) Sigma-Aldrich, nº de référence P7949 Fournisseur de laboratoire général Lavage de l instrument à l aide de la fonction de lavage manuel après analyse, dilution à 0,12 % Lavage de l instrument à l aide des options de lavage manuel, dilution à 0,05 % Lavage de l instrument (lavage manuel) Consommables et équipement fournis par Recommandations à propos de l eau de laboratoire Utilisez toujours de lʼeau de laboratoire pour réaliser des procédures sur l instrument. Nʼutilisez jamais dʼeau courante ou dʼeau désionisée. Voici des exemples d eaux de laboratoire acceptables : } Illumina PW1 } Eau 18 Megohm (MΩ) } Eau Milli-Q } Eau Super-Q } Eau de qualité biologie moléculaire Équipement fourni par l utilisateur Article Congélateur, de 25 à 15 C, sans givre Seau à glace Réfrigérateur, de 2 à 8 C Source Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général Fournisseur de laboratoire général Guide du système NextSeq

30 20 Nº rév. I FRA

31 Chapitre 2 Séquençage Séquençage Introduction 22 Flux de travail de séquençage 23 Préparer la cartouche de réactifs 24 Préparer la Flow Cell 25 Préparer des librairies pour le séquençage 27 Configurer une analyse de séquençage 28 Contrôler la progression de l analyse 34 Lavage automatique après analyse 36 Chapitre 2 Guide du système NextSeq

32 Séquençage Introduction Pour effectuer une analyse de séquençage sur le NextSeq 500, préparez une cartouche de réactifs et une Flow Cell, puis suivez les instructions du logiciel pour configurer et démarrer l analyse. La génération des amplifiats et le séquençage sont réalisés sur l instrument. Après l analyse, un lavage de l instrument commence automatiquement à l aide des composants déjà chargés dans l instrument. Génération d amplifiats Séquençage Analyse Lors de la génération d amplifiats, les molécules d ADN uniques sont liées à la surface de la Flow Cell, puis subissent une amplification de façon à former des amplifiats. L imagerie des amplifiats est réalisée par chimie de séquençage à deux canaux et combinaison de filtres propres à chacun des terminateurs de chaîne marqués par fluorescence. Lorsque l imagerie d une plaque sur la Flow Cell est terminée, le système passe à la plaque suivante. Ce processus se répète pour chaque cycle de séquençage. Après l analyse des images, le logiciel réalise la définition des bases, le filtrage et la notation de la qualité. Surveillez la progression et les statistiques de l analyse à partir de l interface du logiciel de commande, de l onglet Run (Analyse) dans BaseSpace ou d un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d analyse de séquençage (SAV). Consultez la section Visualiseur d analyse de séquençage à la page 17. Pendant la progression de l analyse, le logiciel de commande transfère automatiquement les fichiers de définition des bases (BCL) vers BaseSpace ou vers l emplacement de sortie indiqué pour l analyse secondaire. Plusieurs méthodes d analyse sont disponibles en fonction de votre application. Pour plus de renseignements, consultez le Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com). 22 Nº rév. I FRA

33 Flux de travail de séquençage Pour les configurations utilisant BaseSpace ou BaseSpace Onsite d Illumina : configurez l analyse dans l onglet Prep (Préparation) sur BaseSpace. Consultez le Aide BaseSpace (help.basespace.illumina.com). Préparez une nouvelle cartouche de réactifs : décongelez-la et inspectez-la. Préparez une nouvelle Flow Cell : laissez-la atteindre la température ambiante, déballez-la et inspectez-la. Dénaturez et diluez les librairies (ne s applique pas à tous les types de librairies). Consultez le Librairies de dénaturation et de dilution pour le système NextSeq (référence ). Chargez la dilution de la librairie sur la cartouche de réactifs dans le réservoir nº 10. À partir de l interface logicielle, sélectionnez Sequence (Séquencer) pour lancer les étapes de configuration de l analyse. Chargez la Flow Cell. Flux de travail de séquençage Videz et rechargez le réservoir des réactifs usagés. Chargez la nouvelle cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs. Contrôlez les paramètres de l analyse et les résultats de la vérification automatique. Sélectionnez Start (Démarrer). Surveillez votre analyse à partir de l interface du logiciel de commande, de l onglet Run (Analyse) sur BaseSpace ou depuis un ordinateur en réseau utilisant le visualiseur d analyse de séquençage. Un lavage de l instrument démarre automatiquement lorsque le séquençage est terminé. Guide du système NextSeq

34 Séquençage Préparer la cartouche de réactifs 1 Retirez la cartouche de réactifs de son lieu de stockage réglé entre -25 et -15 C. 2 Faites décongeler la cartouche dans un bain d eau à température ambiante (pendant environ 60 minutes). Ne submergez pas la cartouche. 3 Tapotez la cartouche contre la paillasse afin de retirer l eau présente dans sa base, puis séchez la base. REMARQUE [Autre méthode] Laissez les réactifs décongeler toute la nuit entre 2 C et 8 C. Il faut au moins 18 heures pour que les réactifs décongèlent. À cette température, les réactifs restent stables une semaine. 4 Retournez la cartouche pour mélanger les réactifs. 5 Vérifiez les positions 29, 30, 31 et 32 afin de vous assurer que les réactifs sont décongelés. 6 Tapotez la cartouche sur la paillasse pour réduire le nombre de bulles d air. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Traitez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes gouvernementales de sécurité en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements concernant l environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. 24 Nº rév. I FRA

35 Préparer la Flow Cell 1 Sortez une nouvelle boîte de Flow Cell de son lieu de stockage de 2 à 8 C. 2 Laissez la Flow Cell emballée en dehors de la boîte et à température ambiante pendant 30 minutes. REMARQUE Si l emballage en papier aluminium est intact, la Flow Cell peut rester à température ambiante durant 12 heures. Évitez les modifications de température répétées de la Flow Cell. 3 Sortez la Flow Cell de son emballage d aluminium. Figure 11 Retrait de l emballage d aluminium Préparer la Flow Cell 4 Ouvrez l emballage double coque en plastique transparent et sortez la Flow Cell. Figure 12 Retrait de l emballage double coque 5 Nettoyez la surface en verre de la Flow Cell à l aide d une lingette alcoolisée non pelucheuse. Séchez le verre avec un chiffon de laboratoire peu pelucheux. Inspecter la Flow Cell 1 Assurez-vous que les ports de la Flow Cell ne sont pas obstrués. 2 Vérifiez que les joints des ports sont fixés et que les tenons en plastique blanc rectangulaires sont visibles. Guide du système NextSeq

36 Séquençage Figure 13 Composants de la Flow Cell A Joints de port (4) B Pinces de maintien (4) C Pinces à ressort (4) D Châssis de la cartouche de Flow Cell E Plaque de support 3 Assurez-vous que les quatre pinces de maintien blanches sont bien encliquetées sur le bord de la plaque de support noire. Si la plaque n est pas bien fixée sous les pinces, appuyez doucement sur la plaque de support noire et sur le châssis de la cartouche blanche, jusqu à ce que la plaque s enclenche sous les pinces. Figure 14 Inspection des pinces de maintien A B Mauvais positionnement : la pince de maintien n est pas encliquetée sur le bord de la plaque de support. Bon positionnement : la pince de maintien est encliquetée sur le bord de la plaque de support. 4 Vérifiez que les quatre pinces métalliques à ressort sont positionnées à plat contre la plaque de support noire. Figure 15 Inspection des pinces à ressort A B Mauvais positionnement : la pince à ressort n est pas à plat contre la plaque de support. Bon positionnement : la pince à ressort est à plat contre la plaque de support. 26 Nº rév. I FRA

37 Préparer des librairies pour le séquençage Dénaturer et diluer les librairies Si le type de vos librairies l impose, dénaturez et diluez les librairies et ajoutez une librairie de contrôle PhiX. Le volume et la concentration de chargement des librairies varient selon la version NCS que vous utilisez. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Librairies de dénaturation et de dilution pour le système NextSeq (référence ). Charger des librairies sur la cartouche de réactifs 1 Nettoyez l opercule en aluminium recouvrant le réservoir nº 10 étiqueté Load Library Here(Charger la librairie ici) à l aide d un chiffon peu pelucheux. 2 Percez l opercule avec le bout d une pipette de 1 ml propre. 3 Chargez des librairies dans le réservoir nº 10 étiqueté Load Library Here (Charger la librairie ici). Évitez de toucher l opercule en aluminium pendant le transfert du produit. Figure 16 Chargement des librairies Préparer des librairies pour le séquençage Guide du système NextSeq

38 Séquençage Configurer une analyse de séquençage Depuis l écran d accueil, sélectionnez Sequence (Séquencer). La commande Sequence (Séquencer) déclenche l ouverture de la porte du compartiment d imagerie, la libération des consommables utilisés lors de l analyse précédente et l ouverture d une série d écrans de configuration de l analyse. Un court délai est normal. Si l instrument est configuré pour BaseSpace ou BaseSpace Onsite, l écran de connexion BaseSpace apparaît. Se connecter à BaseSpace 1 Saisissez votre nom d utilisateur et votre mot de passe BaseSpace. 2 Sélectionnez Next (Suivant). Charger la Flow Cell 1 Retirez la Flow Cell usagée ayant servi à la précédente analyse. 2 Positionnez la Flow Cell sur la platine à l aide des broches d alignement. Figure 17 Chargement de la Flow Cell 3 Sélectionnez Load (Charger). La porte se ferme automatiquement, l identifiant de la Flow Cell s affiche à l écran et les capteurs sont activés. 4 Sélectionnez Next (Suivant). Vider le réservoir à réactifs usagés 1 Retirez le réservoir des réactifs usagés et jetez le contenu conformément aux normes applicables. 28 Nº rév. I FRA

39 Figure 18 Retirer le réservoir à réactifs usagés REMARQUE Placez votre autre main sous le réservoir lorsque vous le retirez afin de le soutenir. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Traitez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes gouvernementales de sécurité en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements concernant l environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. 2 Faites glisser le réservoir à réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu à la butée. Un déclic indique que le réservoir est en place. Configurer une analyse de séquençage Figure 19 Charger le réservoir à réactifs usagés vide Guide du système NextSeq

40 Séquençage Charger la cartouche de tampon 1 Retirez la cartouche de tampon usagée du compartiment supérieur. 2 Glissez une nouvelle cartouche de tampon dans le compartiment de tampon jusqu à la butée. Un déclic indique que la cartouche est en position, l identifiant de la cartouche du tampon s affiche sur l écran et le capteur est activé. Figure 20 Charger la cartouche de tampon 3 Fermez la porte du compartiment de tampon et sélectionnez Next (Suivant). Charger la cartouche de réactifs 1 Retirez la cartouche de réactifs usagés du compartiment des réactifs. Éliminez tout contenu inutilisé conformément aux normes applicables. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Traitez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes gouvernementales de sécurité en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements concernant l environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. REMARQUE Le réservoir à la position 6 est amovible pour faciliter la mise au rebut en toute sécurité des réactifs inutilisés. Pour obtenir plus de renseignements, consultez Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 à la page Glissez la cartouche de réactifs dans le compartiment des réactifs jusqu à ce que la cartouche touche la butée, puis fermez la porte du compartiment des réactifs. 30 Nº rév. I FRA

41 Figure 21 Charger la cartouche de réactifs 3 Sélectionnez Load (Charger). Le logiciel positionne automatiquement la cartouche (environ 30 secondes), l identifiant de la cartouche des réactifs apparaît sur l écran et les capteurs sont activés. 4 Sélectionnez Next (Suivant). Retirer le réservoir usagé de la position nº 6 1 Après avoir retiré la cartouche de réactifs usagés de l instrument, retirez le couvercle de protection en caoutchouc couvrant la fente à côté de la position nº 6. Figure 22 Position amovible nº 6 Configurer une analyse de séquençage A Couvercle de protection en caoutchouc B Position nº 6 2 Appuyez sur l onglet en plastique transparent, puis poussez vers la gauche pour éjecter le réservoir. 3 Mettez le réservoir au rebut conformément aux normes de sécurité. Indiquer les paramètres de l analyse Les étapes affichées à l écran Run Setup (Configuration de l analyse) varient en fonction de la configuration du système : } BaseSpace ou BaseSpace Onsite : l écran Run Setup (Configuration de l analyse) indique les analyses configurées dans BaseSpace. Si l analyse prévue n apparaît pas sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse), vérifiez qu elle est marquée pour séquençage dans BaseSpace. } Autonome : l écran Run Setup (Configuration de l analyse) comporte des champs permettant de définir les paramètres de l analyse. Guide du système NextSeq

42 Séquençage Sélectionner une analyse disponible (Configuration BaseSpace) 1 Sélectionnez un nom d analyse dans la liste des analyses disponibles. Utilisez les flèches haut et bas pour faire défiler la liste ou saisissez le nom d une analyse dans le champ de recherche. 2 Sélectionnez Next (Suivant). 3 Confirmez les paramètres de l analyse. Nom de l analyse : le nom de l analyse tel qu attribué dans BaseSpace. ID de la librairie : le nom des librairies compilées tel qu attribué dans BaseSpace. Formule : le nom de la formule, NextSeq High ou NextSeq Mid, en fonction de la cartouche de réactifs utilisée pour l analyse. Type de lecture : lecture unique ou appariée. Longueur de la lecture : le nombre de cycles par lecture. [Facultatif] Primers personnalisés, le cas échéant. 4 [Facultatif] Sélectionnez l icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer). Paramètres d analyse : modifiez le nombre de lectures ou le nombre de cycles par lecture. Custom primers (Primers personnalisés) : modifiez les réglages des primers personnalisés. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ). Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifiez les réglages pour éliminer automatiquement les consommables après l analyse en cours. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Personnalisation de l analyse à la page Sélectionnez Next (Suivant). Saisir les paramètres d analyse (configuration autonome) 1 Saisissez le nom de votre choix pour l analyse. 2 [Facultatif] Saisissez l identifiant de librairie de votre choix. 3 Sélectionnez une formule dans la liste déroulante Recipe (Formule). Seules les formules compatibles sont répertoriées. 4 Sélectionnez un type de lecture, soit Single Read (Lecture unique), soit Paired End (Lecture appariée). 5 Indiquez le nombre de cycles pour chaque lecture de l analyse de séquençage. Lecture 1 : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles. Lecture 2 : saisissez une valeur dans la limite de 151 cycles. Cette valeur est généralement identique au nombre de cycles de la lecture 1. Index 1 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d index 1 (i7). Index 2 : saisissez le nombre de cycles nécessaire pour le primer d index 2 (i5). Le logiciel de commande confirme vos saisies en utilisant les critères suivants : Le nombre de cycles total ne dépasse pas le nombre de cycles maximum permis. Le nombre de cycles de la lecture 1 est supérieur à 5 (valeur correspondant aux 5 cycles utilisés pour la génération du modèle). 32 Nº rév. I FRA

43 Le nombre de cycles de lecture d index ne dépasse pas le nombre de cycles de la lecture 1 et de la lecture 2. 6 [Facultatif] Si vous utilisez des primers personnalisés, cochez la case correspondant aux primers utilisés. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Guide des primers personnalisés NextSeq (référence ). Lecture 1 : primer personnalisé pour la lecture 1. Lecture 2 : primer personnalisé pour la lecture 2. Index 1 : primer personnalisé pour l index 1. Index 2 : primer personnalisé pour l index 2. 7 [Facultatif] Sélectionnez l icône Edit (Modifier) pour modifier les paramètres de l analyse. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Save (Enregistrer). Output folder location (Emplacement du dossier de sortie) : modifiez l emplacement du dossier de sortie pour l analyse en cours. Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l emplacement réseau. Purge consumables for this run (Éliminer les consommables pour cette analyse) : modifiez les réglages pour éliminer automatiquement les consommables après l analyse en cours. Pour obtenir plus de renseignements, consultez la section Personnalisation de l analyse à la page 16. Use run monitoring for this run (Utiliser la surveillance de l analyse pour cette analyse) : modifiez les réglages pour utiliser la surveillance de l analyse dans BaseSpace. 8 Sélectionnez Next (Suivant). Passer en revue la vérification automatisée Le logiciel effectue une vérification automatisée du système. Au cours de la vérification, les indicateurs suivants s affichent sur l écran : } Coche grise : la vérification n a pas été encore effectuée. } Icône de progression : la vérification est en cours. } Coche verte : l élément est conforme. } Croix rouge : la vérification a échoué. Pour tous les éléments qui n ont pas réussi la vérification, une action est nécessaire avant que vous puissiez continuer. Consultez la section Résoudre les erreurs de vérification automatique à la page 49. Configurer une analyse de séquençage Pour arrêter une vérification automatisée en cours, sélectionnez l icône inférieur droit. Pour redémarrer la vérification, sélectionnez l icône reprend à la première vérification incomplète ou non conforme. dans le coin. La vérification Pour afficher les résultats de chaque vérification dans une catégorie, sélectionnez l icône pour agrandir la catégorie. Démarrer l analyse Une fois la vérification automatisée terminée, sélectionnez Start (Démarrer). L analyse de séquençage commence. Pour configurer le système en vue de démarrer automatiquement l analyse après une vérification réussie, consultez la section Personnalisation de l analyse à la page 16. Guide du système NextSeq

44 Séquençage Contrôler la progression de l analyse Surveillez la progression, les intensités et les scores de qualité de l analyse à mesure que les indicateurs s affichent à l écran. Figure 23 Progression et indicateurs de l analyse de séquençage A B C D E F G Progression de l analyse : indique l étape en cours et le nombre de cycles réalisés pour chaque lecture. La barre de progression n est pas proportionnelle au débit d analyse de chaque étape. Utilisez le temps restant dans le coin supérieur droit pour déterminer la durée réelle. Q-Score (Notation de la qualité) : indique la répartition des scores de qualité (Qscores). Consultez Notation de la qualité à la page 65. Intensity (Intensité) : indique la valeur de l intensité des amplifiats du 90 e centile de chaque plaque. Les couleurs du tracé indiquent chaque base : A est rouge, C vert, G bleu et T noir. Les couleurs correspondent aux indicateurs de base dans le logiciel d analyse de séquençage (SAV). Cluster Density (Densité des amplifiats) (K/mm²) : indique le nombre dʼamplifiats détectés pour lʼanalyse. Clusters Passing Filter (Amplifiats passant le filtre) (%) : indique le pourcentage d amplifiats passant le filtre. Consultez Amplifiats passant par le filtre à la page 62. Estimated Yield (Estimation du rendement) (Gb) : indique le nombre de bases prévues pour l analyse. Image de la Flow Cell : illustre la paire de lignes faisant l objet de l imagerie pendant que l autre paire passe une étape de chimie. REMARQUE Après avoir sélectionné Home (Accueil), il est impossible de revenir en arrière pour afficher les indicateurs de l analyse. Toutefois, les indicateurs de l analyse sont accessibles sur BaseSpace ou consultables depuis un ordinateur autonome à l aide du visualiseur d analyse de séquençage (SAV). Cycles des indicateurs de l analyse Les indicateurs d analyse apparaissent à différents moments au cours d une analyse. } Aucun indicateur ne s affiche au cours des étapes de génération d amplifiats. } Les cinq premiers cycles sont réservés à la génération du modèle. } Les indicateurs de l analyse apparaissent après le cycle 25, notamment la densité des amplifiats, les amplifiats passant le filtre, le rendement et les scores de qualité. 34 Nº rév. I FRA

45 Transfert de données En fonction de la configuration d analyse sélectionnée, une icône s affiche à l écran au cours de l analyse pour indiquer l état du transfert de données. État Connecté Connecté, transfert de données en cours Déconnecté Illumina BaseSpace BaseSpace Onsite (BaseSpace sur site) Instrument autonome Si le transfert de données est interrompu en cours d analyse, les données sont stockées temporairement sur l ordinateur de l instrument. Une fois la connexion rétablie, le transfert de données reprend automatiquement. Si la connexion n est pas rétablie avant la fin de l analyse, les données doivent être supprimées de l ordinateur de l instrument manuellement avant le lancement d une nouvelle analyse. Service de copie de l analyse La suite logicielle du système NextSeq contient un service de copie de l analyse. RTA v2 demande au service de copier des fichiers situés à un emplacement source vers un emplacement de destination; et le service traite les demandes de copie dans l ordre d arrivée. Si une exception survient, le fichier retourne en file d attente de copie en fonction du nombre de fichiers contenus dans la file d attente de copie. Contrôler la progression de l analyse Guide du système NextSeq

46 Séquençage Lavage automatique après analyse Une fois l analyse de séquençage terminée, le logiciel lance un lavage automatique après analyse à l aide d une solution de lavage contenue dans la cartouche de tampon et d hypochlorite de sodium (NaOCI) dans la cartouche de réactifs. Le lavage automatique après analyse dure 90 minutes environ. Une fois le lavage terminé, le bouton Home (Accueil) redevient actif. Les résultats du séquençage restent visibles à l écran pendant le lavage. REMARQUE Le lavage automatique après analyse rince le système en pompant de la solution de lavage dans la cartouche de tampon et en la faisant circuler dans les réservoirs de lavage dédiés de la cartouche de réactifs puis dans le réservoir de réactifs usagés. Après le lavage Après le lavage, laissez les dispositifs d aspiration en position basse afin d empêcher l air d entrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu à l analyse suivante. 36 Nº rév. I FRA

47 Chapitre 3 Entretien Entretien Introduction 38 Effectuer un lavage manuel 39 Mises à jour logicielles 42 Arrêter l instrument 44 Chapitre 3 Guide du système NextSeq

48 Entretien Introduction Les procédures d entretien comprennent des lavages manuels de l instrument ainsi que des mises à jour du logiciel du système, si disponibles. } Lavages de l instrument : un lavage automatique après chaque analyse de séquençage permet d optimiser les performances de l instrument. Cependant, un lavage manuel est exigé de manière régulière dans certaines situations. Consultez la section Effectuer un lavage manuel à la page 39. } Mises à jour du logiciel : lorsqu une version mise à jour du système est disponible, vous pouvez installer automatiquement la mise à jour en vous connectant à BaseSpace ou l installer manuellement après le téléchargement du programme d installation sur le site d Illumina. Consultez la section Mises à jour logicielles à la page Nº rév. I FRA

49 Effectuer un lavage manuel Les lavages manuels sont initiés depuis l écran d accueil. Parmi les options de lavage figurent notamment Quick Wash (Lavage rapide) et Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Types de lavage Quick Wash (Lavage rapide) Durée : 20 minutes Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse) Durée : 90 minutes Description Rince le système avec une solution de lavage fournie par l utilisateur composée d eau de laboratoire et de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon). Doit être effectué tous les 14 jours si l instrument est inutilisé ou après un arrêt. Rince le système avec une solution de lavage fournie par l utilisateur composée d eau de laboratoire, de Tween 20 (cartouche de lavage du tampon) et d hypochlorite de sodium à 0,12 % (cartouche de lavage des réactifs). Doit être effectué si le lavage automatique après analyse n a pas été effectué. Effectuer un lavage manuel Un lavage manuel nécessite l utilisation de la cartouche de lavage des réactifs et de la cartouche de lavage du tampon fournies avec l instrument, ainsi que d une Flow Cell usagée. Une Flow Cell usagée peut être utilisée jusqu à 20 fois pour des lavages de l instrument. Figure 24 Cartouche de lavage des réactifs et cartouche de lavage du tampon Préparer un lavage manuel après analyse Consommables fournis par l utilisateur Volume et description NaOCl 1 ml, dilution à 0,12 % Chargé dans la cartouche de lavage des réactifs (position nº 28) Tween 20 à 100 % Eau de laboratoire Utilisée pour préparer une solution de lavage Tween 20 à 0,05 % de 125 ml Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central) Guide du système NextSeq

50 Entretien REMARQUE Utilisez toujours une nouvelle dilution de NaOCI préparée au cours des dernières 24 heures. Si vous préparez un volume supérieur à 1 ml, stockez la dilution restante entre 2 et 8 C pour une utilisation dans les 24 heures suivantes. Sinon, jetez la dilution de NaOCl restante. 1 Combinez les volumes suivants dans un microtube à centrifuger pour obtenir 1 ml de NaOCl à 0,12 % : 5 % de NaOCl (24 µl) Eau de laboratoire (976 µl) 2 Retournez le tube pour mélanger. 3 Ajoutez 1 ml de NaOCI à 0,12 % à la cartouche de lavage des réactifs. Le réservoir approprié est équivalent à la position nº 28 de la cartouche préremplie. Figure 25 Chargement du NaOCl 4 Combinez les volumes suivants pour obtenir une solution de lavage Tween 20 à 0,05 % : Tween 20 à 100 % (62 µl) Eau de laboratoire (125 ml) 5 Ajoutez 125 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon. 6 Sélectionnez Perform Wash (Effectuer le lavage), puis Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Préparer un lavage rapide Consommables fournis par l utilisateur Tween 20 à 100 % Eau de laboratoire Volume et description Utilisé pour obtenir 40 ml de solution de lavage Tween 20 à 0,05 % Chargée dans la cartouche de lavage du tampon (réservoir central) 1 Combinez les volumes suivants pour obtenir une solution de lavage Tween 20 à 0,05 % : Tween 20 à 100 % (20 µl) Eau de laboratoire (40 ml) 2 Versez 40 ml de solution de lavage dans le réservoir central de la cartouche de lavage du tampon. 3 Sélectionnez Perform Wash (Effectuer un lavage), puis Quick Wash (Lavage rapide). 40 Nº rév. I FRA

51 Charger une Flow Cell usagée et les cartouches de lavage 1 En l absence de Flow Cell usagée, chargez une Flow Cell usagée. Sélectionnez Load (Charger), puis sélectionnez Next (Suivant). 2 Retirez le réservoir des réactifs usagés et jetez le contenu conformément aux normes applicables. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Portez un équipement de protection, y compris des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Traitez les réactifs usagés comme des déchets chimiques et éliminez-les conformément aux normes gouvernementales de sécurité en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements concernant l environnement, la santé et la sécurité, consultez la fiche signalétique de cette trousse à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. 3 Faites glisser le réservoir de réactifs usagés vide dans le compartiment de tampon jusqu à la butée. 4 Retirez la cartouche de tampon usagée de la précédente analyse, le cas échéant. 5 Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant la solution de lavage. 6 Retirez la cartouche de réactifs usagée de la précédente analyse, le cas échéant. 7 Chargez la cartouche de lavage des réactifs. 8 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification du prélavage commence automatiquement. Effectuer un lavage manuel Démarrer le lavage Après le lavage 1 Sélectionnez Start (Démarrer). 2 Une fois le lavage terminé, sélectionnez Home (Accueil). Après le lavage, laissez les dispositifs d aspiration en position basse afin d empêcher l air d entrer dans le système. Laissez les cartouches en place jusqu à l analyse suivante. Guide du système NextSeq

52 Entretien Mises à jour logicielles Les mises à jour logicielles sont intégrées dans une offre groupée appelée System Suite, qui comprend : } NextSeq Control Software (NCS) } NextSeq recipes } RTA v2 } NextSeq Service Software (NSS) } Visualiseur d analyse de séquençage (SAV) } BaseSpace Broker Vous pouvez installer les mises à jour logicielles automatiquement à l aide d une connexion internet ou manuellement à partir d un réseau ou d un emplacement USB. } Automatic updates (Mises à jour automatiques) : pour les instruments connectés à un réseau doté d un accès à Internet, l icône d alerte s affiche sur le bouton Manage Instrument (Gérer l instrument) de l écran d accueil lorsqu une mise à jour est disponible. } Manuel updates (Mises à jour manuelles) : permet de télécharger le programme d installation de System Suite à partir de la page d aide NextSeq 500 du site Web d Illumina. Mise à jour automatique des logiciels 1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l instrument). 2 Sélectionnez Software Update (Mise à jour des logiciels). 3 Sélectionnez Install the update already downloaded from BaseSpace (Installer la mise à jour déjà téléchargée à partir de BaseSpace). 4 Sélectionnez Update (Mettre à jour) pour commencer la mise à jour. Une boîte de dialogue apparaît pour la confirmation de la commande. 5 Suivez les instructions de l assistant d installation : a Acceptez l accord de licence. b Lisez les notes de mise à jour. c Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour. Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée. REMARQUE Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire après son installation. Mise à jour manuelle des logiciels 1 Téléchargez le programme d installation System Suite depuis le site Internet d Illumina et enregistrez-le dans un emplacement réseau. Vous pouvez également copier le fichier d installation du logiciel sur une clé USB. 2 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l instrument). 3 Sélectionnez Software Update (Mise à jour des logiciels). 42 Nº rév. I FRA

53 4 Sélectionnez Manually install the update from the following location (Installer manuellement la mise à jour à partir de l emplacement suivant). 5 Sélectionnez Browse (Parcourir) pour accéder à l emplacement du fichier d installation du logiciel puis sélectionnez Update (Mettre à jour). 6 Suivez les instructions de l assistant d installation : a Acceptez l accord de licence. b Lisez les notes de mise à jour. c Consultez la liste des logiciels inclus dans la mise à jour. Le logiciel de commande redémarre automatiquement une fois la mise à jour logicielle effectuée. REMARQUE Si une mise à jour du micrologiciel est incluse, un redémarrage automatique du système est nécessaire après son installation. Mises à jour logicielles Guide du système NextSeq

54 Entretien Arrêter l instrument 1 Sélectionnez Manage Instrument (Gérer l instrument). 2 Sélectionnez System Power Options (Options d alimentation du système). 3 Sélectionnez Shut Down (Arrêter). La commande d arrêt ferme le logiciel de manière sûre et coupe l alimentation de l instrument. Attendez au moins 60 secondes avant de mettre à nouveau en marche l instrument. ATTENTION Ne déplacez pas l instrument. Un déplacement inapproprié de l instrument peut avoir un impact sur l alignement optique et compromettre l intégrité des données. Si vous devez déplacer l instrument, communiquez avec votre représentant Illumina. 44 Nº rév. I FRA

55 Chapitre 4 Dépannage Dépannage Introduction 46 Fichiers de dépannage 47 Live Help (Aide en direct) 48 Résoudre les erreurs de vérification automatique 49 Le réservoir des réactifs usagés est plein 51 Flux de réhybridation 52 Formules personnalisées et dossiers de formules 54 Vérification du système 55 Message d erreur RAID 58 Chapitre 4 Guide du système NextSeq

56 Dépannage Introduction En cas de questions techniques, consultez les pages dʼassistance du NextSeq 500 sur le site Web d Illumina. Les pages d assistance fournissent un accès à la documentation, aux téléchargements et aux foires aux questions. Connectez-vous à votre compte MyIllumina pour accéder aux bulletins d assistance. En cas de problème avec la qualité ou la performance de l analyse, communiquez avec l assistance technique d Illumina. Consultez la section Assistance technique à la page 77. Il est possible de partager un lien vers le résumé d analyse dans BaseSpace avec l assistance technique d Illumina pour faciliter le dépannage. 46 Nº rév. I FRA

57 Fichiers de dépannage Un représentant de lʼassistance technique d Illumina peut vous demander de fournir des copies des fichiers propres à lʼanalyse ou au balayage à des fins de dépannage. Les fichiers suivants sont généralement utilisés pour le dépannage. Fichier clé Dossier Description Fichier de renseignements sur l analyse (RunInfo.xml) Dossier racine Comprend les renseignements suivants : Nom de l analyse Nombre de cycles de l analyse Nombre de cycles dans chaque lecture Lecture indexée ou non Nombre de témoins et de plaques sur la Flow Cell Fichiers de dépannage Fichier des paramètres de l analyse (RunParameters.xml) Fichiers de configuration RTA (RTAConfiguration.xml) Dossier racine Data\Intensities Contient des renseignements concernant les paramètres et les composants des analyses. Parmi les renseignements figurent le RFID, le numéro de série, la référence et la date d expiration. Comprend les paramètres de configuration RTA pour l analyse. Le fichier RTAConfiguration.xml est créé au début de l analyse. Fichiers InterOp (*.bin) InterOp Les fichiers binaires sont utilisés pour le visualiseur d analyse de séquençage. Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l analyse. Fichiers journaux Journaux Les fichiers journaux décrivent chaque étape effectuée par l instrument au cours de chaque cycle et répertorient les versions de logiciels et de progiciels utilisées lors de l analyse. Le fichier nommé [NomInstrument]_CurrentHardware.csv répertorie les numéros de série des composants de l instrument. Fichiers journaux des erreurs (*ErrorLog*.txt) Fichiers journaux globaux (*GlobalLog*.tsv) Fichiers journaux des lignes (*LaneLog*.txt) Journaux RTA Journaux RTA Journaux RTA Journal des erreurs RTA. Les fichiers journaux des erreurs sont mis à jour à chaque fois qu une erreur se produit. Journal de tous les événements RTA. Les fichiers journaux globaux sont mis à jour tout au long de l analyse. Journal des événements RTA en cours. Les fichiers journaux des lignes sont mis à jour tout au long de l analyse. Erreurs RTA Pour résoudre les problèmes RTA, vérifiez d abord le journal des erreurs RTA stocké dans le dossier RTALogs. Ce fichier n est pas présent pour les analyses réussies. Joignez le journal des erreurs lors du signalement des problèmes à l assistance technique d Illumina. Guide du système NextSeq

58 Dépannage Live Help (Aide en direct) La fonctionnalité Live Help (Aide en direct) connecte l instrument directement au personnel de l assistance technique d Illumina à des fins de dépannage. Avec votre autorisation, un représentant de l assistance technique d Illumina peut accéder à votre écran et partager le contrôle de votre instrument. Vous conservez une priorité de commande et gardez la possibilité d interrompre la séance de partage d écran à tout moment. L instrument doit être connecté à un réseau disposant d un accès à Internet pour l'activation de l aide en direct. Share Your Desktop (Partage de bureau) 1 Sur l écran Manage Instrument (Gérer l instrument), sélectionnez Shutdown Options (Options d arrêt). 2 Sur l écran Shutdown Options (Options d arrêt), sélectionnez Exit to Windows (Quitter vers Windows). 3 Ouvrez un navigateur et allez sur la page support.illumina.com/share_desktop.html. La boîte de dialogue Share Your Desk (Partage de bureau) s ouvre. 4 Appelez l assistance technique d Illumina pour obtenir un code d accès unique. 5 Saisissez votre code d accès unique dans le champ Access Code (Code d accès). Figure 26 Champ du code d accès pour partager votre bureau 6 Cliquez sur Continue (Continuer). La session de partage d écran commence. 7 Pour terminer la session de partage d écran, sélectionnez Home (Accueil). 48 Nº rév. I FRA

59 Résoudre les erreurs de vérification automatique En cas d erreurs au cours de la vérification automatique, effectuez les actions recommandées suivantes afin de résoudre ces erreurs. Si une vérification avant analyse échoue, la RFID de la cartouche de réactifs n est pas verrouillée et peut être utilisée pour une nouvelle analyse. Cependant, la RFID est verrouillée une fois que les opercules en aluminium sont percés. Vérifications du système Doors Closed (Portes fermées) Consumables Loaded (Consommables chargés) Required Software (Logiciel requis) Instrument Disk Space (Espace disque de l instrument) Action recommandée Assurez-vous que les portes des compartiments sont fermées. Les capteurs des consommables n enregistrent rien. Assurezvous que chaque consommable est correctement chargé. Sur les écrans de configuration de l analyse, sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l étape de chargement et recommencez la configuration de l analyse. Des composants essentiels du logiciel manquent. Effectuez une mise à jour manuelle pour restaurer tous les composants du logiciel. Le disque dur de l instrument n a pas assez d espace libre pour réaliser l analyse. Il est possible que les données provenant d une analyse précédente n aient pas été transférées. Effacez les données de l analyse du disque dur de l instrument. Résoudre les erreurs de vérification Network Connection (Connexion réseau) Network Disk Space (Espace disque réseau) La connexion réseau a été interrompue. Vérifiez l état du réseau et la connexion réseau matérielle. Le compte BaseSpace ou le serveur réseau sont pleins. Temperature (Température) Temperature (Température) Temperature Sensors (Capteurs de température) Fans (Ventilateurs) Action recommandée Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Imaging System (Système d imagerie) Imaging Limits (Limites de l imagerie) Z Steps-and-Settle (Étapes et installation Z) Action recommandée Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Guide du système NextSeq

60 Dépannage Imaging System (Système d imagerie) Bit Error Rate (Taux d erreur binaire) Flow Cell Registration (Enregistrement de la Flow Cell) Action recommandée Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Il est possible que la Flow Cell ne soit pas correctement positionnée. Sur les écrans Run Setup (Configuration de l analyse), sélectionnez Back (Retour) pour retourner à l étape de la Flow Cell. La porte du compartiment d imagerie s ouvre. Déchargez et rechargez la Flow Cell pour vous assurer qu elle est correctement positionnée. Reagent Delivery (Distribution des réactifs) Valve Response (Réponse de la vanne) Pump (Pompe) Buffer Mechanism (Mécanisme du tampon) Spent Reagents Empty (Réactifs usagés vides) Action recommandée Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Communiquez avec l assistance technique d Illumina. Videz le réservoir de réactifs usagés et puis replacez le réservoir vide dans l instrument. 50 Nº rév. I FRA

61 Le réservoir des réactifs usagés est plein Commencez toujours une analyse avec un réservoir de réactifs usagés vide. Si vous commencez une analyse sans vider le réservoir des réactifs usagés, les capteurs du système indiquent au logiciel de suspendre l analyse lorsque le réservoir est plein. Les capteurs du système ne peuvent pas suspendre une analyse au cours de la génération d amplifiats, d une resynthèse à lectures appariées ou d un lavage automatique après analyse. Lorsque l analyse est suspendue, une boîte de dialogue s ouvre : elle propose des options permettant de soulever les dispositifs d aspiration et de vider le réservoir plein. Vider le réservoir des réactifs usagés 1 Sélectionnez Raise Sippers (Soulever les dispositifs d aspiration). 2 Retirez le réservoir des réactifs usagés et jetez le contenu de manière appropriée. 3 Replacez le réservoir vide dans le compartiment du tampon. 4 Sélectionnez Continue (Continuer). L analyse reprend automatiquement. Le réservoir des réactifs usagés est plein Guide du système NextSeq

62 Dépannage Flux de réhybridation Une analyse de réhybridation peut être nécessaire si les données métriques générées au cours des quelques premiers cycles montrent des intensités inférieures à Certaines librairies à faible diversité peuvent montrer des intensités inférieures à 1 000, ce qui est attendu et ne peut pas être résolu par une réhybridation. REMARQUE L utilisation de la commande End Run (Terminer l analyse) est définitive. L analyse ne peut pas reprendre, les consommables ne peuvent pas être réutilisés et les données de séquençage de l analyse ne sont pas enregistrées. Lorsque vous mettez fin à une analyse, le logiciel effectue les étapes suivantes avant la fin de l analyse : } Il place la Flow Cell en état de sécurité. } Il déverrouille la RFID de la Flow Cell pour une future analyse. } Il attribue une date d expiration de réhybridation à la Flow Cell. } Il écrit les journaux de l analyse pour les cycles terminés. Un délai est normal. } Il ignore le lavage automatique après analyse. Lorsque vous démarrez une analyse de réhybridation, le logiciel effectue les étapes d analyse suivantes : } Il crée un dossier d analyse basé sur le nom unique de l analyse. } Il vérifie que la date de réhybridation de la Flow Cell n est pas arrivée à expiration. } Il amorce les réactifs. Un délai est normal. } Il ignore l étape de génération d amplifiats. } Il retire le primer de lecture 1 précédent. } Il hybride un nouveau primer de lecture 1. } Il continue la lecture 1 et le reste de l analyse selon les paramètres de l analyse spécifiés. À quel moment arrêter une analyse pour réhybridation Une réhybridation ultérieure n est possible que si vous arrêtez l analyse aux moments suivants : } Après le cycle 5 : les intensités apparaissent après l enregistrement du modèle, qui nécessite les 5 premiers cycles du séquençage. Bien qu il soit sûr d arrêter l analyse après le cycle 1, il est recommandé d attendre la fin du cycle 5. N arrêtez pas une analyse au cours de la génération d amplifiats. } Lecture 1 ou lecture d index 1 : arrêtez l analyse avant que ne commence la resynthèse appariée. La Flow Cell ne peut pas être enregistrée pour une réhybridation ultérieure après le début de la resynthèse appariée. Consommables requis Une analyse de réhybridation nécessite une nouvelle cartouche de réactifs et une nouvelle cartouche de tampon NextSeq, quel que soit le moment où l analyse a été arrêtée. Arrêter l analyse en cours 1 Sélectionnez End Run (Arrêter l analyse). Lorsque vous êtes invité à confirmer la commande, sélectionnez Yes (Oui). 52 Nº rév. I FRA

63 2 Lorsque vous êtes invité à enregistrer la Flow Cell, sélectionnez Yes (Oui). Notez la date d expiration pour la réhybridation. 3 Retirez la Flow Cell enregistrée et placez-la à une température comprise entre 2 C et 8 C jusqu à ce que vous soyez prêt à configurer l analyse de réhybridation. Effectuer un lavage manuel REMARQUE Vous pouvez stocker la Flow Cell jusqu à 7 jours à une température comprise entre 2 C et 8 C dans un étui de protection à rabat en plastique sans l emballage dessiccatif. Pour de meilleurs résultats, réhybridez la Flow Cell enregistrée sous trois jours. 1 Sur l écran d accueil, sélectionnez Perform Wash (Procéder au lavage). 2 Sur l écran Wash Selection (Sélection du lavage), sélectionnez Manual Post-Run Wash (Lavage manuel après analyse). Consultez la section Effectuer un lavage manuel à la page 39. REMARQUE Si vous n avez pas retiré la cartouche de réactifs et la cartouche de tampon de l analyse arrêtée, vous pouvez les utiliser pour le lavage manuel. Dans le cas contraire, effectuez le lavage manuel avec la cartouche de lavage des réactifs et la cartouche de lavage du tampon. Flux de réhybridation Configurer une nouvelle analyse dans l onglet BaseSpace Prep (Préparation BaseSpace). Si l instrument est configuré pour BaseSpace ou BaseSpace Onsite, configurez une nouvelle analyse dans l onglet Prep (Préparation) en utilisant les mêmes paramètres que ceux de l analyse d origine. ASTUCE Cliquez sur l onglet Pools (Groupements), sélectionnez l ID de groupement pertinent pour conserver les paramètres de l analyse précédente, puis assignez un nom unique pour la nouvelle analyse. Configurer une analyse sur l instrument 1 Préparez une nouvelle cartouche de réactifs. 2 Si la Flow Cell enregistrée a été stockée, placez-la de façon à ce qu elle atteigne la température ambiante (15 à 30 minutes). 3 Chargez la Flow Cell enregistrée. 4 Retirez le récipient de réactifs usagés et jetez le contenu de façon appropriée, puis rechargez le récipient vide. 5 Chargez la nouvelle cartouche de tampon et la nouvelle cartouche de réactifs. 6 Sur l écran Run Setup (Configuration de l analyse), sélectionnez l une des options suivantes : BaseSpace ou BaseSpace Onsite (BaseSpace sur site) : sélectionnez l analyse et confirmez les paramètres de l analyse. Standalone (Autonome) : saisissez le nom de l analyse et spécifiez des paramètres identiques à ceux de l analyse d origine. 7 Sélectionnez Next (Suivant) pour effectuer une vérification avant analyse et démarrez l analyse. Guide du système NextSeq

64 Dépannage Formules personnalisées et dossiers de formules Ne modifiez pas les formules d origine. Enregistrez systématiquement la formule originale sous un nouveau nom. Si une formule originale est modifiée, la fonction de mise à jour du logiciel ne reconnaîtra plus la formule lors des prochaines mises à jour et les nouvelles versions ne seront pas installées. Stockez les formules personnalisées dans le dossier de formules approprié. Les dossiers de formules sont organisés comme suit : Personnalisée Élevé : formules personnalisées utilisées avec une trousse de rendement élevé. Moyen : formules personnalisées utilisées avec une trousse de rendement moyen. Élevé : formules originales utilisées avec une trousse de rendement élevé. Moyen : formules originales utilisées avec une trousse de rendement moyen. Lavage : contient la formule de lavage manuel. 54 Nº rév. I FRA

65 Vérification du système Une vérification du système n est pas nécessaire lors du fonctionnement normal ou de l entretien de l instrument. Toutefois, un représentant de l assistance technique d Illumina pourrait vous demander de réaliser une vérification du système à des fins de dépannage. REMARQUE Si un lavage de l instrument doit être effectué, effectuez le lavage avant de commencer la vérification du système. Le fait de commencer la vérification du système entraîne la fermeture automatique du logiciel de commande et le lancement du logiciel d entretien NextSeq Service Software (NSS). Le logiciel de service se lance et ouvre l écran Load (Charger), qui est configuré pour une utilisation de l option de chargement avancé. Figure 27 Vérifications du système disponibles Vérification du système Les cases non cochées sur l écran Select (Sélectionner) indiquent les tests nécessitant l assistance d un représentant de terrain Illumina. Réaliser une vérification du système 1 Depuis l écran Manage Instrument (Gérer l instrument), sélectionnez System Check (Vérification du système). Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel de commande, sélectionnez Yes (Oui). 2 Chargez les consommables comme suit : a Si une Flow Cell usagée ne se trouve pas déjà sur l instrument, chargez une Flow Cell usagée. b Videz le réservoir des réactifs usagés et repositionnez-le sur l instrument. c Chargez la cartouche de lavage du tampon contenant 120 ml d eau de laboratoire dans le réservoir central. d Chargez la cartouche de lavage des réactifs. Vérifiez que la cartouche de lavage des réactifs est vide et propre. 3 Sélectionnez Load (Charger). Le logiciel positionne la Flow Cell et la cartouche de lavage des réactifs. Sélectionnez Next (Suivant). 4 Sélectionnez Next (Suivant). La vérification du système commence. Guide du système NextSeq

66 Dépannage 5 [Facultatif] Lorsque la vérification du système est terminée, sélectionnez View (Afficher) à côté du nom de la vérification afin de visualiser les valeurs associées à chaque vérification. 6 Sélectionnez Next (Suivant). Le rapport de vérification du système s ouvre. 7 Sélectionnez Save (Enregistrer) pour enregistrer le rapport dans un fichier compressé. Naviguez vers un emplacement sur le réseau pour enregistrer le fichier. 8 Lorsque vous avez terminé, sélectionnez Exit (Quitter). 9 Lorsque vous êtes invité à fermer le logiciel d entretien et à redémarrer le logiciel de commande, sélectionnez Yes (Oui). Le logiciel de commande redémarre automatiquement. Vérifications du mouvement Vérification du système BSM FCLM et FAM Tests de la platine Description Vérifie le gain et la distance du mécanisme de conduite des compartiments (BSM) afin de confirmer que le module fonctionne correctement. Vérifie le gain et la distance du mécanisme de chargement de la Flow Cell (FCLM) et du module d automatisation des liquides (FAM) pour confirmer que les modules fonctionnent correctement. Vérifie les limites de parcours et les performances de la platine XY et des six platines Z, une pour chaque caméra. Vérification des composants optiques Vérification du système Enregistrement de la Flow Cell Description Mesure l inclinaison de la lame sur un plan optique, teste les fonctionnalités de la caméra, teste le module d imagerie et vérifie l enregistrement de la Flow Cell dans la position correcte d imagerie. Vérifications de la fluidique Vérification du système Réponse de la vanne Chute de pression Débit Description Vérifie la précision des mouvements de la vanne et de la pompe ainsi que l amplitude de mouvement de la seringue de la pompe. Vérifie le taux de fuite d un système fluidique étanche, afin de confirmer que la Flow Cell est insérée correctement en position de séquençage. Vérifie la fonctionnalité des capteurs de bulles, qui servent à détecter la présence d air dans les lignes de réactifs. Mesure les débits pour vérifier la présence d occlusions ou de fuites. 56 Nº rév. I FRA

67 Vérifications thermiques Vérification du système Ventilateurs Sondes thermiques Description Vérifie la vitesse des ventilateurs du système en impulsions par minute (imp/min) pour confirmer que les ventilateurs fonctionnent. Les ventilateurs qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative. Vérifie la température moyenne de chaque capteur thermique. Les capteurs thermiques qui ne fonctionnent pas renvoient une valeur négative. Vérification du système Guide du système NextSeq

68 Dépannage Message d erreur RAID L ordinateur du NextSeq est équipé de deux disques durs. Si un disque dur cesse de fonctionner, le système génère un message d erreur RAID et vous suggère de prendre contact avec l assistance technique d Illumina. Le remplacement du disque dur est généralement nécessaire. Vous pouvez continuer la procédure de configuration d analyse et les opérations normales. Le but de ce message est de pouvoir planifier à l avance une visite de service pour éviter des interruptions durant le fonctionnement normal de l instrument. Pour continuer, sélectionnez Acknowledge (Accuser réception), puis Close (Fermer). 58 Nº rév. I FRA

69 Annexe A Real-Time Analysis Real-Time Analysis Introduction 60 Présentation de RTA v2 61 Flux de travail de l analyse temps réel 63 Fichiers de sortie de séquençage 66 Plaques de la Flow Cell 68 Structure des dossiers de sortie 71 Annexe A Guide du système NextSeq

70 Real-Time Analysis Introduction Le logiciel Real-Time Analysis intégré effectue l analyse des données, dont l analyse des images et la définition des bases, en temps réel, à partir de l instrument; il effectue cette opération pendant l analyse de séquençage, ce qui permet d économiser un temps d analyse précieux en aval. Le NextSeq utilise une nouvelle version du logiciel Real-Time Analysis (RTA) appelée RTA v2, qui comprend d importantes différences d architecture et de fonctionnalités. RTA v2 introduit les différences suivantes : } Tous les processus sont exécutés en mémoire pour maximiser la vitesse de traitement. } Les fichiers de configuration, les formats de fichier de sortie et le flux de travail du traitement diffèrent de ceux des précédentes versions de RTA. } Les paramètres du fichier de configuration utilisés avec les précédentes versions de RTA ne sont pas compatibles avec RTA v2. } Si le traitement est arrêté, RTA v2 ne peut pas continuer ou reprendre le traitement. Il est impossible de redémarrer le logiciel durant une analyse de séquençage. 60 Nº rév. I FRA

71 Présentation de RTA v2 RTA v2 fonctionne sur l ordinateur de l instrument et effectue des analyses durant le processus. RTA v2 extrait les intensités des images, réalise la définition des bases et attribue un score de qualité à chaque définition. Contrairement aux versions antérieures de RTA, RTA v2 et NextSeq Control Software (NCS) communiquent par le biais d une interface Web HTTP et de fichiers mémoire partagés. RTA v2 stocke en mémoire tous les renseignements sur le traitement, afin d accélérer le traitement autant que possible. Le traitement ayant lieu dans la mémoire, RTA v2 ne peut pas être redémarré après l arrêt d une analyse. Entrées de RTA v2 RTA v2 nécessite les données d entrées suivantes pour fonctionner : } Les images des plaques contenues dans la mémoire locale du système. } RunInfo.xml, qui est généré automatiquement au début de l analyse, fournit le nom de l analyse et le nombre de cycles, vérifie si une lecture est indexée et lit le nombre de plaques sur la Flow Cell. } RTA.exe.config, qui est un fichier de configuration logicielle au format XML. RTA v2 reçoit des instructions du logiciel de commande, qui lui indique l emplacement du fichier RunInfo.xml et si un dossier de sortie optionnel est spécifié. Présentation de RTA v2 Fichiers de sortie RTA v2 Les images de chaque canal passent dans la mémoire sous forme de plaques. Les plaques sont de petites zones d imagerie sur la Flow Cell qui constituent pour la caméra une unité de vision. À partir de ces images, le logiciel produit des fichiers de sortie qui prennent la forme d un ensemble de fichiers d appel de base dont la qualité est notée et de fichiers de filtrage. Tous les autres fichiers supportent les fichiers de sortie. Type de fichier Fichier de définition des bases Fichier de filtrage Fichiers d emplacement des amplifiats Fichiers d index de définition des bases Description Chaque plaque analysée est incluse dans un fichier regroupant les définitions des bases (*.bcl) pour chaque ligne et chaque cycle. Le fichier cumulé de définition des bases contient la définition des bases ainsi que le score de qualité associé à chaque amplifiat dans cette ligne. Chaque plaque produit des renseignements sur le filtre qui sont rassemblés dans un fichier de filtrage (*.filter) par ligne. Le fichier de filtrage spécifie si un amplifiat a franchi les filtres. Les fichiers d emplacement des amplifiats (*.locs) contiennent les coordonnées X et Y de chaque amplifiat dans une plaque. Lors de la génération du modèle, un fichier d emplacement des amplifiats est créé pour chaque ligne. Afin de préserver les renseignements d origine sur les plaques, un fichier d index de définition des bases (*.bci) est produit pour chaque ligne. Le fichier d index contient une paire de valeurs pour chaque plaque, qui sont respectivement le numéro de cette plaque et le nombre d amplifiats qu elle contient. Les fichiers de sortie sont utilisés pour une analyse en aval dans BaseSpace. Vous pouvez aussi utiliser le logiciel de conversion bcl2fastq pour une conversion FASTQ ainsi que des Guide du système NextSeq

72 Real-Time Analysis solutions d analyse tierces. Les fichiers NextSeq nécessitent bcl2fastq v2.0 ou une version ultérieure. Pour obtenir la dernière version de bcl2fastq, consultez la page de téléchargement NextSeq sur le site web d Illumina. RTA v2 fournit des indicateurs en temps réel sur la qualité de l analyse, stockés dans des fichiers InterOp. Les fichiers InterOp sont des fichiers de sortie binaires contenant des indicateurs relatifs aux plaques, aux cycles et au niveau de lecture nécessaires pour afficher des indicateurs en temps réel en utilisant le visualiseur d analyse de séquençage (SAV). Pour la dernière version du SAV, consultez la page de téléchargement du SAV sur le site Web d Illumina. Amplifiats passant par le filtre Au cours de l analyse, RTA v2 filtre les données brutes pour supprimer les lectures non conformes au seuil de qualité des données. Les amplifiats qui se chevauchent et de mauvaise qualité sont supprimés. Dans le cas d une analyse sur deux canaux, RTA v2 utilise un système basé sur une population pour déterminer la pureté d une définition de bases. Les amplifiats franchissent le filtre (PF) lorsqu une définition des bases au cours des 25 premiers cycles a une pureté < 0,63. Les bases des amplifiats qui ne franchissent pas le filtre ne sont pas définies. Gestion des erreurs de RTA v2 RTA v2 crée des fichiers journaux et les inscrit dans le dossier RTALogs. Les erreurs sont consignées dans un fichier d erreurs au format de fichier *.tsv. Les fichiers journaux et les fichiers d erreurs suivants sont transférés vers leur emplacement final de sortie à la fin du traitement : } *GlobalLog*.tsv récapitule les événements importants survenus pendant l analyse. } *LaneNLog*.tsv répertorie les événements relatifs au traitement de chaque ligne. } *Error*.tsv répertorie les erreurs survenues au cours d une analyse. } *WarningLog*.tsv répertorie les avertissements reçus au cours d une analyse. 62 Nº rév. I FRA

73 Flux de travail de l analyse temps réel Le flux de travail de l analyse temps réel comporte les étapes suivantes : } Génération des modèles : définit les emplacements des amplifiats. } Enregistrement et extraction des intensités : aligne les emplacements des amplifiats et détermine les valeurs d intensité. } Correction empirique de la mise en phase : corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase. } Définition des bases : détermine une définition des bases pour chaque amplifiat. } Notation de la qualité : attribue un score de qualité à chaque définition des bases. Génération du modèle La première étape du flux de travail RTA est la génération du modèle, qui définit la position de chaque amplifiat dans une plaque à l aide des coordonnées X et Y. La génération du modèle nécessite les données d image des cinq premiers cycles de l analyse. Une fois le dernier cycle de modèle pour une plaque imagé, le modèle est généré. REMARQUE Pour détecter un amplifiat pendant la génération du modèle, il doit y avoir au moins une base autre que G dans les cinq premiers cycles. Pour toutes les séquences d indexage, RTA v2 nécessite au moins une base autre que G dans les deux premiers cycles. Le modèle est utilisé comme référence pour l étape suivante d enregistrement et l extraction des intensités. Les emplacements des amplifiats sur toute la Flow Cell sont écrits dans les fichiers d emplacement des amplifiats (*.locs), un pour chaque ligne. Flux de travail de l analyse temps réel Enregistrement et extraction d intensité L enregistrement et l extraction des intensités débutent après la génération du modèle. } L enregistrement aligne les images produites par chaque cycle d imagerie selon le modèle. } L extraction d intensité détermine une valeur d intensité pour chaque amplifiat du modèle pour une image donnée. S'il y a échec d enregistrement de l'image d un cycle, quelle qu'elle soit, aucune définition des bases ne sera générée pour cette plaque dans ce cycle. Utilisez le logiciel SAV (visualiseur d analyse de séquençage) pour examiner les vignettes et trouver les images dont l enregistrement a échoué. Correction de la mise en phase empirique Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d ADN dans un amplifiat s étend d une base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu un brin est déphasé par rapport au cycle d incorporation en cours. } La mise en phase se produit lorsqu un brin a un retard d'une base. } La mise en préphase se produit lorsqu un brin a une avance d'une base. Guide du système NextSeq

74 Real-Time Analysis Figure 28 A B Mise en phase et en préphase Lecture avec une base présentant une mise en phase Lecture avec une base présentant une mise en préphase RTA v2 corrige les effets des mises en phase et préphase à l aide de l algorithme de correction de la mise en phase empirique, qui optimise la pureté cumulative des données au cours de chaque cycle tout au long de l analyse. RTA v2 n applique pas de corrections aux lectures d index. Définition de bases La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d une plaque donnée d un cycle spécifique. Le NextSeq 500 utilise le séquençage à deux canaux, un rouge et un vert. Seules deux images (une par canal) sont nécessaires pour encoder les données de quatre bases d ADN. Les intensités extraites d une image et sa comparaison avec une autre image donnent quatre populations distinctes, chacune correspondant à un nucléotide. Le processus de définition des bases détermine à quelle population appartient chaque amplifiat. Figure 29 Intensité des amplifiats dans un «scatter plot» (diagramme de dispersion) Tableau 1 Base Définition des bases dans le séquençage à deux canaux Canal rouge Canal vert Result (Résultat) A 1 (allumé) C 1 (allumé) 1 (allumé) 0 (éteint) Amplifiats montrant une intensité tant dans le canal rouge que dans le canal vert. Amplifiats montrant une intensité seulement dans le canal rouge. 64 Nº rév. I FRA