Guide du système HiSeq MD 3000

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1 Guide du système HiSeq MD 3000 DESTINÉ À LA RECHERCHE UNIQUEMENT EXCLUSIF À ILLUMINA Nº Rév. A FRA Février 2015 Nº de référence SY DOC Avec Custom Protocol Selector, élaborez un document de référence personnalisé, court et inclusif à partir de votre flux de travail support.illumina.com/custom-protocol-selector.html

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3 Table des matières Table des matières iii Chapitre 1 Vue d ensemble 1 Introduction 2 Composants du système HiSeq Consommables pour le séquençage 6 Démarrer le système HiSeq Logiciel HiSeq Ressources supplémentaires 13 Chapitre 2 Réalisation d une analyse de séquençage 15 Introduction 16 Flux de travail de séquençage 17 Saisir les paramètres d analyse 18 Charger et amorcer des réactifs 22 Charger la Flow Cell de séquençage 29 Surveiller l analyse 33 Chapitre 3 Procédures après analyse 35 Introduction 36 Décharger et peser des réactifs 37 Réaliser un lavage de maintenance 38 Réaliser un lavage à l eau 41 Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie 43 Inactivité de l instrument 44 Arrêter l instrument 45 Chapitre 4 Real-Time Analysis 47 Introduction 48 Présentation de RTA v2 49 Flux de travail de l analyse temps réel 51 Fichiers de sortie de séquençage 55 Numérotation des plaques 56 Chapitre 5 Dépannage 57 Introduction 58 Problèmes possibles de configuration de l analyse 59 Réaliser une vérification de la fluidique 60 Suspendre ou arrêter une analyse 61 Possible réhybridation du primer de lecture 1 63 Index 65 Assistance technique 69 Guide du système HiSeq 3000 iii

4 iv Nº Rév. A FRA

5 Chapitre 1 Vue d ensemble Vue d ensemble Introduction 2 Composants du système HiSeq Consommables pour le séquençage 6 Démarrer le système HiSeq Logiciel HiSeq Ressources supplémentaires 13 Chapitre 1 Guide du système HiSeq

6 Vue d ensemble Introduction Le système HiSeq MD associe une ingénierie innovante et la chimie SBS éprouvée pour définir de nouveaux critères en matière de débit, de simplicité et de rentabilité. Le système HiSeq 3000 est doté des fonctionnalités suivantes : } Imagerie à double surface : le système HiSeq 3000 utilise un système d épifluorescence à deux caméras et quatre capteurs avec une technologie de numérisation de pointe pour permettre une imagerie à double surface. } Flow Cell modélisée : le système HiSeq 3000 utilise une Flow Cell modélisée qui permet de générer des amplifiats de séquençage dans un arrangement ordonné, ce qui améliore les lectures de sortie et les données générées. } Réfrigérant pour réactifs haute capacité : le compartiment de réactifs est un réfrigérant haute capacité qui contient suffisamment de réactifs pour la réalisation de toute l analyse de séquençage. } Fluidique intégrée pour les analyses à lectures appariées : la fluidique appariée intégrée fournit des réactifs à partir du compartiment de réactifs vers la Flow Cell pour la resynthèse de la lecture 2 et le séquençage indexé. } Options de contrôle de l interface : l interface logicielle de l instrument vous permet de configurer une analyse et d utiliser l instrument à l aide de l écran tactile ou du clavier intégré. } Définition des bases en temps réel : le logiciel de l instrument extrait les intensités des images et réalise la définition des bases par score de qualité sur l ordinateur de l instrument, ce qui permet de surveiller les indicateurs de qualité au cours de l analyse et d économiser du temps durant l analyse ultérieure des données. L analyse en aval des données de séquençage peut être effectuée avec le logiciel d analyse d Illumina ou avec un logiciel tiers sur une infrastructure personnalisée. } Connectivité à BaseSpace : le système HiSeq 3000 intègre une option d'envoi en temps réel des données sur la santé et le séquençage recueillies par l instrument à la solution de génomique en nuage BaseSpace, en vue de simplifier l analyse et le contrôle qualité de l instrument. 2 Nº Rév. A FRA

7 Composants du système HiSeq 3000 Le système HiSeq 3000 comprend l instrument, l écran, l ordinateur de contrôle de l instrument et les accessoires, comme le clavier, la souris et le lecteur de code à barres. L instrument compte quatre compartiments principaux : le module optique, le compartiment de Flow Cell, le compartiment fluidique et le compartiment de réactifs. L état de fonctionnement de l instrument est indiqué dans une barre d état illuminée. Figure 1 A B C D E Composants externes Module optique : contient les composants optiques qui permettent l imagerie à double surface de la Flow Cell et l imagerie simultanée de A, C, G et T à l'aide de l épifluorescence. Le faisceau laser d excitation passe à travers l objectif et la fluorescence est recueillie à travers le même objectif. Compartiment de la Flow Cell : contient la platine de la Flow Cell commandée par dépression, qui maintient la Flow Cell en place pendant les analyses de séquençage. Compartiment fluidique : contient les pompes fluidiques qui envoient les réactifs à la Flow Cell, puis au conteneur de déchets. Barre d état : indique l état de l instrument à l aide de trois couleurs. Le bleu indique que l instrument effectue une analyse, l orange qu il nécessite une surveillance et le vert, qu il est prêt à commencer l analyse suivante. Compartiment des réactifs : contient les supports des réactifs requis pour les analyses de séquençage et la solution de lavage pour les lavages de l instrument. Composants du système HiSeq 3000 Compartiment des réactifs Le compartiment de réactifs est un réfrigérant pour réactifs haute capacité qui contient deux supports de réactifs : un pour les réactifs SBS et un pour les réactifs d indexage et appariés. Les poignées du dispositif d aspiration abaissent les dispositifs d aspiration dans les flacons de réactif. } Support de réactifs SBS : situé en position centrale, à droite du support apparié. Il contient des flacons coniques de 250 ml. Les positions numérotées correspondent aux connexions sur une valve sélectrice de réactifs interne. } Support de réactifs d indexage et appariés : situé dans la position de gauche. Il comporte une rangée de positions numérotées dans laquelle se trouvent des flacons coniques de 15 ml contenant les réactifs appariés et d indexage. } Réfrigérant pour réactifs : le réfrigérant pour réactifs accueille les supports de réactifs et se maintient à une température interne de 2 C à 8 C. Guide du système HiSeq

8 Vue d ensemble Figure 2 Compartiment des réactifs A B C Poignées du dispositif d aspiration Support de réactif pour les réactifs d indexage et appariés Support de réactifs pour les réactifs SBS Compartiment de Flow Cell Le compartiment de Flow Cell contient la platine de Flow Cell, la station thermique, le système de décompression et les connexions fluidiques menant à la Flow Cell. Figure 3 Platine de Flow Cell A B Flow Cell Levier de Flow cell La Flow Cell est positionnée sur la platine de Flow Cell, qui entre et ressort du champ d action du module optique. Les ports d entrée et de sortie de la Flow Cell sont orientés vers le bas et maintenus par un vide sur le portoir de Flow Cell. Le levier de Flow Cell éclairé en face du portoir de Flow Cell contrôle la décompression. Le voyant du levier de Flow Cell devient vert lorsque le joint de décompression est hermétique. 4 Nº Rév. A FRA

9 Flow Cell modélisée La Flow Cell utilisée sur le système HiSeq 3000 est une Flow Cell modélisée comportant des milliers de nano-puits ordonnés. Les puits sont intégrés au verre de la Flow Cell et permettent de générer des amplifiats de séquençage dans un arrangement ordonné. Les amplifiats sont alignés de manière groupée, ce qui permet d améliorer le nombre de lectures de sortie ainsi que la quantité de données générées. La Flow Cell modélisée contient huit rainures et deux témoins par rainure, et elle possède les mêmes dimensions générales qu une Flow Cell HiSeq à débit élevé. La Flow Cell modélisée est fournie dans la HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit et livrée sèche dans un emballage d aluminium. Dans l emballage d aluminium, la Flow Cell est conditionnée dans un étui de protection à rabat en plastique. Figure 4 Exemple d amplifiats sur une Flow Cell modélisée Composants du système HiSeq 3000 Guide du système HiSeq

10 Vue d ensemble Consommables pour le séquençage Le séquençage sur le système HiSeq 3000 nécessite des réactifs et d autres consommables fournis dans des trousses Illumina. Consommables fournis par l utilisateur Consommable Fournisseur Utilisation Lingettes imbibées d alcool isopropylique à 70 % ou d éthanol à 70 % Bonbonne, au moins 6 litres VWR, nº de référence Fournisseur de laboratoire général Nettoyage de la Flow Cell et de la platine de Flow Cell. Fournisseur de laboratoire général Préparation de la solution de lavage de maintenance. Tubes de centrifugeuse, 250 ml Corning, nº de référence Lavage de maintenance et lavage à l eau de l instrument. Tubes coniques, 15 ml Corning, nº de référence Collecte et mesure des volumes de déchets. Lavage de maintenance et lavage à l eau de l instrument. Tubes coniques, 50 ml, autonomes (en option) Gants jetables, sans talc Tissu de laboratoire peu pelucheux Papier optique, 10,1 15,2 cm (4 6 po) Extrémités de pipettes, 200 µl Corning, nº de référence Fournisseur de laboratoire général VWR, nº de référence VWR, nº de référence Stockage des Flow Cells. Utilisation générale. Nettoyage du portoir de Flow Cell. Nettoyage de la Flow Cell. Fournisseur de laboratoire général Fractionnement des volumes de réactifs. Extrémités de pipettes, µl Fournisseur de laboratoire général Fractionnement des volumes de réactifs. ProClin 300, 50 ml Sigma-Aldrich, nº de référence U Lavage de maintenance de l instrument. Tween 20, liquide visqueux, 100 ml Sigma-Aldrich, nº de référence P7949 Lavage de maintenance de l instrument. Brucelles en plastique à bout carré McMaster-Carr, nº de référence 7003A22 Retrait des joints de la Flow Cell. Eau de laboratoire, 18 M Ohm Millipore Supports de réactifs SBS et PE, positions contenant du PW1. Lavage de l instrument. 6 Nº Rév. A FRA

11 Démarrer le système HiSeq Démarrez l ordinateur de contrôle de l instrument. 2 Connectez-vous au système d exploitation à l aide du nom d utilisateur et du mot de passe par défaut. Nom d utilisateur : sbsuser Mot de passe : sbs123 Patientez jusqu à ce qu il soit chargé. Si les valeurs par défaut ne fonctionnent pas, consultez l administrateur de votre installation pour connaître le nom d utilisateur et le mot de passe spécifiques de votre site. 3 Mettez l interrupteur principal sur la position ON (activé). Lorsque vous êtes face à l instrument, l interrupteur se situe du côté gauche. 4 Attendez au moins une minute que les dispositifs de l instrument soient correctement configurés et que le lecteur de l instrument appelé DoNotEject (Ne pas éjecter) s initialise. Une fenêtre s ouvre lorsque le disque est initialisé. Fermez la fenêtre. Si la fenêtre ne s ouvre pas, regardez dans Poste de travail pour trouver le lecteur DoNotEject (Ne pas éjecter). REMARQUE N éjectez jamais le lecteur flash DoNotEject (Ne pas éjecter) situé à l intérieur du châssis de l instrument et ne modifiez jamais les fichiers qu il contient. Ce lecteur contient des fichiers de configuration du matériel et s initialise à chaque mise sous tension de l instrument. 5 Pour assurer un espace disque adéquat, archivez sur un emplacement réseau les données issues des analyses précédentes présentes sur l ordinateur de l instrument. 6 Ouvrez le HiSeq Control Software (HCS) en utilisant l icône de raccourci située sur le bureau de l ordinateur. L initialisation du logiciel de commande prend quelques minutes. Lorsque le logiciel est initialisé, l écran de bienvenue s affiche et l icône d initialisation apparaît dans le coin inférieur droit de l écran. Démarrer le système HiSeq 3000 Meilleures pratiques pour l utilisation de l instrument et de l ordinateur de commande } Ne mettez pas l ordinateur sous tension lorsque l instrument est en marche. Mettez toujours l ordinateur sous tension avant d allumer l instrument. } Ne mettez pas l instrument hors tension lorsque le logiciel de commande de l instrument est en marche. } Attendez une minute après avoir éteint l instrument avant de le remettre en marche. } Branchez les câbles USB de l instrument, du moniteur et du clavier à l arrière de l ordinateur avant de mettre ce dernier sous tension. } Branchez le lecteur de codes à barres et la souris aux ports USB situés à l avant de l ordinateur. Guide du système HiSeq

12 Vue d ensemble Logiciel HiSeq 3000 Trois applications logicielles sont installées sur l ordinateur de l instrument : } Logiciel de commande HiSeq 3000 : l interface du HiSeq Control Software (HCS) vous guide tout au long des étapes de configuration d une analyse de séquençage. Au cours de l analyse, le logiciel de commande exploite le matériel de l instrument, contrôle la fluidique, définit les températures et présente un récapitulatif visuel des statistiques de qualité. } Logiciel Real-Time Analysis : intégré au le logiciel de commande, Real-Time Analysis (RTA) effectue la définition de base et associe un score de qualité à chaque base pour chaque cycle. Pour en savoir plus, consultez la section Real-Time Analysis à la page 47. } Logiciel Sequencing Analysis Viewer : le logiciel Sequencing Analysis Viewer (SAV) fournit des statistiques détaillées de qualité. Interface du logiciel de commande du système HiSeq 3000 L écran de bienvenue fournit des commandes pour démarrer une analyse de séquençage, laver l instrument et effectuer une vérification du système. Lorsqu une analyse est terminée, le logiciel vous invite à démarrer le lavage de l instrument. Une fois le lavage terminé, le logiciel revient à l écran de bienvenue. Figure 5 Écran de bienvenue A B C Bouton de menu de l écran de bienvenue Panneau de l interface principale Indicateurs d activité Commandes de l écran de bienvenue L écran de bienvenue comprend les commandes Séquençage, Lavage et Vérification. } Sequence (Séquençage) : sélectionnez Sequence (Séquençage) pour procéder à la configuration d une nouvelle analyse de séquençage. Figure 6 Options de la commande Sequence (Séquençage) 8 Nº Rév. A FRA

13 } Wash (Lavage) : sélectionnez Wash (Lavage) pour lancer un lavage à l eau ou un lavage de maintenance de l instrument. Figure 7 Options de la commande Wash (Lavage) Water Wash (Lavage à l eau) : le lavage à l eau envoie de l eau dans le système afin de le rincer. Un lavage à l eau est requis si l instrument n a pas été utilisé pendant au moins un jour. Un lavage à l eau constitue une option après une analyse de séquençage. Consultez la section Réaliser un lavage à l eau à la page 41. Maintenance Wash (Lavage de maintenance) : le lavage de maintenance envoie du Tween 20 et du ProClin 300 dans le système pour le rincer. Ce lavage est requis tous les 10 jours et est recommandé après une analyse de séquençage. Consultez la section Réaliser un lavage de maintenance à la page 38. } Check (Vérification) : sélectionnez Check (Vérification) pour ouvrir l écran de vérification de la fluidique et vous assurer que le flux est correct lors de l installation de l instrument ou du dépannage de la fluidique. Logiciel HiSeq 3000 Indicateurs d activité et de capteurs L écran de bienvenue contient une série d icônes situées en bas à droite qui indiquent l activité de l instrument et l état de composants spécifiques selon les capteurs de l instrument. Figure 8 Indicateurs d activité De gauche à droite, les indicateurs d activité représentent les moteurs X, Y et Z, la fonctionnalité de l électronique, la caméra, le système fluidique et les fonctions de traitement. Figure 9 Indicateurs de capteurs De gauche à droite, les indicateurs de capteur représentent la température de la Flow Cell A, la température du réfrigérant pour réactifs, l état du nuage BaseSpace et la température de la Flow Cell B. Guide du système HiSeq

14 Vue d ensemble Icônes d état Une icône d état située dans le coin supérieur droit de chaque écran présente les changements de conditions, les erreurs ou les avertissements lors des étapes de configuration de l analyse et lors de l analyse. Icône d état Nom de l état État correct Information Description Aucun changement. Le système est normal. À titre d information. Aucune action n est requise. Attention Information qui nécessite peut-être votre attention. Avertissement Erreur Les avertissements n interrompent pas une analyse, mais ils requièrent peut-être une intervention avant de continuer. En règle générale, les erreurs interrompent l analyse et requièrent une intervention avant de poursuivre l analyse. Lorsqu un changement de condition se produit, l icône associée clignote afin de vous alerter. Pour résoudre l alerte, sélectionnez l icône afin d ouvrir la boîte de dialogue d état, qui contient une description générale du problème. Sélectionnez Acknowledge (Accusé de réception) pour accepter le message et Close (Fermer) pour fermer la boîte de dialogue. Menu de l écran de bienvenue Le bouton de menu de l écran de bienvenue, situé en haut à gauche de l écran de bienvenue, fournit les options suivantes : } View (Affichage) : fournit des options permettant d afficher l interface en plein écran ou dans une fenêtre, ou de réduire l interface. } Tools (Outils) : permet d accéder à la fenêtre Options et à l option Show Log file (Afficher le fichier journal) : Options (Options) : dans la fenêtre Options (Options), définissez les paramètres d analyse par défaut. Consultez la section Fenêtre Options du menu. Show Log File (Afficher le fichier journal) : répertorie toutes les erreurs qui se produisent dans le logiciel de commande. Utilisez ce fichier journal à des fins de dépannage. } Scanner : active la commande servant à initialiser manuellement le logiciel. } About (À propos) : fournit des renseignements sur le matériel de l instrument, les versions de logiciels et les coordonnées de l assistance technique. } Exit (Quitter) : ferme l interface du logiciel de commande. Fenêtre Options du menu La fenêtre Options du menu fournit des paramètres pour définir le modèle d identifiant d analyse, les emplacements de dossiers par défaut, un serveur LIMS, le nom et le mot de passe de l utilisateur, et si des renseignements sur l état de l instrument doivent être envoyés à Illumina. 10 Nº Rév. A FRA

15 Figure 10 Fenêtre Options du menu } Run ID Template (Modèle d identifiant d analyse) : le modèle de nom utilisé pour nommer les dossiers d analyse. } Default Output Folder (Dossier de sortie par défaut) : dossier de sortie par défaut. REMARQUE Illumina recommande un emplacement réseau pour les dossiers de sortie. Vous pouvez toutefois indiquer un emplacement sur le lecteur O:\, à condition que l emplacement ne soit pas le même que celui du dossier HiSeq Temp. N utilisez pas le lecteur S:\; il est réservé au fonctionnement de l instrument. } Default Temp Folder1 (Dossier temporaire par défaut 1) : emplacement pour l écriture des fichiers temporaires pendant une analyse. Le dossier HiSeq Temp est écrit sur le lecteur O:\. } Run Setup Folder (Dossier de configuration de l analyse) : emplacement des formulaires d échantillon LIMS. } LIMS Server (Serveur LIMS) : nom du serveur pour les interactions avec le système Illumina LIMS pris en charge. } LIMS User Name (Nom d utilisateur LIMS) : nom d utilisateur utilisé lors de l authentification sur Illumina LIMS. } LIMS Password (Mot de passe LIMS) : mot de passe utilisé lors de l authentification sur Illumina LIMS. } Send instrument health information to Illumina to aid technical support (Envoyer les renseignements de l état de l instrument pour faciliter l assistance technique) : autorise l instrument à envoyer des renseignements à BaseSpace pour chaque analyse. Tous les renseignements restent confidentiels. Illumina recommande l activation de cette fonctionnalité. Logiciel HiSeq 3000 Options de suspension et d abandon dans HiSeq 3000 Les options permettant de suspendre ou d abandonner une analyse sur le système HiSeq 3000 sont différentes de celles de certains autres instruments HiSeq. Si vous choisissez d arrêter une analyse, vous n aurez pas la possibilité de reprendre l analyse. Pour plus de renseignements, consultez la section Suspendre ou arrêter une analyse à la page 61. Espace disponible sur le disque Au début de l analyse, le logiciel contrôle l espace disque disponible sur le lecteur O:\ local (lecteur de sortie). Avant qu une analyse puisse commencer, au moins 2 To doivent être disponibles. Guide du système HiSeq

16 Vue d ensemble Si l espace disque descend sous le seuil de sécurité en cours d analyse, le logiciel interrompt l analyse et met la Flow Cell en état de sécurité. L analyse reprend automatiquement lorsqu un espace disque suffisant est disponible. Illumina recommande un formatage rapide du lecteur O:\ après l achèvement d une analyse pour nettoyer le lecteur en vue d une analyse ultérieure. Pour plus de renseignements, consultez la section Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie à la page 43. Présentation de la feuille d échantillons La feuille d échantillons est un fichier au format *.csv généré par l utilisateur et qui contient des renseignements sur l analyse de séquençage. Lorsque l analyse commence, le logiciel copie la feuille d échantillons dans le dossier d analyse, où elle sera utilisée par la suite pour l analyse. Les feuilles d échantillons sont facultatives, sauf si vous utilisez BaseSpace pour effectuer l analyse des données. Utilisez Illumina Experiment Manager (IEM) pour créer une feuille d échantillons avant de lancer l analyse. 12 Nº Rév. A FRA

17 Ressources supplémentaires Les documents suivants sont disponibles en téléchargement sur le site Web d Illumina. Ressource Guide de préparation du site pour les systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence _ FRA) Guide de sécurité et de conformité des systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence _ FRA) Fichier de rapport de laboratoire HiSeq 3000 (référence ) Guide de référence des trousses d amplifiats HiSeq 3000/4000 (référence ) Description Fournit les spécifications relatives à l espace du laboratoire, les exigences électriques et les considérations environnementales. Fournit des renseignements concernant l étiquetage de l instrument, les certifications de conformité et les questions de sécurité. Fournit un enregistrement interactif des types d analyse, des numéros de lot de réactifs, des poids des réactifs et des volumes distribués pour une analyse à Flow Cell double ou simple. Fournit une description des contenus des trousses d amplifiats ainsi que des instructions pour la préparation des consommables avant de commencer l analyse de séquençage. Ressources supplémentaires Guide de référence des trousses SBS HiSeq 3000/4000 (référence ) Fournit une description des contenus des trousses SBS ainsi que des instructions pour la préparation des consommables avant de commencer l analyse de séquençage. Consultez la page d assistance du système HiSeq 3000 sur le site Web d Illumina pour accéder à la documentation, aux téléchargements de logiciels, à la formation en ligne et aux foires aux questions. Guide du système HiSeq

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19 Chapitre 2 Réalisation d une analyse de séquençage Réalisation d une analyse de séquençage Introduction 16 Flux de travail de séquençage 17 Saisir les paramètres d analyse 18 Charger et amorcer des réactifs 22 Charger la Flow Cell de séquençage 29 Surveiller l analyse 33 Chapitre 2 Guide du système HiSeq

20 Réalisation d une analyse de séquençage Introduction Pour effectuer une analyse sur le HiSeq 3000, préparez tous les réactifs, puis suivez les indications du logiciel pour configurer l analyse. Les étapes de configuration de l analyse consistent à entrer les paramètres de l analyse, charger et effectuer l amorçage des réactifs, charger la Flow Cell et procéder à une vérification de la fluidique. Consultez la page des spécifications du système HiSeq 3000 sur le site Web d Illumina pour en savoir plus sur la durée des analyses ainsi que sur les autres spécifications de performances. Consommables pour le séquençage Nom de la trousse du système HiSeq 3000 HiSeq 3000/4000 SBS Kit (300 cycles) HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) HiSeq 3000/4000 SBS Kit (50 cycles) Préparation de la Flow Cell et des réactifs Nº de référence FC FC FC Avant de configurer l analyse, préparez tous les réactifs nécessaires à celle-ci : réactifs SBS, réactifs d indexage et réactifs appariés. Lors de la configuration de l analyse, chargez tous les réactifs lorsque le logiciel vous y invite. Il n est pas nécessaire de revenir à l instrument au moment de l analyse pour charger des réactifs. Laissez la Flow Cell emballée reposer à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant de retirer l emballage en aluminium. Pour plus de renseignements, consultez les guides de préparation des réactifs suivants : } Guide de référence des trousses d amplifiats HiSeq 3000/4000 (référence ) } Guide de référence des trousses d amplifiats SBS HiSeq 3000/4000 (référence ) 16 Nº Rév. A FRA

21 Flux de travail de séquençage Préparez la Flow Cell et les réactifs en vue de l analyse. Consultez la section Préparation de la Flow Cell et des réactifs à la page 16. Saisissez les paramètres de l analyse en suivant les indications de l interface du logiciel de commande. Pesez les réactifs. Chargez les réactifs SBS pour la lecture 1 et la lecture 2, les réactifs d indexage (le cas échéant) et les réactifs appariés. Avec une Flow Cell utilisée, vérifiez que le flux est correct. Amorcez les réactifs SBS et mesurez les déchets d amorçage. Flux de travail de séquençage Chargez une Flow Cell HiSeq 3000/4000 modélisée en amplifiats et vérifiez que le débit est correct. Démarrez l analyse de séquençage. [Facultatif] Après le cycle 2, inspectez le rapport de la première base, puis continuez la lecture 1. Une fois l analyse terminée, déchargez et pesez les réactifs. Réalisez un lavage de l instrument. Guide du système HiSeq

22 Réalisation d une analyse de séquençage Saisir les paramètres d analyse Sur l écran de bienvenue, sélectionnez Sequence (Séquençage). L interface du logiciel de commande vous indique les étapes à suivre pour configurer l analyse. Les étapes de configuration de l analyse sont organisées dans trois onglets : Run Configuration (Configuration de l analyse), Pre-Run Setup (Configuration avant analyse) et Initiate Run (Lancer l analyse). } Les écrans de configuration de l analyse contiennent des listes déroulantes, des cases à cocher ou des champs de texte pour les paramètres de l analyse. Utilisez le lecteur de code à barres portatif pour balayer l identifiant de la Flow Cell ou de la trousse de réactifs, ou entrez l identifiant à l aide du clavier de l écran tactile. L icône du clavier est située à droite des champs de texte. } Sélectionnez Next (Suivant) pour passer à l écran suivant ou Back (Retour) pour revenir à l écran précédent. } À tout moment pendant les étapes de configuration de l analyse, sélectionnez Cancel (Annuler) pour abandonner la configuration de l analyse et revenir à l écran de bienvenue. Écran Storage (Stockage) 1 Sélectionnez Connect to BaseSpace pour connecter l analyse à BaseSpace. 2 Sélectionnez un paramètre pour BaseSpace : Storage and Analysis (Stockage et analyse) : envoie les données de l analyse à BaseSpace pour une surveillance à distance et une analyse secondaire. Cette option requiert une feuille d échantillons. REMARQUE Avant de sélectionner cette option, assurez-vous que votre bande passante réseau est suffisante pour envoyer des données d analyse à BaseSpace. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de préparation du site pour les systèmes HiSeq 4000 et HiSeq 3000 (référence _FRA). Run Monitoring Only (Surveillance de l analyse uniquement) : envoie uniquement les fichiers InterOp à BaseSpace, ce qui vous permet de surveiller votre analyse à distance. REMARQUE Par défaut, le logiciel compresse les fichiers de définitions de bases (BCL) et compartimente les scores de qualité, afin de réduire l espace de stockage utilisé. Le compartimentage des scores de qualité regroupe ces derniers selon un large éventail de valeurs sans que cela ait une incidence sur leur précision ou leurs performances. 3 Connectez-vous à BaseSpace avec l adresse électronique et le mot de passe de votre compte MyIllumina. 4 Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l emplacement de dossier de sortie de votre choix. Il est nécessaire de préciser un dossier de sortie même si vous utilisez BaseSpace pour le stockage et l analyse. 5 Confirmez que le réglage des miniatures est Save All Thumbnails (Enregistrer toutes les miniatures). Le logiciel enregistre automatiquement toutes les miniatures. Une miniature est un échantillon d images en provenance de nombreuses plaques dans chaque colonne de plaques, ou témoin, combinées en une seule image miniature. 18 Nº Rév. A FRA

23 6 Sélectionnez Next (Suivant). Écran Flow Cell Setup (Configuration de la Flow Cell) L écran Flow Cell Setup (Configuration de la Flow Cell) contient des renseignements sur la Flow Cell utilisée pour l analyse. Tous les champs sont obligatoires. 1 Procédez au balayage du code à barres de la Flow Cell ou saisissez l identifiant (numéro de code à barres) de la Flow Cell à séquencer. L'identifiant de la Flow Cell sert à déterminer le type de Flow Cell ainsi que la compatibilité des réactifs. 2 Vérifiez que le type de Flow Cell correspond à HiSeq 3000/4000 PE Flow Cell. Le type de Flow Cell est sélectionné automatiquement selon l identifiant de la Flow Cell. 3 Saisissez le nom de l expérience. Le nom de l expérience apparaîtra sur chaque écran pour aider à identifier l analyse en cours. 4 Saisissez un nom d utilisateur. 5 Sélectionnez Next (Suivant). Écran Advanced (Paramètres avancés) 1 [Facultatif] Cochez la case Confirm First Base (Confirmer la première base). Un rapport de la première base est généré automatiquement pour chaque analyse après le cycle 2 et placé au niveau de la racine du dossier de l analyse. En sélectionnant cette option, vous pouvez confirmer le rapport avant de procéder à l analyse. Dans le cas contraire, l analyse continue sans afficher la boîte de dialogue de confirmation. 2 [Facultatif] Sur l image de la Flow Cell, sélectionnez toutes les rainures que vous souhaitez retirer de l analyse. Toutes les rainures sont incluses par défaut. REMARQUE L alignement PhiX s exécute automatiquement pour toutes les rainures. 3 Sélectionnez Next (Suivant). Saisir les paramètres d analyse Écran Recipe (Formule) Une formule est générée automatiquement à partir des renseignements saisis dans l écran Recipe (Formule). 1 Sélectionnez l option correspondant au type d index : No Index (Sans index) : effectue une analyse à lecture appariée sans index. Single Index (Un seul index) : effectue une analyse à lecture appariée avec une lecture d indexage. Dual Index (Double index) : effectue une analyse à lecture appariée avec deux lectures d indexage et une resynthèse des paires de bases appariées. Custom (Personnalisé) : effectue une analyse à lecture appariée avec un nombre personnalisé de cycles pour les lectures d index. 2 Entrez le nombre de cycles de la lecture 1 et la lecture 2. Si vous avez sélectionné l option d indexage Custom (Personnalisé), saisissez le nombre de cycles pour chaque lecture d index. Les longueurs de lectures peuvent ne pas être identiques. 3 Vérifiez les paramètres de chimie par défaut suivants. Ces champs sont automatiquement remplis en fonction du type d index sélectionné. Guide du système HiSeq

24 Réalisation d une analyse de séquençage a b c SBS : HiSeq 3000/4000 SBS Kit (Trousse SBS HiSeq 3000/4000) : indique la chimie SBS utilisée pour la lecture 1 et la lecture 2. Index : HiSeq 3000/4000 Sequencing Primer (Primer de séquençage HiSeq 3000/4000) ou HiSeq 3000/4000 Dual Index Sequencing Primer (Primer de séquençage à index double HiSeq 3000/4000) : indique la chimie utilisée pour les lectures d index. PE turnaround (Rotation des paires de bases appariées) : HiSeq 3000/4000 PE (PE HiSeq 3000/4000) ou HiSeq 3000/4000 PE Dual Index (PE à double index HiSeq 3000/4000) : indique la chimie utilisée pour la resynthèse des paires de bases appariées. 4 Cochez la case Existing Recipe (Formule existante) pour utiliser une formule personnalisée. Dans le cas contraire, laissez le logiciel créer une formule en fonction des renseignements que vous fournissez dans les écrans de configuration de l analyse. Illumina vous recommande d utiliser l assistant de création de formules, afin de concevoir votre formule à partir des renseignements que vous saisissez dans l écran Recipe (Formule). Écran Sample Sheet (Feuille d échantillons) Les feuilles d échantillons sont facultatives, sauf si vous utilisez BaseSpace pour effectuer l analyse des données. 1 Sélectionnez Browse (Parcourir) pour sélectionner l emplacement de la feuille d échantillons. 2 Sélectionnez Next (Suivant). Écran Reagents (Réactifs) L écran Reagents (Réactifs) enregistre des renseignements sur la trousse de réactifs utilisée pour votre analyse. 1 Dans le champ Reagent Kit ID (Identifiant de la trousse de réactifs), effectuez le balayage de l identifiant de code à barres de la trousse de réactifs SBS ou saisissez-le. 2 Dans le champ PE Reagent Kit ID (Identifiant de la trousse de réactifs PE), effectuez le balayage de l identifiant de code à barres de la trousse de réactifs PE ou saisissez-le. 3 Sélectionnez la trousse de réactifs SBS à utiliser pour l analyse : Sélectionnez 300 Cycles pour une trousse de 300 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 318 par défaut. Sélectionnez 150 Cycles pour une trousse de 150 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 168 par défaut. Sélectionnez 50 Cycles pour une trousse de 50 cycles. Le nombre de cycles restants est défini sur 67 par défaut. REMARQUE Le champ Cycles Remaining (Cycles restants) est rempli automatiquement en fonction de l identifiant de la trousse de réactifs SBS. Le logiciel effectue le décompte du nombre de cycles entrés. Lorsqu il reste peu de cycles, le logiciel vous invite à charger de nouveaux réactifs. 4 Sélectionnez Prime SBS Reagents (Amorcer les réactifs SBS) pour amorcer les réactifs. Amorcez toujours les réactifs avant de charger une Flow Cell en amplifiats. 5 Sélectionnez Next (Suivant). 20 Nº Rév. A FRA

25 Écran Review (Révision) 1 Vérifiez les paramètres de l analyse sur l écran Review (révision). 2 Sélectionnez Next (Suivant) pour continuer ou Back (Retour) pour modifier les paramètres. Saisir les paramètres d analyse Guide du système HiSeq

26 Réalisation d une analyse de séquençage Charger et amorcer des réactifs Après avoir saisi les paramètres de l analyse, chargez les réactifs SBS, d indexage et appariés pour l analyse, puis amorcez les réactifs dans le système fluidique. Le logiciel vous guide dans ces étapes dans une série d écrans de l onglet Pre-Run Setup (Configuration avant analyse). Consommables fournis par Illumina } Huit bouchons verseurs Consommables fournis par l utilisateur } Flacon de 250 ml (Corning, nº de référence ) } Tubes coniques de 15 ml (Corning, nº de référence ) } Eau de laboratoire Charger les réactifs SBS REMARQUE Pour préparer le rinçage après analyse à la fin d une analyse de séquençage, chargez 25 ml de PW1 ou d eau de laboratoire dans la position 2. Le rinçage après une analyse ne remplace pas le lavage de l instrument après analyse. 1 Retournez chaque flacon plusieurs fois pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés. 2 Débouchez chaque flacon de réactif et remplacez le bouchon par un bouchon verseur. ATTENTION Après avoir manipulé le flacon de mélange de clivage HT (HCM), jetez vos gants et remplacez-les par une nouvelle paire. 3 Enregistrez le poids de chaque réactif sur le formulaire de suivi du laboratoire. REMARQUE La pesée des réactifs avant et après une analyse de séquençage confirme que les réactifs sont correctement distribués. 4 Ouvrez la porte du compartiment de réactifs. 5 Relevez les dispositifs d aspiration du support de réactifs de séquençage en procédant comme suit : a Tirez la poignée vers vous, puis levez-la. b Relâchez la poignée du dispositif d aspiration dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée du dispositif d aspiration soit bien logée dans la fente. 6 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment de réactifs. 7 Placez chaque tube de réactif sur le support, dans la position numérotée pertinente. Veillez à ce que l extrémité conique du flacon repose dans l encoche située à la base du support. 22 Nº Rév. A FRA

27 Tableau 1 Positions des réactifs SBS Position Réactif Description 1 HIM Mélange d incorporation HT 2 PW1 25 ml de PW1 ou d eau de laboratoire 3 HSM Mélange de balayage HT 4 HB1 Tampon SBS HT 1 5 HB2 Tampon SBS HT 2 6 HB2 Tampon SBS HT 2 7 HCM Mélange de clivage HT 8 HB2 Tampon SBS HT 2 8 Ajoutez 25 ml de PW1 ou d eau de laboratoire au flacon en position 2. 9 Faites glisser le support de réactifs dans le compartiment des réactifs, en alignant le support sur le guide surélevé du plancher du compartiment. 10 Abaissez les dispositifs d aspiration dans les flacons de réactif de séquençage comme suit : a Tirez la poignée du dispositif d aspiration vers vous, puis baissez-la. b Inspectez les dispositifs d aspiration pour vérifier qu ils ne se sont pas pliés une fois abaissés dans les bouchons verseurs. c Relâchez la poignée du dispositif d aspiration dans la fente située à la base de la rainure. 11 Cochez la case PW1 (25 ml) loaded (PW1 [25 ml] chargé). Charger et amorcer des réactifs Charger les réactifs d indexage et appariés 1 Retournez chaque flacon plusieurs fois pour vous assurer que les réactifs sont bien mélangés. 2 Enregistrez le poids de chaque réactif sur le formulaire de suivi de laboratoire. 3 Relevez les dispositifs d aspiration du support de réactifs apparié en procédant comme suit : a Tirez la poignée vers vous, puis levez-la. b Relâchez la poignée dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée demeure solidement dans la fente. 4 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment des réactifs, à l aide de la poignée du support. 5 Placez des tubes coniques de 15 ml contenant 10 ml de PW1 ou d eau de laboratoire dans les positions 12, 18 et 19 du support apparié. 6 Retirez les bouchons sur chacun des tubes de réactifs et placez le tube sur le support dans la position numérotée pertinente ou selon l étiquette de couleur correspondante. Tableau 2 Positions des réactifs appariées Position Réactif Description 10 HRM Mélange de resynthèse HT 11 HLM2 Mélange de linéarisation HT 2 12 PW1 10 ml de PW1 ou d eau de laboratoire Guide du système HiSeq

28 Réalisation d une analyse de séquençage Position Réactif Description 13 HAM Mélange d amplification HT 14 HPM Prémélange d amplification HT 15 HDR Mélange de dénaturation HT (contient du formamide) 16 HP11 Mélange de primer, lecture 2 17 HP14* Mélange de primers dʼindexage 18 PW1 10 ml de PW1 ou d eau de laboratoire 19 PW1 10 ml de PW1 ou d eau de laboratoire *HP14 n est nécessaire que pour les analyses indexées. Si le HP14 n est pas utilisé, chargez un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de PW1 ou d eau de laboratoire. 7 Faites glisser le support de réactifs dans le compartiment des réactifs, en alignant le support sur le guide surélevé du plancher du compartiment. 8 Abaissez les dispositifs d aspiration dans les tubes de réactifs appariés comme suit : a Tirez la poignée vers vous, puis baissez-la. b Inspectez les dispositifs d aspiration pour vérifier qu ils ne se sont pas pliés une fois abaissés dans les tubes. c Relâchez la poignée dans la fente située à la base de la rainure. 9 Sélectionnez Next (Suivant). Amorcer les réactifs Les étapes d amorçage des réactifs comprennent le nettoyage du portoir de Flow Cell, le chargement d une Flow Cell d amorçage, la vérification du flux et le lancement de l amorçage. Nettoyer le portoir de Flow Cell 1 Ouvrez la porte du compartiment de Flow Cell. ATTENTION Ne placez pas les fluides sur la porte du compartiment de Flow Cell ou sur la platine de Flow Cell quand la porte est ouverte. Renverser un produit dans cette zone peut endommager l instrument. 2 Vérifiez que le levier de Flow Cell est en position OFF (désactivé). Figure 11 Levier de Flow Cell en position 0 3 Enfilez une nouvelle paire de gants en latex sans talc. 24 Nº Rév. A FRA

29 4 Si une Flow Cell provenant d une analyse précédente est présente, retirez-la et mettez-la de côté dans un tube de tampon de stockage ou dans de l eau de laboratoire pour l empêcher de sécher. Elle peut être utilisée pour vérifier que le flux est correct avant de charger la Flow Cell en amplifiats. 5 À l aide d une lingette alcoolisée ou d un tissu non pelucheux imprégné d éthanol ou d isopropanol, essuyez soigneusement la surface du portoir de Flow Cell jusqu à ce qu elle soit propre. ATTENTION Veillez à ce que l alcool ne s écoule pas dans les trous de décompression ou autour des collecteurs. Utilisez si besoin un chiffon de laboratoire peu pelucheux pour sécher la platine. 6 Inspectez le portoir de Flow Cell pour vous assurer qu il ne contient pas de peluche et que les trous de décompression ne sont pas obstrués. Figure 12 Emplacements des trous de décompression Charger et amorcer des réactifs Charger une Flow Cell d amorçage À partir de l écran Load Priming Flow Cell (Charger la Flow Cell d amorçage), chargez une Flow Cell utilisée pour l étape d amorçage. Après avoir chargé une Flow Cell utilisée, vérifiez que la décompression est en cours. REMARQUE Illumina vous recommande d utiliser la Flow Cell d une analyse précédente pour l amorçage des réactifs en vue d une analyse ultérieure ou d un lavage de l instrument post-analyse. 1 Rincez la Flow Cell utilisée avec de l eau de laboratoire. Séchez la Flow Cell à l aide d un chiffon destiné au nettoyage des lunettes ou d un chiffon non pelucheux. 2 Nettoyez la Flow Cell à l aide de lingettes alcoolisées et d un chiffon destiné au nettoyage des lunettes. REMARQUE Ne retirez pas et ne remplacez pas les joints de la Flow Cell pendant cette étape. 3 Placez la Flow Cell utilisée sur le portoir, en orientant les ports d entrée et de sortie vers le bas et le code à barres vers la droite. Assurez-vous que la flèche qui indique le sens du flux, située sur le bord gauche de la Flow Cell, est orientée vers l instrument. 4 Faites glisser doucement la Flow Cell vers les broches de guidage supérieure et de droite jusqu à ce qu elle s enclenche. REMARQUE Retirez votre main de la Flow Cell avant d enclencher l interrupteur de décompression, afin d éviter la déviation de l alignement à terme. Guide du système HiSeq

30 Réalisation d une analyse de séquençage Figure 13 A B Flow Cell positionnée contre les broches de guidage supérieure et de droite Broche de guidage supérieure Broches de guidage de droite 5 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour engager la décompression et maintenir la Flow Cell en place. Lorsqu un voyant vert clignote sur le levier de Flow Cell, la décompression est en cours. Si le voyant du levier n est pas vert, reportezvous à la section Problèmes possibles de configuration de l analyse à la page 59. Figure 14 Levier de Flow Cell en position 1 6 Attendez environ cinq secondes, puis passez lentement le levier de Flow Cell en position 2 (extrême droite). Lorsque le levier de Flow Cell est vert et ne clignote plus, cela signifie que les collecteurs sont en place et que la Flow Cell est prête à être utilisée. Figure 15 Levier de Flow Cell en position 2 7 Assurez-vous de cocher la case Vacuum Engaged (Décompression en cours) dans l écran de chargement de la Flow Cell d amorce, puis sélectionnez Next (Suivant). 26 Nº Rév. A FRA

31 Vérifier que le flux est correct La vérification du flux permet de confirmer que la Flow Cell et les joints sont correctement installés et que le collecteur est engagé. 1 Sélectionnez la solution 2 (laboratory-grade water [eau de laboratoire]) dans la liste déroulante. ATTENTION Utilisez de l eau pour vérifier que le flux est correct sur une Flow Cell utilisée uniquement. N utilisez jamais d eau pour vérifier que le flux est correct sur une Flow Cell en amplifiats. 2 Vérifiez les valeurs par défaut suivantes : Volume : 250 Aspirate Rate (Taux d aspiration) : 250 Dispense Rate (Taux de distribution) : Sélectionnez Pump (Pompe). 4 Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les voies et de fuites à proximité des collecteurs. Si vous observez des bulles en excès, vérifiez que les joints ne sont pas obstrués, réduisez le taux d aspiration à 100 et pompez 125 µl d eau supplémentaires vers la Flow Cell. Si le problème persiste, retirez la Flow Cell, répétez les étapes de nettoyage, puis rechargez la Flow Cell. Charger et amorcer des réactifs Positionner les tubes et démarrer l amorçage 1 Retirez les huit tubes d évacuation du conteneur à déchets. Ne retirez pas les tubes de la pompe de condensation ou de la pompe d amorçage appariée. Figure 16 Positionner les tubes A Tubes d évacuation de la Flow Cell pour les positions des réactifs 1 à 8 B Tubes de pompe de condensation (ne pas retirer) C Tubes de pompe d amorçage appariée (ne pas retirer) 2 Placez chaque tube d évacuation dans un tube vide distinct de 15 ml. Les déchets d amorçage sont recueillis et mesurés après la phase d amorçage. 3 Sélectionnez Start Prime (Démarrer l amorçage). L écran d amorçage s affiche et l étape d amorçage démarre. Vous pouvez surveiller la progression de l étape d amorçage depuis l écran d amorçage. Guide du système HiSeq

32 Réalisation d une analyse de séquençage 4 Lorsque l étape d amorçage est terminée, mesurez les déchets d amorçage récupérés et confirmez que le volume de chaque tube est de 1,75 ml pour un total de 14 ml. Le total est calculé comme suit : 250 µl pour chaque position SBS, sauf pour la position 2 (250 7 = 1,75 ml) 1,75 ml pour chaque rainure (1,75 8 = 14 ml) 5 Enregistrez les résultats sur le formulaire de suivi de laboratoire. 6 Replacez le tube d évacuation dans le conteneur à déchets avant de continuer. 7 Sélectionnez Next (Suivant). 28 Nº Rév. A FRA

33 Charger la Flow Cell de séquençage Les étapes pour charger la Flow Cell en amplifiats comprennent le retrait de la Flow Cell d amorçage, le nettoyage du portoir de Flow Cell, le nettoyage de la Flow Cell, le chargement de la Flow Cell et la confirmation que le flux est correct. Consommables fournis par l utilisateur } Chiffon sec destiné au nettoyage des lunettes } Lingettes imbibées d alcool ou d éthanol à 70 % } Chiffon de laboratoire peu pelucheux } Une paire de plastistats Retirer la Flow Cell utilisée 1 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour libérer les collecteurs. Figure 17 Levier de Flow Cell en position 1 Charger la Flow Cell de séquençage 2 Passez doucement le levier de Flow Cell en position 0 pour désengager le joint de décompression et libérer la Flow Cell. Figure 18 Levier de Flow Cell en position 0 3 Soulevez la Flow Cell utilisée du portoir de Flow Cell. Nettoyer le portoir de Flow Cell 1 Enfilez une nouvelle paire de gants en latex sans talc. 2 À l aide d une lingette alcoolisée ou d un tissu non pelucheux imprégné d éthanol ou d isopropanol, essuyez soigneusement la surface du portoir de Flow Cell jusqu à ce qu elle soit propre. Guide du système HiSeq

34 Réalisation d une analyse de séquençage ATTENTION Veillez à ce que l alcool ne s écoule pas dans les trous de décompression ou autour des collecteurs. Utilisez si besoin un chiffon de laboratoire peu pelucheux pour sécher la platine. Figure 19 Inspectez les trous de décompression 3 Inspectez le portoir de Flow Cell pour vous assurer qu il ne contient pas de peluche et que les trous de décompression ne sont pas obstrués. Charger la Flow Cell de séquençage REMARQUE Ne remplacez pas les joints de collecteur. 1 Placez la Flow Cell sur le portoir, en orientant les ports d entrée et de sortie vers le bas et le code à barres vers la droite. Assurez-vous que la flèche située sur le bord gauche de la Flow Cell est orientée vers l instrument. 2 Faites glisser doucement la Flow Cell vers les broches de guidage supérieure et de droite jusqu à ce qu elle s enclenche. Figure 20 Flow Cell positionnée contre les broches de guidage supérieure et de droite A B Broche de guidage supérieure Broches de guidage de droite REMARQUE Retirez votre main de la Flow Cell avant d enclencher l interrupteur de décompression, afin d éviter la déviation de l alignement à terme. 3 Placez doucement le levier de Flow Cell en position 1 pour engager la décompression et maintenir la Flow Cell en place. Lorsqu un voyant vert clignote sur le levier de Flow Cell, la décompression est en cours. Si le voyant du levier n est pas vert, reportezvous à la section Problèmes possibles de configuration de l analyse à la page Nº Rév. A FRA

35 Figure 21 Levier de Flow Cell en position 1 4 Attendez environ 5 secondes, puis passez doucement le levier de Flow Cell en position 2. Lorsque le voyant du levier de Flow Cell est vert et ne clignote pas, les collecteurs sont en place et la Flow Cell est prête à être utilisée. Figure 22 Levier de Flow Cell en position 2 Charger la Flow Cell de séquençage 5 Assurez-vous de cocher la case Vacuum Engaged (Décompression en cours) dans l écran Load Sequencing Flow Cell (Charger la Flow Cell de séquençage). Vérifier que le flux est correct La vérification du flux permet de confirmer que la Flow Cell et les joints sont correctement installés et que le collecteur est engagé. 1 Sélectionnez la solution 5 dans la liste déroulante. 2 Vérifiez les valeurs par défaut suivantes : Volume : 250 Aspirate Rate (Taux d aspiration) : 250 Dispense Rate (Taux de distribution) : Sélectionnez Pump (Pompe). 4 Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les voies ou de fuites à proximité des collecteurs. Si des bulles d air sont présentes en trop grand nombre, vérifiez qu il n y a pas d obstruction dans les joints de collecteur, puis répétez le processus en utilisant la solution 6 pour éviter d appauvrir la position 5. Réduisez le taux d aspiration à 100, puis injectez 250 µl supplémentaires vers la Flow Cell. 5 Sélectionnez Next (Suivant). Assurez-vous que le levier de Flow Cell est vert, puis fermez la porte du compartiment de Flow Cell. 6 Vérifiez que les cases Vacuum Engaged (Décompression en cours) et Door Closed (Porte fermée) sont cochées, puis cliquez sur Next (Suivant). Guide du système HiSeq

36 Réalisation d une analyse de séquençage 7 Sélectionnez Start (Démarrer) pour lancer l analyse de séquençage. 32 Nº Rév. A FRA

37 Surveiller l analyse Surveillez les indicateurs d analyse sur l écran Run Overview (Aperçu de l analyse), y compris la fluidique et l imagerie. Figure 23 Écran Run Overview (Aperçu de l analyse) Surveiller l analyse A B C D E F Barre de progression : surveillez le nombre de cycles effectué. Image de la Flow Cell : surveillez les rainures qui ont été imagées. Graphique de la fluidique : développez la section de la fluidique pour surveiller les étapes de la chimie. Configuration de l analyse : contrôlez les paramètres de l analyse actuelle. Graphique d analyse : surveillez les scores de qualité par cycle. Graphique d images : surveillez les intensités par cycle. Une seule image miniature est affichée pour chaque témoin numérisé. Toutes les autres images n apparaissent pas dans l interface du logiciel. Rapport de la première base Si vous avez sélectionné l option Confirm First Base (Confirmer la première base) lors de la configuration de l analyse, la boîte de dialogue de confirmation de la première base s ouvre automatiquement une fois l imagerie du deuxième cycle terminée. L analyse s interrompt à cette étape. 1 Révisez le rapport de la première base dans la boîte de dialogue de confirmation. 2 Si les résultats vous conviennent, sélectionnez Continue (Continuer). Visualiseur d analyse de séquençage Le visualiseur d analyse de séquençage affiche des indicateurs de séquençage générés au cours de l analyse de séquençage. Les mesures apparaissent sous forme de tracés, de graphiques et de tableaux. Le visualiseur d analyse de séquençage s ouvre automatiquement une fois que les indicateurs d analyse sont disponibles. Sélectionnez Refresh (Actualiser) à tout moment pendant l analyse pour afficher les indicateurs métriques à jour. Pour plus de renseignements, consultez le Guide de l utilisateur du visualiseur d analyse de séquençage (référence ). Guide du système HiSeq

38 Réalisation d une analyse de séquençage Procédures après analyse Une fois l analyse terminée, déchargez et pesez les réactifs, puis effectuez un lavage de l instrument. Pour en savoir plus, reportez-vous à la section Procédures après analyse à la page Nº Rév. A FRA

39 Chapitre 3 Procédures après analyse Procédures après analyse Introduction 36 Décharger et peser des réactifs 37 Réaliser un lavage de maintenance 38 Réaliser un lavage à l eau 41 Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie 43 Inactivité de l instrument 44 Arrêter l instrument 45 Chapitre 3 Guide du système HiSeq

40 Procédures après analyse Introduction Les procédures après analyse comprennent le retrait et la pesée des réactifs, ainsi qu un lavage de l instrument. Un lavage à l eau est requis après chaque analyse, mais vous pouvez effectuer un lavage de maintenance à la place. Illumina recommande un lavage de maintenance. Les lavages réguliers de l instrument assurent des performances continues de la manière suivante : } Rinçage de tous les résidus de réactif et d échantillon des tubes fluidiques et des dispositifs d aspiration. } Prévention de l accumulation de sel et de la cristallisation dans les tubes fluidiques et les dispositifs d aspiration. } Prévention de la contamination croisée par l analyse précédente. REMARQUE Un lavage à l eau est réalisé à la fin de chaque analyse dans le but de laver le système et de vérifier la fluidique. Lors de la configuration d une analyse, le logiciel vérifie qu un lavage à l eau ou un lavage de maintenance a été effectué dans les dernières 24 heures. Un lavage de maintenance est requis tous les 10 jours. Lorsque le délai de 10 jours s est écoulé après le dernier lavage de maintenance, le logiciel vous invite à en effectuer un autre. 36 Nº Rév. A FRA

41 Décharger et peser des réactifs REMARQUE Traitez les réactifs comme des déchets chimiques. Mettez au rebut les réactifs conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. 1 Ouvrez la porte du compartiment de réactifs. 2 Relevez les dispositifs d aspiration du support de réactifs SBS et du support apparié en procédant comme suit : a Tirez la poignée du dispositif d aspiration vers l extérieur. b Soulevez la poignée du dispositif d aspiration tout en la tirant vers l extérieur. c Relâchez la poignée du dispositif d aspiration dans la fente située en haut de la rainure. Veillez à ce que la poignée du dispositif d aspiration demeure de manière sécurisée dans la fente. 3 Faites glisser le support de réactifs hors du compartiment des réactifs, à l aide de la poignée du support. 4 Retirez chaque flacon du support de réactifs et enregistrez le poids sur le formulaire de suivi de laboratoire. Consultez la page d aide de HiSeq 3000 sur le site Web d Illumina pour télécharger un formulaire de suivi de laboratoire interactif. AVERTISSEMENT Ce groupe de réactifs contient du formamide, un amide aliphatique constituant probablement une toxine reproductive. Des risques de lésions corporelles peuvent survenir par inhalation, ingestion, contact avec la peau et contact avec les yeux. Mettez au rebut les conteneurs et tout contenu inutilisé conformément aux normes de sécurité gouvernementales en vigueur dans votre région. Pour plus de renseignements, consultez la fiche signalétique de cette trousse, à votre disposition sur support.illumina.com/sds.html. Décharger et peser des réactifs Guide du système HiSeq

42 Procédures après analyse Réaliser un lavage de maintenance Le lavage de maintenance est requis tous les 10 jours, mais est facultatif après une analyse de séquençage. Illumina vous recommande d effectuer un lavage de maintenance après chaque analyse de séquençage. L écran Load Gasket (Charger le joint) s ouvre et vous invite à effectuer un lavage de maintenance tous les 10 jours. Remplacez les joints dans les collecteurs avant et arrière avant d effectuer le lavage. Un lavage de maintenance dure environ deux heures et demie et consiste à laver le système à l aide d une solution préparée de Tween 20 et de ProClin 300. Consommables fournis par l utilisateur } Lingettes imbibées d éthanol } 8 flacons de 250 ml (Corning, nº de référence ) } 10 tubes de 15 ml (Corning, nº de référence ) } Eau de laboratoire } ProClin 300 (Sigma-Aldrich, nº de référence U) } Tween 20 (Sigma-Aldrich, nº de référence P7949) Préparer la solution de lavage de maintenance Préparez 5 litres de solution de lavage de maintenance pour l utilisation sur un instrument. La solution peut être conservée jusqu à 30 jours à température ambiante et être utilisée jusqu à 3 fois pendant cette période. 1 Préparez 250 ml de Tween 20 à 10 % en combinant les volumes suivants et en ajoutant d abord l eau : Eau de laboratoire (225 ml) Tween 20 (25 ml) 2 Placez un barreau d agitateur dans une bonbonne vide ayant une contenance minimale de six litres. 3 Combinez les volumes suivants dans la bonbonne, en versant d abord l eau : Eau de laboratoire (750 ml) Tween 20 à 10 % (250 ml) ProClin 300 (1,5 ml) Ces volumes donnent environ une solution de Tween 20 à 2,5 % et une solution de ProClin 300 à 0,15 %. 4 Placez la bonbonne sur une plaque d agitation et agitez jusqu à ce que la solution soit parfaitement mélangée. 5 Ajoutez à la solution quatre litres d eau de laboratoire. Ces volumes donnent environ une solution de Tween 20 à 0,5 % et une solution de ProClin 300 à 0,03 %. 6 Continuez l agitation jusqu à ce que la solution soit parfaitement mélangée. 7 Mettez-la de côté dans un conteneur fermé et à température ambiante jusqu à ce que vous soyez prêt à remplir les tubes et les flacons de réactifs de solution de lavage ou à les réapprovisionner. 38 Nº Rév. A FRA

43 Lavages au Tween 20 et au ProClin Dans l écran de bienvenue, sélectionnez Wash Maintenance (Lavage Maintenance). 2 Si vous avez stocké la solution de lavage de maintenance d une analyse précédente, remplissez le flacon de solution de lavage et renversez-le pour le mélanger. Sinon, préparez les composants de lavage en utilisant une nouvelle solution comme suit : a Remplissez huit flacons SBS avec 250 ml de solution de lavage de maintenance. b Remplissez dix tubes PE avec 12 ml de solution de lavage de maintenance. c Attribuez à chaque flacon et à chaque tube une position du support de réactif et conservez cette position pour chaque lavage ultérieur. En cas de non-respect de cette instruction, la solution de lavage pourrait être contaminée par des réactifs présents dans les dispositifs d aspiration. 3 Chargez les flacons et les tubes sur l instrument dans leurs positions attribuées sur le support de réactif. 4 Sélectionnez Next (Suivant). 5 Retirez la Flow Cell de la platine de Flow Cell et mettez-la de côté jusqu à ce que vous soyez prêt à recharger la même Flow Cell avant de commencer le lavage. 6 Revêtez une nouvelle paire de gants, puis appliquez une légère pression sur un des côtés du joint avant jusqu à ce que l autre côté se soulève. Utilisez une petite pince pour attraper et retirer le joint. Répétez l opération pour retirer le joint arrière. Réaliser un lavage de maintenance Figure 24 Retrait des joints de collecteur usagés 7 Placez un joint neuf dans les collecteurs avant et arrière. 8 Rechargez la Flow Cell. 9 Assurez-vous de cocher la case Vacuum Engaged (Décompression en cours) dans l écran Load Wash Flow Cell (Charger la Flow Cell de lavage). 10 Sélectionnez Next (Suivant). 11 Effectuez une vérification de la fluidique : a Sélectionnez la solution 2 dans la liste déroulante. Acceptez les valeurs par défaut de la pompe. b Sélectionnez Pump (Pompe). c Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les rainures et de fuites à proximité des collecteurs. La présence d un nombre plus important de bulles est normale pour un lavage au Tween 20 et au ProClin 300 et n a aucun effet sur le volume distribué. Guide du système HiSeq

44 Procédures après analyse 12 Retirez du conteneur à déchets les huit tuyaux d évacuation correspondant à la Flow Cell. N incluez ni les huit tuyaux de la Flow Cell opposée, ni les tuyaux de la pompe de condensation. 13 Groupez les huit tuyaux d évacuation à l aide d un parafilm en veillant à ce que toutes les extrémités soient au même niveau. Placez les extrémités des tuyaux groupés dans un flacon de 250 ml. 14 Sélectionnez Next (Suivant) pour lancer le lavage. 15 Une fois le lavage terminé, sélectionnez Return to Start (Retourner au début). 16 Mesurez le volume distribué. REMARQUE Tous les flacons et tous les tubes sont remplis au maximum de leur capacité de manière à assurer un rinçage total des dispositifs d aspiration. Cependant, le volume distribué dans chaque position varie. C est pourquoi les flacons et les tubes contiennent des volumes différents lorsque le lavage est terminé. Positions Huit positions SBS Dix positions appariées Toutes les positions Volume distribué 82 ml 76 ml 19,75 ml par rainure 17 Détachez les tuyaux d évacuation et replacez-les dans le conteneur à déchets. 40 Nº Rév. A FRA

45 Réaliser un lavage à l eau Un lavage à l eau est requis après chaque analyse de séquençage. Vous pouvez également effectuer un lavage de maintenance à la place. Illumina vous recommande de réaliser un lavage de maintenance après chaque analyse. Si l instrument n a pas été utilisé pendant au moins une journée, procédez à un lavage à l eau avant de commencer une nouvelle analyse de séquençage. Consommables fournis par Illumina } Eau de laboratoire Consommables fournis par l utilisateur } 8 flacons de 250 ml (Corning, nº de référence ) } 10 tubes de 15 ml (Corning, nº de référence ) } Eau de laboratoire Réaliser un lavage à l eau Procédure 1 Dans l écran de bienvenue, sélectionnez Wash Water (Lavage Eau). 2 Sélectionnez Yes (Oui) pour laver des positions de réactifs appariés. Sinon, sélectionnez No (Non) pour laver des positions de réactifs SBS uniquement. Sélectionnez Next (Suivant) pour continuer. 3 Chargez l instrument avec de l eau de laboratoire, comme suit : a Remplissez huit flacons SBS avec 250 ml d eau de laboratoire. b Remplissez dix tubes PE avec 12 ml d eau de laboratoire. 4 Assurez-vous qu une Flow Cell utilisée est chargée. Si nécessaire, chargez une Flow Cell utilisée. Sélectionnez Next (Suivant). 5 Effectuez une vérification de la fluidique : a Sélectionnez la solution 2 dans la liste déroulante. Acceptez les valeurs de pompe par défaut. b Sélectionnez Pump (Pompe). c Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les voies et de fuites à proximité des collecteurs. 6 Retirez le tube d évacuation du conteneur à déchets. N insérez pas les tubes de la pompe de condensation. 7 Groupez les huit tubes d évacuation à l aide d un parafilm en veillant à ce que toutes les extrémités soient au même niveau. Placez les extrémités des tubes groupés dans un flacon de 250 ml. 8 Sélectionnez Next (Suivant) pour lancer le lavage à l eau. Positions Durée approximative de l analyse 8 positions SBS 20 minutes 8 positions SBS et 10 positions appariées 60 minutes Guide du système HiSeq

46 Procédures après analyse 9 Une fois le lavage effectué, mesurez le volume distribué et enregistrez-le sur le formulaire de suivi de laboratoire. Positions Volume total distribué 8 positions SBS 32 ml 4 ml 8 positions SBS et 10 positions appariées 72 ml 9 ml 10 Détachez les tubes d évacuation et retournez-les vers le flacon à déchets. Volule distribué par rainure 42 Nº Rév. A FRA

47 Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie Pour libérer de l espace disque sur l ordinateur de l instrument pour une analyse ultérieure, Illumina recommande un formatage rapide du lecteur de sortie (O:\) après l achèvement d une analyse. Le formatage rapide nettoie le lecteur O:\ sans supprimer de fichiers système ou de fichiers de maintenance de l instrument importants. REMARQUE Les journaux de maintenance de l instrument sont enregistrés sur le lecteur C:\. C est pourquoi il n est pas risqué de procéder à un formatage rapide du lecteur O:\ pendant un lavage de l instrument. 1 Dans Windows, ouvrez Computer (Ordinateur) pour afficher la liste des lecteurs de l ordinateur. 2 Faites un clic droit sur le lecteur O:\ et sélectionnez Format (Formater). 3 Dans la boîte de dialogue Format (Formater), cochez la case Quick Format (Formatage rapide). 4 Sélectionnez Start (Démarrer). Effectuer un formatage rapide du lecteur de sortie Guide du système HiSeq

48 Procédures après analyse Inactivité de l instrument Respectez les instructions suivantes pour préparer l instrument à une période d inactivité pouvant aller jusqu à dix jours. Pour des périodes de plus de dix jours, consultez la section Arrêter l instrument à la page Effectuez un lavage de maintenance complet pour bien rincer le système. Pour en savoir plus, consultez la section Réaliser un lavage de maintenance à la page Laissez la Flow Cell sur la platine de Flow Cell avec le levier de Flow Cell en position 2. Cela maintient les collecteurs en position relevée. 3 Chargez 10 ml d eau de laboratoire dans chacune des positions des réactifs dans les supports de réactifs. Puis abaissez les dispositifs d aspiration. 4 N éteignez pas l instrument. 5 Avant d utiliser à nouveau l instrument, effectuez un lavage à l eau. Pour en savoir plus, consultez la section Réaliser un lavage à l eau à la page Nº Rév. A FRA

49 Arrêter l instrument Arrêtez le système seulement si vous n envisagez pas de l utiliser dans les dix prochains jours ou plus. Si vous envisagez d utiliser l instrument dans les dix prochains jours, consultez la section Inactivité de l instrument à la page 44. Utilisez la procédure suivante pour préparer la fluidique et arrêter le système en toute sécurité. 1 Procédez à un lavage de maintenance pour rincer le système. Pour en savoir plus, consultez la section Réaliser un lavage de maintenance à la page Retirez la Flow Cell de la platine de Flow Cell. 3 À l aide d une lingette alcoolisée ou d un tissu non pelucheux imprégné d éthanol ou d isopropanol, essuyez soigneusement la surface du portoir de Flow Cell jusqu à ce qu elle soit propre. ATTENTION Veillez à ce que l alcool ne s écoule pas dans les trous de décompression ou autour des collecteurs. Utilisez si besoin un chiffon de laboratoire peu pelucheux pour sécher la platine. 4 Chargez 10 ml d eau de laboratoire dans chacune des positions des réactifs dans les supports de réactifs. Puis, abaissez les dispositifs d aspiration. 5 Mettez l instrument hors tension. 6 Pour redémarrer l instrument, chargez de l eau dans toutes les positions de réactifs, mettez l instrument sous tension et effectuez un lavage à l eau. Pour plus de renseignements, consultez la section Réaliser un lavage à l eau à la page 41. Arrêter l instrument Guide du système HiSeq

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51 Chapitre 4 Real-Time Analysis Real-Time Analysis Introduction 48 Présentation de RTA v2 49 Flux de travail de l analyse temps réel 51 Fichiers de sortie de séquençage 55 Numérotation des plaques 56 Chapitre 4 Guide du système HiSeq

52 Real-Time Analysis Introduction Le logiciel Real-Time Analysis effectue une analyse des images et une définition des bases sur l instrument au cours de l analyse de séquençage, ce qui économise un temps précieux lors de l analyse ultérieure des données. Le système HiSeq 3000 utilise une nouvelle version du logiciel Real-Time Analysis (RTA) appelée RTA v2, qui comprend les différences importantes d architecture et de fonctionnalités suivantes : } Les fichiers de configuration, les formats de fichier de sortie et le flux de travail du traitement diffèrent de ceux des précédentes versions du logiciel. } Les paramètres du fichier de configuration utilisés avec les précédentes versions du logiciel ne sont pas compatibles avec RTA v2. } Si RTA v2 est arrêtée, elle ne reprend pas le traitement et les données de l analyse ne sont pas enregistrées. } Les performances de démultiplexage ne sont pas calculées. L onglet Index de Sequencing Analysis Viewer (Visualiseur d analyse de séquençage SAV) n est donc pas rempli. 48 Nº Rév. A FRA

53 Présentation de RTA v2 RTA v2 fonctionne sur l ordinateur de l instrument et extrait les intensités des images, effectue la définition des bases et lui attribue un score de qualité. Contrairement aux versions précédentes du logiciel Real-Time Analysis, RTA v2 et le logiciel de commande communiquent par une interface Web HTTP et des fichiers de mémoire partagés. Si RTA v2 est arrêtée, RTA v2 ne reprend pas le traitement et les données de l analyse ne sont pas enregistrées. Une analyse ne peut donc pas reprendre après avoir été arrêtée. RTA v2 reprend automatiquement seulement si une analyse est interrompue. Si la connexion réseau est interrompue, RTA v2 continue le traitement et écrit les données sur le disque local. Le transfert des données reprend une fois la connexion rétablie. Entrée de RTA v2 RTA v2 nécessite les fichiers d entrée suivants : } Les images des plaques contenues dans la mémoire locale du système. } RunInfo.xml, que le logiciel de commande génère automatiquement au début de chaque analyse. À partir de ce fichier, RTA v2 lit le nom de l analyse, le nombre de cycles, vérifie si une lecture est indexée et lit le nombre de plaques sur la Flow Cell. } RTA.exe.config, qui est un fichier de configuration logicielle au format XML. Présentation de RTA v2 Sortie RTA v2 Les images de chaque canal passent de la mémoire à RTA v2 sous forme de plaques. À partir de ces images, RTA v2 produit des fichiers de sortie primaires qui prennent la forme d un ensemble de fichiers de définition de bases dont la qualité est notée et de fichiers de filtrage. D autres fichiers prennent en charge la génération des fichiers de sortie primaires. } Fichiers de définition des bases : pour chaque plaque analysée, un fichier de définition des bases compressé (*.bcl) est généré pour chaque plaque par cycle. Le fichier de définition des bases contient la définition des bases et le score de qualité qui lui est associé. } Fichiers de filtrage : chaque plaque génère des renseignements sur le filtre inclus dans un fichier de filtrage (*.filter) pour chaque plaque au cours de la totalité de l analyse. Le fichier de filtrage précise si les amplifiats ont franchi les filtres. } Fichiers d emplacement des amplifiats : un fichier d emplacement des amplifiats (s.locs) contient les coordonnées X et Y de chaque amplifiat sur la Flow Cell. Les fichiers de sortie primaires sont utilisés pour une analyse ultérieure des données. Utilisez le logiciel de conversion bcl2fastq pour le démultiplexage et la conversion FASTQ. Pour convertir des données à partir du système HiSeq 3000, utilisez bcl2fastq v2.16 ou une version supérieure. Pour obtenir la version actuelle du logiciel et télécharger des renseignements, consultez la page d assistance du système HiSeq 3000 sur le site Web d Illumina. RTA v2 fournit des indicateurs en temps réel sur la qualité de l analyse, stockés dans des fichiers InterOp. Les fichiers InterOp sont des fichiers binaires contenant des indicateurs relatifs aux plaques, aux cycles et au niveau de lecture nécessaires pour afficher des indicateurs dans le visualiseur d analyse de séquençage. Pour afficher les indicateurs générés par RTA v2, utilisez la version du logiciel SAV ou une version supérieure. Pour plus de renseignements, consultez la section Fichiers de sortie de séquençage à la page 55. Guide du système HiSeq

54 Real-Time Analysis Gestion des erreurs de RTA v2 RTA v2 crée des fichiers journaux dans le dossier RTALogs. Si une erreur se produit, elle est enregistrée dans un fichier d erreur distinct au format de fichier *.tsv. Tous les fichiers journaux sont transférés vers la destination de sortie finale à la fin du traitement. Les fichiers journaux suivants sont générés lorsqu une erreur se produit. } *GlobalLog*.tsv récapitule les événements importants survenus pendant l analyse. } *LaneNLog*.tsv enregistre les événements relatifs au traitement de chaque rainure. } *Error*.tsv répertorie toutes les erreurs survenues au cours d une analyse. } *WarningLog*.tsv répertorie les avertissements reçus au cours d une analyse. Transfert de données Au cous de l analyse, RTA v2 demande le transfert des données auprès de RunCopyService, le logiciel chargé de gérer le transfert vers l emplacement spécifié du répertoire de sortie. En cas d utilisatio de BaseSpace, le BaseSpace Broker gère le transfert des données vers BaseSpace. Si la connexion réseau est interrompue, RTA v2 continue le traitement et écrit les données sur le disque local. Le transfert des données reprend une fois la connexion rétablie. REMARQUE Assurez-vous que votre connexion réseau correspond à la connexion réseau minimale requise pour le transfert des données de l analyse vers BaseSpace. Pour obtenir plus de renseignements, consultez le guide de configuration du laboratoire et de préparation du site de votre configuration HiSeq. Consultez la section Ressources supplémentaires à la page 13. Une fois l analyse terminée, RTA v2 crée un fichier marqueur nommé RTAComplete.txt. Le transfert des données est terminé une fois ce fichier créé. 50 Nº Rév. A FRA

55 Flux de travail de l analyse temps réel Le flux de travail de Real-Time Analysis comprend les étapes suivantes: } Génération des modèles : établit les emplacements des amplifiats. } Enregistrement et extraction d intensité : enregistre l emplacement de chaque amplifiat sur la Flow Cell modélisée et détermine une valeur d intensité pour chaque amplifiat. } Correction de la matrice de couleurs : corrige les interférences entre les canaux. } Correction empirique de la mise en phase : corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase. } Définition des bases : détermine une définition des bases pour chaque amplifiat. } Notation de la qualité : attribue un score de qualité à chaque définition des bases. Génération du modèle La première étape du flux de travail est la génération du modèle, qui définit la position de chaque amplifiat dans une plaque à l aide des coordonnées X et Y. Le modèle est utilisé comme référence pour l étape suivante d enregistrement et d extraction de l intensité. En raison de l assemblage sur la Flow Cell modélisée, les positions des amplifiats sont prédéterminées en fonction du nombre de rangées, du nombre de colonnes et de la distance entre les nano-puits sur la Flow Cell. Pour obtenir plus de renseignements, reportez-vous à la section Flow Cell modélisée à la page 5. La position des amplifiats de la totalité de l analyse s inscrivent dans un même fichier d emplacement des amplifiats (s.locs). Pour plus de renseignements, consultez la section Fichiers de sortie de séquençage à la page 55. Flux de travail de l analyse temps réel Enregistrement et extraction d intensité L enregistrement et l extraction de l intensité commencent une fois que le modèle de positions d amplifiats est généré. } L enregistrement transforme les modèles d emplacement des amplifiats en l emplacement sur l image pour chacun des quatre canaux de couleur. } L extraction d intensité détermine une valeur d intensité pour chaque amplifiat du modèle pour une image donnée. S il y a échec d enregistrement de l image d un cycle, quelle qu elle soit, aucune définition des bases ne sera générée pour cette plaque dans ce cycle. Utilisez Sequencing Analysis Viewer pour examiner les miniatures et trouver les images dont l enregistrement a échoué. Pour plus de renseignements, consultez la section Fichiers de sortie de séquençage à la page 55. Correction de la matrice de couleurs Après l enregistrement et l extraction de l intensité, RTA v2 corrige les interférences entre les canaux. Les interférences se produisent lorsqu un amplifiat possède une intensité dans le canal C et une intensité dans le canal A, par exemple. À l aide d une matrice de couleurs 4 4, RTA v2 génère des intensités corrigées par la matrice exemptes d interférences ou avec des interférences réduites, et équilibre les différences d intensité générale entre les canaux de couleur. Guide du système HiSeq

56 Real-Time Analysis Correction de la mise en phase empirique Lors de la réaction de séquençage, chaque brin d ADN dans un amplifiat s étend d une base par cycle. La mise en phase et la mise en préphase ont lieu lorsqu un brin se retrouve hors phase par rapport au cycle d incorporation en cours. } La mise en phase se produit lorsqu un brin a un retard d'une base. } La mise en préphase se produit lorsqu un brin a une avance d'une base. Figure 25 Mise en phase et en préphase A B Lecture avec une base présentant une mise en phase Lecture avec une base présentant une mise en préphase RTA v2 corrige les effets de la mise en phase et de la mise en préphase à l aide de l algorithme de correction empirique de la mise en phase, qui exploite au maximum la qualité des données à chaque cycle tout au long de l analyse. Les résultats de la mise en phase et en préphase sont enregistrés dans un fichier nommé EmpiricalPhasing_[lane]_[read]_[tile].txt (Miseenphaseempirique_[ligne]_[lecture]_ [plaque].txt) situé dans le dossier Data\Intensities\BaseCalls\Phasing. Définition de bases Une fois la couleur des intensités brutes corrigée, ainsi que la mise en phase et la mise en préphase, le canal de couleur dont l intensité est la plus brillante correspond à la définition de base pour cet amplifiat dans ce cycle. La définition des bases sur le système HiSeq 3000 à l aide de RTA v2 commence après le cycle 3. La définition des bases détermine une base (A, C, G ou T) pour chaque amplifiat d une plaque donnée d un cycle spécifique. Les définitions des bases sont enregistrées dans des fichiers de définition des bases (*.bcl). Il s agit de fichiers binaires comportant un octet par définition et par score de qualité. Chaque fichier de définition des bases contient la définition de bases et le score de qualité qui lui est associé. Pour réaliser une définition des bases, les amplifiats doivent d abord passer par le filtre de pureté. Les amplifiats qui ne passent pas le filtre ou qui ne peuvent pas être définis car ils sont en dehors de l image ou parce que l enregistrement de l image a échoué sont des «no-calls» (sans définition). Les «no-calls» sont représentés comme (N). Amplifiats passant par le filtre Pendant les 25 premiers cycles de la lecture 1, le filtre de pureté supprime les amplifiats de basse qualité des résultats d analyse. Les amplifiats passent le filtre s il n existe pas plus d une définition des bases présentant une valeur de pureté inférieure à 0,6 dans les 25 premiers cycles. La pureté est définie comme le rapport de l intensité de base la plus brillante divisée par la somme de l intensité de base la plus brillante et de la deuxième 52 Nº Rév. A FRA

57 plus brillante. Le pourcentage d amplifiats passant par le filtre est représenté dans les rapports d analyse sous la forme %PF. La Flow Cell modélisée HiSeq 3000 génère un pourcentage d amplifiats passant par le filtre inférieur aux autres modèles HiSeq. Cette différence est due aux caractéristiques d un assemblage ordonné d amplifiats sur une Flow Cell modélisée par rapport à un assemblage aléatoire d amplifiats sur une Flow Cell non modélisée. } Amplifiats aléatoires sur une Flow Cell non modélisée : les amplifiats sont formés en un assemblage aléatoire et localisés pendant la génération du modèle. Les amplifiats de faible qualité sont supprimés du décompte d amplifiats bruts pendant la génération du modèle, ce qui entraîne un pourcentage relativement élevé d amplifiats passant par le filtre. } Assemblage d amplifiats ordonné sur une Flow Cell modélisée : les amplifiats sont formés dans un assemblage prédéfini de nano-puits. Les puits vides ne contenant pas d amplifiat et les puits polyclonaux, où plus d une séquence est présente, sont inclus dans le décompte d amplifiats bruts, mais ne passent pas le filtre. L assemblage ordonné sur une Flow Cell modélisée produit donc un pourcentage relativement faible d amplifiats passant par le filtre. Figure 26 Puits vides et polyclonaux (compris dans le comptage d amplifiats bruts) Flux de travail de l analyse temps réel Figure 27 Puits contenant des amplifiats autres que PF (indiqués en gris) Notation de la qualité Un score de qualité ou Q-score est une prévision de la probabilité d une définition de base erronée. Un score de qualité plus élevé implique qu une définition des bases est d une meilleure qualité et plus susceptible d être correcte. Le score de qualité constitue un moyen simple pour communiquer la probabilité de petites erreurs. Les scores de qualités sont représentés sous la forme Q(X), où X est le score. Le tableau suivant montre la relation entre le score de qualité et la probabilité d une erreur. Score de qualité Q(X) Probabilité d une erreur Q40 0,0001 (1 sur ) Q30 0,001 (1 sur 1 000) Q20 0,01 (1 sur 100) Q10 0,1 (1 sur 10) Guide du système HiSeq

58 Real-Time Analysis REMARQUE La notation de la qualité s appuie sur une version modifiée de l algorithme Phred. Pour obtenir plus de renseignements, consultez en.wikipedia.org/wiki/phred_quality_score. La notation de la qualité calcule un ensemble d indicateurs prévisionnels pour chaque définition de bases, puis utilise ces valeurs pour rechercher un score de qualité dans un tableau de qualité. Les tableaux de qualité servent à fournir des indicateurs de qualité extrêmement précis pour des analyses générées par une configuration spécifique de plateforme de séquençage et de version de chimie. Une fois le score de qualité établi, les résultats sont enregistrés dans des fichiers de définition de bases (*.bcl). Pour plus de renseignements, consultez la section Fichiers de sortie de séquençage à la page 55. Compartimentage par score de qualité RTA v2 regroupe les scores de qualité selon des plages ou compartiments spécifiques et attribue une valeur à chaque plage. Le compartimentage par score de qualité réduit considérablement les besoins d espace de stockage, sans affecter la précision ou le fonctionnement des applications en aval. Le compartimentage par score de qualité contribue à l efficacité du traitement des analyses et du transfert de données associés au débit élevé du système HiSeq Le fichier *.bcl qui en résulte est plus petit en raison des algorithmes de compression, qui parviennent à mieux compresser le fichier. La quantité de données écrites sur l ordinateur de l instrument est réduite. Les données sont transférées à un emplacement réseau, ce qui permet de copier le fichier plus vite. 54 Nº Rév. A FRA

59 Fichiers de sortie de séquençage Type de fichier Fichier de définition des bases Fichier d emplacement des amplifiats Fichier de filtrage Description, emplacement et nom du fichier Chaque plaque analysée est incluse dans un fichier de définition des bases qui comprend la définition des bases et son score de qualité encodé. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] : pour chaque rainure, les fichiers sont enregistrés dans des dossiers par cycle. s_[lane]_[tile].bcl.gz (s_[rainure]_[plaque].bcl.gz), où «Rainure» représente le numéro à un chiffre de la rainure et «Plaque» représente le numéro à quatre chiffres de la plaque. Les fichiers de définition de base sont compressés selon la méthode gzip. Pour chaque plaque, un fichier d emplacement des amplifiats contient les coordonnées XY de chaque amplifiat. Les fichiers d emplacement des amplifiats sont le résultat de la génération du modèle. Data\Intensities (Données\Intensités) : un fichier correspondant à l analyse est enregistré dans le dossier Intensities (Intensités). s.locs Le fichier de filtrage spécifie si un amplifiat a franchi les filtres. Les fichiers de filtrage sont générés au cycle 26 et portent sur 25 cycles de données. Data\Intensities\BaseCalls\L00[X] (Données\Intensités\DéfinitionsDesBases\L00[X]) : les fichiers sont enregistrés dans un dossier pour chaque rainure et chaque plaque. s_[rainure]_[plaque].filter Fichiers de sortie de séquençage Fichiers InterOp Fichier de configuration Real-Time Analysis Fichier de renseignements sur l analyse Fichiers des miniatures Les fichiers de rapport binaires sont utilisés pour Sequencing Analysis Viewer. Les fichiers InterOp sont mis à jour tout au long de l analyse. Dossier InterOp Créé au début de l analyse, le fichier de configuration de Real- Time Analysis indique les paramètres de l analyse. [Root folder] ([Dossier racine]) RTAConfiguration.xml Indique le nom de l analyse, le nombre de cycles à chaque lecture, si la lecture est une lecture indexée et le nombre de témoins et de plaques sur la Flow Cell. Le fichier de renseignements sur l analyse est créé au début de l analyse. [Root folder] ([Dossier racine]) RunInfo.xml Une image miniature pour chaque canal et plaque dans chaque témoin à chaque cycle pendant l imagerie. Thumbnail_Images\L00[X]\C[X.1] (Miniatures_Images\L00[X]\C [X.1]) : les fichiers sont enregistrés dans un dossier pour chaque rainure et dans un sous dossier pour chaque cycle. s_[lane]_[tile]_[channel].jpg (s_[rainure]_[plaque]_[canal].jpg) : la plaque est représentée par un nombre à quatre chiffres qui indique la surface, le témoin et la plaque. Consultez la section Numérotation des plaques à la page 56. Guide du système HiSeq

60 Real-Time Analysis Numérotation des plaques La Flow Cell modélisée HiSeq 3000 est imagée en 112 plaques sur chaque rainure, en haut et en bas, pour chaque cycle. Chaque rainure comporte 2 témoins, avec 28 plaques par témoin. Les plaques sont numérotées en fonction de leur position. Le nom de la plaque est un nombre à quatre chiffres qui représente la position sur la Flow Cell. } Le premier chiffre représente la surface : 1 indique le haut 2 indique le bas } Le second chiffre représente le témoin : 1 indique le premier témoin 2 indique le second témoin REMARQUE Un témoin est une colonne de plaques dans une rainure de Flow Cell. } Les deux derniers chiffres (de 01 à 28) représentent la plaque. La numérotation des plaques commence par 01 au niveau de la sortie de la Flow Cell et va jusqu à 28 au niveau de l entrée. Figure 28 Numérotation des plaques Cet exemple montre une plaque depuis la surface supérieure d une Flow Cell, le deuxième témoin et la septième plaque. 56 Nº Rév. A FRA

61 Chapitre 5 Dépannage Dépannage Introduction 58 Problèmes possibles de configuration de l analyse 59 Réaliser une vérification de la fluidique 60 Suspendre ou arrêter une analyse 61 Possible réhybridation du primer de lecture 1 63 Chapitre 5 Guide du système HiSeq

62 Dépannage Introduction Cette section décrit ce qu il faut faire en cas de problème pendant une analyse de séquençage et la façon d effectuer une vérification de la fluidique à partir de l écran de bienvenue. 58 Nº Rév. A FRA

63 Problèmes possibles de configuration de l analyse Problème Cause possible Action Le logiciel n a pas été initialisé. Le voyant du levier de Flow Cell est orange. Un voyant orange clignote sur le levier de Flow Cell. Un voyant vert clignote sur le levier de Flow Cell. Mauvaise distribution des liquides. Le logiciel n a pas pu initialiser des périphériques internes. La Flow Cell n est pas bien positionnée. La décompression n est pas étanche. Les collecteurs ne se lèvent pas. Une décompression a bien lieu, mais elle est inadéquate. La pression négative est satisfaisante. Bulles potentielles dans le système. Fermez le message d erreur, puis relancez le logiciel de l instrument. Si le problème persiste, redémarrez l ordinateur de l instrument. Avant de redémarrer l ordinateur, éteignez d abord l instrument pour vous assurer que le lecteur DoNotEject (Ne pas éjecter) est correctement reconnu. Si le problème persiste après le redémarrage de l ordinateur de l instrument, arrêtez l instrument, attendez au moins 60 secondes, puis redémarrez-le. Retirez la Flow Cell et répétez les opérations de nettoyage. Assurez-vous que les joints sont présents et bien positionnés. Rechargez la Flow Cell. Si les étapes précédentes ne fonctionnent pas, remplacez les joints, puis rechargez la Flow Cell. Retirez la Flow Cell et répétez les opérations de nettoyage. Assurez-vous que les joints sont présents et bien positionnés. Rechargez la Flow Cell. Si les étapes précédentes ne fonctionnent pas, remplacez les joints, puis rechargez la Flow Cell. Basculez le levier de la Flow Cell en position 2. Repositionnez la Flow Cell et vérifiez que les trous sont orientés vers le bas. Recherchez la présence de précipité blanc autour des joints. En cas de présence de précipité, remplacez les joints. Remplacez toujours les joints avant un lavage de maintenance de l instrument. Confirmez que les ensembles de dispositifs d aspiration sont complètement abaissés et que chaque dispositif d aspiration est en contact avec les réactifs. Problèmes possibles de configuration de l analyse Guide du système HiSeq

64 Dépannage Réaliser une vérification de la fluidique Le bouton Check (Vérification) de l écran de bienvenue permet de procéder à une vérification de la fluidique. Utilisez cette option lors de l installation de l instrument et du dépannage des problèmes de fluidique. 1 Chargez une Flow Cell utilisée sur l instrument. 2 Remplissez huit flacons SBS avec du PW1 ou de l eau de laboratoire, puis chargez les flacons dans le support de réactifs correspondant. Chargez le support dans l instrument. 3 Sélectionnez Check (Vérifier) sur l écran de bienvenue. 4 Sélectionnez la solution 5 (HB2) dans la liste déroulante. Si vous effectuez une vérification de la fluidique avec une Flow Cell utilisée, sélectionnez la solution 2, qui est de l eau. 5 Saisissez les valeurs par défaut suivantes : Volume : 250 Aspirate Rate (Taux d aspiration) : 250 Dispense Rate (Taux de distribution) : Sélectionnez Pump (Pompe). Pour interrompre la vérification de la fluidique, sélectionnez Pause (Interrompre). 7 Inspectez la Flow Cell à la recherche de bulles dans les rainures et de fuites à proximité des collecteurs. Si des bulles sont présentes en trop grand nombre, vérifiez que les joints de collecteur ne sont pas obstrués, réduisez le taux d aspiration à 100 et pompez 250 µl d eau supplémentaires vers la Flow Cell. 60 Nº Rév. A FRA

65 Suspendre ou arrêter une analyse Les options permettant de suspendre ou d arrêter une analyse sur le système HiSeq 3000 sont différentes de celles des autres instruments HiSeq. Si vous choisissez d arrêter une analyse, vous n aurez pas la possibilité d enregistrer les données ou de reprendre l analyse. Interrompre une analyse Interrompez une analyse à partir de l écran Run Overview (Aperçu de l analyse). La suspension d une analyse peut être nécessaire pour vérifier les composants de l analyse tels que les volumes de réactifs. Interrompre une analyse de façon temporaire vous permet de reprendre l analyse sans perdre de données. RTA v2 reprend automatiquement lors de la reprise d une analyse suspendue. Pour plus de renseignements, consultez la section Real-Time Analysis à la page Sur l écran Run Overview (Aperçu de l analyse), sélectionnez Pause (Interrompre). Le menu d interruption s ouvre. Figure 29 Options d interruption 2 Sélectionnez Normal Pause (Interruption normale). 3 Sélectionnez Yes (Oui) pour confirmer la commande d interruption. Le logiciel termine la commande en cours et place la Flow Cell en état de sécurité. 4 Sélectionnez Resume (Reprendre) pour reprendre l analyse. Suspendre ou arrêter une analyse Changer des réactifs en cours d analyse Si vous avez commencé l analyse avec un volume partiel de réactifs, utilisez la fonction Change Reagents (Changer les réactifs) pour suspendre l analyse et remplir les réactifs. 1 Sur l écran Run Overview (Aperçu de l analyse), sélectionnez Pause (Interrompre). Le menu d interruption s ouvre. 2 Sélectionnez Change Reagents (Changer les réactifs). 3 Sélectionnez Yes (Oui) pour confirmer la commande d interruption. Le logiciel termine la commande de chimie ou d imagerie en cours et place la Flow Cell en état de sécurité, puis ouvre l écran Reagents (Réactifs). 4 Sur l écran Reagents (Réactifs), saisissez les paramètres de réactifs suivants : L identifiant de la trousse de réactifs pour les nouveaux réactifs. Le nombre de cycles correspondant à la durée attendue des réactifs. REMARQUE La case à cocher de l amorçage est désactivée sur l écran Change Reagents (Changer les réactifs). L amorçage n est pas nécessaire. 5 Sélectionnez Next (Suivant) pour passer au chargement des réactifs. Guide du système HiSeq

66 Dépannage Arrêter une analyse ATTENTION L arrêt d une analyse sur le système HiSeq 3000 est une action définitive. Si l analyse RTA v2 est arrêtée, le logiciel ne reprend pas le traitement et les données de l analyse ne sont pas enregistrées. Une analyse ne peut donc pas reprendre après avoir été arrêtée. 1 Pour arrêter l analyse, sélectionnez Abort (Abandonner). Confirmez ou annulez cette commande. Confirmer la commande d abandon vous ramènera à l écran de bienvenue. 2 Passez aux procédures après analyse. REMARQUE Si une analyse est arrêtée pendant la lecture 1, il est possible d effectuer une réhybridation de primer sur le système cbot. Après la réhybridation de primer, démarrez une nouvelle analyse sur le système HiSeq 3000 pour lancer le séquençage de la Flow Cell. 62 Nº Rév. A FRA

67 Possible réhybridation du primer de lecture 1 Si les mesures d analyse de lecture 1 montrent des nombres d amplifiats faibles, des intensités d amplifiats faibles ou tout autre problème, vous pouvez effectuer une réhybridation du primer de lecture 1 pour préserver la Flow Cell. La réhybridation du primer de lecture 1 s effectue sur le cbot et n endommage pas les amplifiats de la Flow Cell. L hybridation du primer de lecture 1 sur une Flow Cell modélisée HiSeq 3000 nécessite les consommables Illumina suivants : } Trousse de réhybridation multiprimer HiSeq 3000/4000 cbot (référence GD ) } Collecteur HiSeq cbot (référence SY ) Pour obtenir plus de renseignements, consultez les documents relatifs à la réhybridation du primer de lecture 1 sur une Flow Cell HiSeq 3000/4000 (référence ). Possible réhybridation du primer de lecture 1 Guide du système HiSeq

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69 Index Index % %PF 53 A afficher le fichier journal 10 aide documentation 13 aide, technique 69 amorçage paramètre facultatif 20 préparation 27 volume de déchets 27 amplifiats passant par le filtre 53 amplifiats polyclonaux 53 analyse temps réel mise en phase 52 score de qualité 53 arrêt d une analyse 11 arrêt d une analyse, pas de reprise 62 arrêt de l instrument 45 arrêter l instrument 44 assistance clientèle 69 assistance technique 69 B BaseSpace feuille d échantillons 12, 20 stockage et analyse 18 surveillance de l analyse 18 transfert de données 50 C chargement de la flow cell flow cell de séquençage 30 chargement de la Flow Cell amorçage de la Flow Cell 25 bulles, fuites 27, 31 chargement des réactifs 23 bouchons verseurs 22 consommables 22 pesée 22 positions SBS 22 PW1 en position 2 22 compartiment de flow cell 4 compartiment de Flow Cell 3 compartiment de réactifs 3 compartiment des réactifs 3 compartiment fluidique 3 compartimentage des scores de qualité 18 composants compartiment de flow cell 4 compartiment de Flow Cell 3 compartiment de réactifs 3 compartiment des réactifs 3 compartiment fluidique 3 module optique 3 compression des données 54 configuration de l analyse amorçage des réactifs 20 chargement de la flow cell 30 cycles restants 20 sélection de rainure 19 sélections d indexage 19 sélections de chimie 19 vérifier que le flux est correct 27, 31 confirmer la première base 19 consommables fournis par l utilisateur 6 préparation 16 trousses pour le séquençage d Illumina 16 consommables fournis par l utilisateur 6 consommables pour le séquençage 16 cycles, surveillance 33 D dépannage 59 chargement de la flow cell 59 enregistrement 51 fluidique 60 documentation 13, 69 dossier de sortie emplacement facultatif 18 emplacement par défaut 10 double indexage paramètres de l écran Recipe (Formule) 19 sur une Flow Cell appariée 19 É échelle Phred 53 écran de bienvenue 8 commandes 8 menu 10 écran Flow Cell Setup (Configuration de la Flow Cell) 19 écran Reagents (Réactifs) 19 Écran Reagents (Réactifs) 20 écran Recipe (Formule) 19 E emplacements des dossiers, paramètres par défaut 10 enregistrement, emplacements des amplifiats 51 erreurs et avertissements dans les fichiers de sortie 50 icônes d état 10 espace disque disponible 43 étapes de chimie, surveillance 33 Guide du système HiSeq

70 Index état de l instrument 10 extraction de l intensité 51 F feuille d échantillons BaseSpace 20 présentation 12 fichiers journaux GlobalLog 50 LaneNLog 50 fichiers RunInfo.xml 55 filtre de pureté 53 flow cell chargement 29 dépannage 59 levier 30 portoir de la flow cell 24 Flow Cell identifiant de la Flow Cell 19 levier 25 modélisée 5 préparation 16 Flow Cell modélisée 5 amplifiats passant par le filtre 53 réseau ordonné 53 fluidique, dépannage flux de travail Real-Time Analysisl 51 séquençage 17 flux de travail de séquençage 17 formatage rapide, lecteur de sortie 43 formation en ligne 13 H HiSeq Control Software 8 I icône d alerte d état 10 icônes alerte d état 10 erreurs et avertissements 10 images enregistrement des échantillons d images 18 miniatures 55 surveillance 33 vignettes 18 incorporation de la première base confirmation 33 rapport 19 indicateurs d activité 9 indicateurs de capteurs 9 intensités des amplifiats 33 InterOp 55 interruption d une analyse 11 J journaux de maintenance 43 L lavage à l eau 8 consommables 41 durée 41 volumes attendus 41 lavage de l instrument 38 lavage de maintenance 8, 38 lavages lavage à l eau 41 lavage de maintenance 38 préparation d une solution de lavage de maintenance 38 lecteur de sortie formatage rapide 43 lecteur DoNotEject 7 levier de flow cell position 0 24 position 1 30 position 2 30 levier de la Flow Cell position 1 25 position 2 25 logiciel à propos de, version 10 afficher en plein écran 10 afficher le fichier journal 10 dépannage 59 écran de bienvenue 8 Experiment Manager 12 HiSeq Control Software 8 initialisation 7 Real-Time Analysis 8 Sequencing Analysis Viewer 8 logiciel Real-Time Analysis 8 différences de la RTA v2 48 M mise en phase empirique 52 mise en phase, mise en préphase 52 mise hors tension de l instrument 45 module optique 3 N nom de l expérience 19 P page d état 33 pesée des réactifs après analyse 37 avant l analyse 22 portoir de flow cell broches de guidage 30 emplacements des trous de décompression 24 portoir de la Flow Cell broches de guidage 25 positions appariées 23 positions de réactif SBS 22 positions des réactifs appariés 23 SBS 22 probabilité d une erreur 53 programme d indexage 20 R rapport de première base 33 rapports incorporation de la première base 33 réactifs amorçage 27 chargement des réactifs appariés Nº Rév. A FRA

71 déchargement 37 écran Reagents (Réactifs) enregistrement de l identifiant de la trousse mise au rebut après analyse 37 préparation 16 réactifs appariés, chargement 23 réactifs d indexage, chargement 23 Real-Time Analysis flux de travail 51 RTA v2 arrêt d une analyse, pas de reprise 62 compartimentage par score de qualité 54 gestion des erreurs 50 onglet index de SAV 48 transfert de données 50 S scores de qualité 53 compartimentage 18, 54 sélection de rainure 19 Sequencing Analysis Viewer 8 serveur LIMS 10 solution de lavage de maintenance conservation 38 élimination 38 préparation 38 surveillance de l analyse 33 T transfert de données spécifications liées au réseau 50 V vérification du système 8 vérifier que le flux est correct, valeurs par défaut 27, 31 Visualiseur d analyse de séquençage vue d ensemble 33 Index Guide du système HiSeq

72 Index 68 Nº Rév. A FRA

73 Assistance technique Pour obtenir une assistance technique, communiquez avec l assistance technique d Illumina. Tableau 3 Tableau 4 Région Coordonnées générales d Illumina Site Web Adresse électronique [email protected] Numéros de téléphone de l assistance clientèle d Illumina Numéro de la personne-ressource Région Numéro de la personne-ressource Amérique du Nord Irlande Allemagne Italie Australie Norvège Autriche Nouvelle Zélande Belgique Pays-Bas Danemark Royaume-Uni Espagne Suède Finlande Suisse France Autres pays Assistance technique Fiches signalétiques Les fiches signalétiques (SDS) sont disponibles sur le site Web d Illumina à l adresse support.illumina.com/sds.html. Documentation produit De la documentation produit au format PDF est disponible en téléchargement sur le site Web d Illumina. Accédez au site support.illumina.com, sélectionnez un produit, puis cliquez sur Documentation & Literature (Documentation et littérature). Guide du système HiSeq

74 Illumina 5200 Illumina Way San Diego, California États-Unis +(1) ILMN (4566) +(1) (en dehors de l Amérique du Nord) [email protected]