CH50 Eq Enzyme Immunoassay Kit. For in-vitro diagnostic use only. Product code: MK095

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1 CH50 Eq Enzyme Immunoassay Kit For in-vitro diagnostic use only Product code: MK095 The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK Telephone: +44 (0) Fax: +44 (0) FDA (USA) Information Analyte Name Complement components immunological test system Complexity Cat. High (goat) antibodies to TCC CH50 Eq Activator 10mL, contains human gammaglobulins and murine monoclonal antibodies in phosphate buffered saline (PBS) with 0.035% ProClin 300. Tween-20 is a registered trademark of ICI Americas Inc. ProClin is a registered trademark of Rohm and Haas Company. 4.2 Materials required but not provided Timer (60 minute range) Calculator or other computational method to validate the assay Clean, unused microassay plates and/or test tubes and racks Container for wash buffer dilution Wash bottle or other immunoassay washing system Adjustable multichannel pipette (8 or 12 channels) or repeating micropipettes (optional) Clean pipettes, 1 ml, 5 ml, and 10 ml Micropipettes and pipette tips Plate reader capable of optical density A 450 readings between 0.0 and Deionized or distilled water Incubator or microassay plate heater (37 C) Water bath (37 C) 5 WARNINGS AND PRECAUTIONS 1 INTENDED USE The CH50 Eq EIA measures the total classical complement pathway activity in human serum and allows detection of a deficiency of one or more of the complement components C1 through C9. 2 SUMMARY AND EXPLANATION The binding of C1q component of C1 to immune complexes triggers the classical complement pathway. This activation results in a cascade of enzymatic and nonenzymatic reactions, culminating in the formation of terminal complement complexes (TCC). Under standard conditions the level of TCC that can be generated in a serum is a quantitative expression of the serum s total classical complement activity. The traditional method for measuring the total classical complement activity in serum is the CH50 test 1. This test is a lytic assay, which uses antibody-sensitized sheep erythrocytes (EA) as the activator of the classical complement pathway and various dilutions of the test serum to determine the amount required to give 50% lysis. The percent haemolysis is determined spectrophotometrically. The CH50 test is an indirect measure of TCC, since the TCC themselves are directly responsible for the haemolysis that is measured. The CH50 Eq EIA provides a direct measure of the total classical complement activity in serum by quantifying the amount of TCC generated under standard conditions. The CH50 Eq EIA uses a monoclonal antibody to a unique neoantigen to capture the TCC analyte. Since both the CH50 Eq EIA and the CH50 test rely on the generation of TCC and correlate, the CH50 Eq EIA s results are expressed in CH50 unit equivalents per millilitre. 3 PRINCIPLE The CH50 Eq EIA for quantifying the total classical complement activity in human serum involves three basic procedures: (1) complement activation; (2) sample dilution; and (3) assay for terminal complement complexes (TCC). To activate the classical complement pathway, undiluted human serum samples and the controls are added to test tubes (or uncoated microassay wells) containing the activator. During incubation the classical pathway of complement is triggered and TCC are generated. In the second step, the activated sera are diluted in uncoated microassay wells or test tubes and dispensed, together with kit standards, directly into a microassay plate. The TCC present in the activated samples bind to the monoclonal antibodies coating the surface of the microassay wells. In the third step, the TCC microassay plate is washed and loaded with an HRPconjugate, which will bind to the bound TCC. After washing, the TCC microplate is loaded with a chromogenic enzyme substrate. After incubation a reagent is added to stop colour development. The absorbencies (A 450 values) generated with the controls, kit standards, and test specimens are measured spectrophotometrically. The colour intensity of the reaction mixture is proportional to the concentration of TCC present and to CH50 units. Using the kit standard curve, assay results are expressed in CH50 unit equivalents per millilitre (CH50 U Eq/mL). 4 REAGENTS 4.1 Materials provided CH50 Eq Standard A, B, C, D, E 1 x 1.5mL of each standard (A-E) Each contains human serum with assigned CH50 unit equivalents per ml, (U Eq/mL), protein stabilizers CH50 Eq Normal Control 3 x 100µL, lyophilized. When reconstituted, each contains human serum CH50 Eq Low Control 3 x 100µL, lyophilized. When reconstituted, each contains human serum Anti-TCC Coated Wells 96-well microassay plate with retainer and holder consisting of 12 eight-well strips coated with a mouse monoclonal antibody in a resealable foil pouch CH50 Eq Stop Solution 12mL, contains 1N (4%) hydrochloric acid CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, 2 x 50mL, contains phosphate 7 SPECIMEN COLLECTION buffered saline (PBS), 1.0% Tween-20, and 0.035% ProClin CH50 Eq Sample Diluent 50mL, Contains phosphate buffered saline (PBS), 0.05% Tween-20, 2.5% protein stabilizers, 0.035% ProClin CH50 Eq TMB Substrate, 12mL, contains 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) and Hydrogen Peroxide (H 2 O 2 ) CH50 Eq Conjugate 7mL, Contains horseradish peroxidase-conjugated Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 1 of For in-vitro diagnostic use. 5.2 Treat specimen samples as potentially biohazardous material. Follow Universal Precautions when handling contents of this kit and any patient samples Wear suitable protective clothing, gloves, and eye/face protection when handling contents of this kit Use the supplied reagents as an integral unit prior to the expiration date indicated on the package label Store assay reagents as indicated Do not use coated strips if pouch is punctured ProClin 300 is used as a preservative. Incidental contact with or ingestion of buffers or reagents containing ProClin can cause irritation to the skin, eyes or mouth. Use good laboratory practices to reduce exposure. Seek medical attention if symptoms are experienced The stop solution is considered corrosive and can cause irritation. Do not ingest. Avoid contact with eyes, skin, and clothing. If contact is made, immediately rinse affected area with water. If ingested, call a physician Each donor unit used in the preparation of the standards and control sera of this product was tested by an FDA-approved method for the presence of antibody to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and to hepatitis C virus, as well as for hepatitis B surface antigen. Since no test method can offer complete assurance that infectious agents are absent, these reagents should be handled at Biosafety Level 2 as recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen in the Centers for Disease Control/National Institutes of Health manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Use of multichannel pipettes or repeat pipettors is recommended to ensure timely delivery of reagents For accurate measurement of samples, add samples and standards precisely. Pipette carefully using only calibrated equipment Proper collection and storage of test specimens are essential for accurate results (see SPECIMEN COLLECTION and STORAGE) Avoid microbial or cross-contamination of specimens, reagents, or materials. Incorrect results may be obtained if contaminated Test each sample in duplicate Do not use a microassay well for more than one test Using incubation times and temperatures other than those indicated in the ASSAY PROCEDURE section may give erroneous results The TMB substrate must be protected from light during storage and incubation. Avoid contact with eyes, skin, and clothing. If contact is made, immediately rinse affected area with water Do not allow microassay wells to dry once the assay has begun When adding or aspirating liquids from the microassay wells, do not scrape or touch the bottom of the wells Heat-inactivated, hyperlipaemic or contaminated specimens may give erroneous results To avoid aerosol formation during washing, use an apparatus to aspirate the wash fluid into a bottle containing household bleach A wash bottle or automated filling device should be used to wash the plate (ASSAY PROCEDURE, Step 9). For best results, do not use a multichannel pipette to wash the microassay plate Dispose of containers and unused contents in accordance with Federal, State and local regulations. 6 STORAGE Store unopened kit at 2 8 C. After the kit is opened, the 20X wash solution concentrate may be stored at 2 30 C. After selecting the reagents or materials to be used in the assay, return the unused reagents immediately to their appropriate storage temperatures. Bring reagents and materials to room temperature (15 30 C) before use. INDICATIONS OF INSTABILITY OR DETERIORATION OF REAGENTS: Cloudiness or discoloration of the diluted wash solution indicates a deterioration of this reagent. If this occurs, the solution should be discarded. The activator may contain particles. This is normal and does not affect performance of the assay. Use serum as the specimen in this assay. Plasma is not acceptable. Handle and dispose of all specimens using Universal Precautions. The proper collection, processing, storage, and shipment of specimens is essential, since complement may be activated in improperly handled specimens. This could

2 lead to erroneous results. Serum specimens should be collected aseptically and prepared using standard techniques for clinical laboratory testing. Samples can be stored up to 2 hours at room temperature, up to 4 hours on ice, up to 3 days at 4 C, and at -70 C or below for long-term storage. Do not subject samples to more than 6 freeze/thaw cycles. Frozen specimens should be tested as soon as possible after thawing or stored on ice (for no longer than four hours) until assayed. Specimens should be packed in excess dry ice for shipping. Specimens that arrive thawed at the testing facility may be compromised. After receiving a shipment, samples can be stored at -70 C or below. 8 REAGENT PREPARATION After removing the needed reagents and materials, return the unused items to their appropriate storage temperatures (see STORAGE). Bring all reagents and materials for the assay to room temperature (15 30 C) before use Wash solution Mix the 20X wash solution concentrate by inverting the bottle several times. If the 20X wash solution concentrate has been stored at 2 8 C, crystals may have formed. To dissolve the crystals, warm the bottle in a C water bath until all crystals have dissolved and follow by mixing thoroughly. Prepare the wash solution by diluting the entire contents of one of the bottles of 20X wash solution concentrate up to one litre with distilled or deionized water. Mix thoroughly. The wash solution is stable for 30 days when stored in a clean container at 2 8 C. If discoloration or cloudiness occurs, discard the reagent Selecting the microassay strips Determine the number of wells required for the assay. It is recommended that the blank wells, controls, and standards be tested in duplicate. Remove the strip retainer from the assembled plate. Remove the unneeded strips and place them in the storage bag, reseal the bag and return it to storage at 2-8 C. Secure the strips to be used in the assay Specimen dilution Caution: Treat all specimens as if potentially infectious. Do not use heatinactivated, contaminated specimens, or improperly stored specimens. Serum specimens are required for this assay. Serum samples should be thawed quickly by placing them briefly in a 37 C water bath. Immediately upon thawing, place the samples on ice until the activation step (see ASSAY PROCEDURE). Do not dilute the test samples prior to activation Preparation of normal and low controls To one vial each of the lyophilized normal and low control add 100µL of deionized or distilled water. Mix briefly to ensure reconstitution and let sit for fifteen (15) minutes at room temperature. Vortex again and place on ice until ready for the activation step. 9 ASSAY PROCEDURE Read entire product insert before beginning the assay. See REAGENT PREPARATION and WARNINGS AND PRECAUTIONS before proceeding Activation of samples and controls Mix the activator, which contains readily suspendable particles, by swirling the bottle before use. Swirl frequently during this step to ensure suspension of the particles. Add 86µL of activator to the appropriate number of test tubes or microassay wells.* Next add 14µL of undiluted serum specimen, normal control, or low control to individual test tubes or microassay wells containing the activator. Mix carefully. Cover to minimize evaporation. Incubate at 37 C for sixty (60) minutes. (FOR YOUR CONVENIENCE: If you wish to batch samples, after activation you may store the undiluted, activated samples at -20 C or colder for up to 14 days before proceeding to the next steps.) * The number of test tubes or microassay wells required for activation equals the number of test samples plus two (2) additional ones for activation of the two controls Dilution of activated samples and controls After activation, dilute the activated samples and activated controls 1:200 in specimen diluent in clean, unused microassay wells or in test tubes. 9.3 Prepare the microassay strips as follows: a. Rehydrate microassay wells by filling each with wash solution ( µL/well) to each well using a wash bottle or an automated device. b. Incubate at room temperature (15 30 C) for two minutes. c. Remove the liquid from each well. d. Invert the plate and tap firmly on absorbent paper repeatedly to remove any remaining liquid. 9.4 Add 100µL of specimen diluent to the duplicate wells that will be used to blank the plate reader. 9.5 Add 100µL of each ready-to-use standard (A-E) to duplicate wells. Note that the standards have already been diluted and are ready to use. 9.6 Add 100µL of the diluted, activated normal and low controls to duplicate wells. 9.7 Add 100µL of each diluted specimen in duplicate to its assigned microassay wells. 9.8 Incubate at room temperature (15 30 C) for 60 ±1 minutes. 9.9 Wash the microassay wells as follows: Note: A multi-channel pipette is not recommended for this step. a. After the incubation in step 8 (or in step 12 below) remove the liquid from each well. b. Using a wash bottle, automated plate washer, or other washing device, fill each well with the wash solution ( µL/well). c. Incubate the wells for 1 minute at room temperature (15-30 C). d. Remove the liquid from each well. e. Fill each well with wash solution ( µL/well). f. Remove the liquid from each well. g. Repeat steps e-f five additional times. h. After the seventh wash cycle, invert the plate and tap firmly on Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 2 of 14 absorbent paper repeatedly to remove any remaining fluid Using a multichannel or repeating pipette, dispense 50µL of conjugate into each washed test well, including the blank well(s) Incubate the microassay strips at room temperature (15 30 C) for 60 ±1 minutes Wash the microassay wells after the 60-minute incubation, as described in step Immediately following the wash procedure, dispense 100µL of the TMB substrate solution into each well, including the blank(s) Incubate the microassay strips at room temperature (15 30 C) for 15±1 minutes Add 100µL of stop solution to each well to stop the enzymatic reaction. The stop solution should be added to the wells in the same order and at the same rate as was the substrate solution. Gently tap the plate to disperse the colour development evenly Determine the absorbance reading at 450nm (A 450 value) for each test well within one hour after the addition of the stop solution, making the necessary blank correction. No reference filter is required Dispose of the remaining diluted specimens, activator, controls, and the used microassay strips (see WARNINGS AND PRECAUTIONS, step 23) Keep the strip holder and strip retainer for future use. 10 RESULTS AND QUALITY CONTROL 10.1 Quality control Good laboratory practice recommends the use of controls to ensure that the assay is performing properly. Each CH50 Eq EIA kit contains normal and low controls that can be used for this purpose. These controls should be tested at least once for each batch of specimens, i.e., for each separate activation run. The controls, when used as instructed, should give CH50 unit equivalent values within the ranges specified on their vial labels. Since these controls are to be activated, diluted, and tested exactly like a typical specimen, they serve as both controls and reference standards for each activation and CH50 Eq EIA run. External controls, prepared by your laboratory, may also be used to help ensure that the assay is performing properly. In addition, the product insert requires that the standard curve generated with the kit A-E standards meet stringent validation requirements (see INTERPRETATION OF RESULTS). Standards should be tested in duplicate for each assay run. If the assay does not meet these requirements, repeat the assay or contact your local Binding Site representative for technical assistance Interpretation of results Use of the Standard Curve: The standard curve for the CH50 Eq EIA is generated using the blank-subtracted A 450 values for each standard (on the y axis) and the assigned concentration for each standard (along the x axis). The standard curve must meet the validation requirements. Most computers and calculators are capable of performing this calculation. An example of a typical standard curve is shown in Figure 1. Calculation of Actual CH50 U Eq Level in Patient Specimens: Sample values are calculated from the standard curve using linear regression analysis. For test samples that were activated and diluted 1:200 prior to testing, the CH50 U Eq/mL can be read directly from the standard curve. The values (U Eq/mL) for the normal and low controls can also be read directly from the standard curve, since you have also diluted them 1:200. In order to obtain accurate CH50 determinations for test specimens that yield A 450 values greater than that of the CH50 Eq EIA Standard E (or that yield A 450 values less than that obtained with Standard A), the test specimens may be re-assayed at a different dilution so that their new A 450 values will be within these limits. In all repeat assays the standards and controls must also be tested. If a sample is run in the assay at a dilution other than 200-fold, the CH50 level of the sample is determined by correcting for the difference between the dilution examined and the usual 200-fold dilution. For example, if a sample is diluted 100-fold rather than the usual 200-fold, and the linear regression curve yields a concentration of 100 CH50 U Eq/mL, then the actual CH50 U Eq/mL in the sample is 50 (i.e., 100 CH50 U Eq/mL divided by 2). Example of standard curve Figure Validation Calculate the CH50 U Eq/mL for the normal and low controls. Also determine the correlation coefficient (r) and the y-intercept (b) of the derived best fit Iinear curve for the values obtained with the A-E Standards. To validate the assay, the r, b, and control values must be within the ranges shown below: Correlation coefficient (r): > 0.96 y-intercept (b): ( ) to (+) Slope (m) Normal & low control values: Within ranges indicated on their respective vial labels Limitations of the procedure The CH50 Eq EIA has been used to test specimens collected as serum. The clinical

3 CH50 Eq Enzyme Immunoassay Summary Reagents, Standards, Controls and sample preparation performance of plasma samples prepared with different anticoagulants has not been determined. 11 EXPECTED VALUES Two hundred thirty-four (234) normal and abnormal serum samples were tested using the CH50 Eq EIA. The average value obtained with the normal sample population was 133 ± 54 CH50 U Eq/mL. As a guideline, the cutoff obtained using Receiver Operator Characteristics (ROC) analysis 2 with these normal and abnormal serum specimens was 70 CH50 U Eq/mL. Each laboratory should define its own normal ranges. Using the CH50 Eq EIA, two hundred twenty-one (221) patient samples were tested at a major clinical reference laboratory in the United States. Employing the cutoff of 70 CH50 Eq U/mL and ROC analysis, the overall accuracy of the CH50 Eq ElA, when compared to the combined results from three haemolytic and one EIA-based assay, was greater than 97%. Using traditional measurements of clinical performance, the CH50 Eq EIA also gave a clinical accuracy of greater than 97% with a sensitivity of 93.2% and a specificity of 99.4%. Using the Passing Bablok Algorithm method 3, the CH50 U Eq values obtained with the CH50 Eq EIA correlated closely with the CH50 values obtained by the traditional haemolytic assay reported by the clinic laboratory, giving a level of significance of p < Dilute wash solution concentrate 1:20 with deionized water Reconstitute each control with 100µL deionized or distilled water (let sit for 15 minutes at room temperature. Vortex, then place on ice) Assay Procedure Continuously mix activator by swirling during use Pipette 86µL of activator to dilution tubes or dilution wells Pipette 14µL of controls and specimen into dilution tubes or dilution wells and mix carefully Cover dilution tubes or dilution wells and incubate 60 ± 1 min at 37 C (store up to 14 days at -20 C) 12 PERFORMANCE CHARACTERISTICS 12.1 Precision: Within-run and between-run precision was determined by assaying 16 replicates of 4 serum samples in 10 different runs. Sample Serum 1 n = 16 replicates 13 REFERENCES CH50 U Eq/mL Within-run 1 C.V. (%) n = 10 runs Between-run 2 C.V. (%) 1. Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer, M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1961: Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots. Tentative Guideline, Dec NCCLS Document GP109-T, Vol. 13, No Passing, H. And W. Bablok. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): (1983). 4. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. Manufactured for The Binding Site Group Ltd. by Quidel Corp. San Diego, USA. Dilute activated controls and specimen 1:200 with complement specimen diluent into new tubes or dilution wells Add ~ 300 µl of wash solution into assay wells Incubate 2 min at C Remove liquid from each well (Blot dry) Pipette 100 µl of specimen diluent (blank), standards, activated controls, and activated specimens into assay wells Incubate 60 ± 1 min at C Wash 7 times with wash buffer (Incubate first wash 1 minute) Pipette 50µL conjugate Incubate 60 ± 1 min at C Wash 7 times with wash buffer (Incubate first wash 1 minute) Pipette 100µL substrate solution Incubate 15 ± 1 min at C Pipette 100µL stop solution Read the optical density at 450 nm Analyse the assay results using a linear curve fit (y = mx +b) Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 3 of 14

4 CH50 Eq Enzym Immunassay Kit Nur zur in-vitro Diagnostik Bestell-Nr.:MK095 The Binding Site Group Ltd., P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A, D Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) Enthalten nach Wiederherstellung Humanserum Anti-TCC Coated Wells (Mikroassay-Platte) Platte mit 96 Vertiefungen, einschließlich Feststelleinrichtung und Halterung. Setzt sich aus 12 Teststreifen mit jeweils 8 Vertiefungen zusammen, die mit einem monoklonalen Antikörper von Mäusen beschichtet sind und sich in einem wiederverschließbaren Kunststoffbeutel befinden CH50 Eq Stop Solution (Stopplösung) 12mL, Enthält 1N (4%) Salzsäure contains 1N (4%) Hydrochloric acid CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (20-fach konzentrierte Waschlösung) 2 x 50mL, Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1,0% Tween-20 und 0,035% ProClin CH50 Eq Sample Diluent (Probenverdünnungsmittel) 50mL, Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05% Tween-20, 2,5% Proteinstabilisatoren und 0,035% ProClin CH50 Eq TMB Substrate, (TMB Substrat) 12mL, Enthält 3,3, 5,5 tetramethylbenzidine (TMB) und Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) CH50 Eq Conjugate (Konjugat) 7mL, Enthält an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugierte Antikörper (Ziege) gegen TCC CH50 Eq Activator (Aktivator) 10mL, Enthält humanes Gammaglobulin und monoklonale Antikörper von Mäusen in phosphatgepufferter Kochsalz-lösung mit 0,035% ProClin 300 Tween-20 ist ein Warenzeichen von ICI Americas Inc. ProClin ist ein eingetragenes Warenzeichen von Rohm and Haas Company. 4.2 Benötigte Materialien (nicht im Lieferumfang) 1 VORGESEHENER VERWENDUNGSZWECK Mit dem CH50 Eq EIA kann die gesamthämolytische Aktivität des klassischen Komplementwegs in Humanserum gemessen werden. Auch ein Mangel der Komplementfaktoren C1 bis C9 kann mit ihm erkannt werden. 2 ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN Der klassische Komplementweg wird durch die Bindung der Untereinheit C1q des C1-Faktors an Immunkomplexe ausgelöst. Durch diese Aktivierung wird eine Vielfalt enzymatischer und nicht enzymatischer Reaktionen gestartet, die schließlich in die Bildung terminaler Komplementkomplexe (TCC) mündet. Die Menge an TCC, die unter Standardbedingungen in einem Serum gebildet werden kann, ist eine quantitative Funktion der hämolytischen Gesamtaktivität des klassischen Komplementwegs im Serum. Traditionell wird die hämolytische Gesamtaktivität des klassischen Komplementwegs mit dem CH50-Test bestimmt 1. Bei dieser Methode handelt es sich um ein lytisches Verfahren, bei dem der klassische Komplementweg durch Antikörper-sensitivierte Erythrozyten (EA) von Schafen aktiviert wird. Die Menge, die für eine Lyse von 50 % erforderlich ist, wird mittels verschiedener Verdünnungen des Testserums bestimmt. Die prozentuale Hämolyseaktivität wird spektrophotometrisch bestimmt. Das Ergebnis des CH50-Tests dient als ein direktes Maß für TCC, sind die terminalen Komplementkomplexe doch selbst direkt verantwortlich für die gemessene Hämolyseaktivität. Der CH50 Eq EIA ermöglicht durch die quantitative Bestimmung von TCC, das unter Standardbedingungen gebildet wurde, die direkte Messung der hämolytischen Gesamtaktivität des klassischen Komplementwegs. Für den Nachweis der terminalen Komplementkomplexe wird dabei ein monoklonaler Antikörper gegen ein einzigartiges Neoantigen eingesetzt. Da sowohl der CH50 Eq EIA als auch der CH50-Test auf der Bildung von TCC beruhen und miteinander korrelieren, werden die Testergebnisse des CH50 Eq EIA in Äquivalenten von CH50-Einheiten pro Milliliter angegeben. 3 FUNKTIONSPRINZIP Die mit dem CH50 Eq EIA durchgeführte quantitative Bestimmung der gesamthämolytischen Aktivität des klassischen Komplementwegs lässt sich in Humanserum grundsätzlich in drei Verfahrensschritte unterteilen: (1) Komplementaktivierung, (2) Verdünnung der Proben und (3) Bestimmung der terminalen Komplementkomplexe (TCC). Zum Aktivieren des klassischen Komplementwegs werden unverdünnte Humanserumproben und Kontrollen in Teströhrchen oder unbeschichtete Mikroassay-Vertiefungen, die den Aktivator enthalten, gegeben. Während der Inkubation wird der klassische Komplementweg ausgelöst und die TCC-Bildung gestartet. Im zweiten Schritt werden die aktivierten Seren in unbeschichtete Mikroassay- Vertiefungen oder Teströhrchen verdünnt und zusammen mit den Standardlösungen des Kits direkt auf eine Mikroassay-Platte gegeben. Die in den aktivierten Proben vorliegenden TCCs werden an die monoklonalen Antikörper gebunden, mit denen die Mikroassay-Vertiefungen beschichtet sind. Im dritten Verfahrensschritt wird die Mikroassay-Platte gewaschen und dann mit einem HRP-Konjugat gefüllt, das mit dem bereits gebundenen TCC eine Bindung eingeht. Nach dem Waschschritt wird ein chromogenes Enzymsubstrat auf die TCC-Mikroplatte gegeben. Nach der Inkubation wird dann zum Stoppen der Farbentwicklung ein Reagenz hinzugegeben. Die Extinktion (E 450 -Werte) der Kontrollen, Kit-Standardlösungen und Proben wird spektrophotometrisch gemessen. Die Farbintensität der Reaktionsmischung ist proportional zur TCC-Konzentration und den CH50- Einheiten. Die Testergebnisse der Kit-Standardlösungen werden auf einer Eichgeraden in Äquivalenten von CH50-Einheiten pro Milliliter (CH50 E Äq/mL) dargestellt. 4 REAGENZIEN 4.1 Mitgelieferte Materialien CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Standardlösungen A-E) je 1 x 1.5mL Enthalten Humanserum mit festgelegten Äquivalenten von CH50- Einheiten pro Milliliter (E Äq/mL), Proteinstabilisatoren CH50 Eq Normal Control (Normale Kontrolle) 3 x 100µL, (lyophilisiert) Enthalten nach Wiederherstellung Humanserum CH50 Eq Low Control (Niedrige Kontrolle) 3 x 100µL, (lyophilisiert) Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 4 of Stoppuhr (über einen Bereich von 60 Minuten) Taschenrechner oder anderes Rechenverfahren zum Validieren der Testergebnisse Saubere, unbenutzte Mikroassay-Platten und/oder Teströhrchen und Ständer Behälter für die Waschpufferverdünnung Waschflasche oder anderes für Immunassays geeignetes Waschsystem Einstellbare Mehrkanalpipette (8 oder 12 Kanäle) Mehrfachmikropipetten (optional) Saubere Pipetten, 1mL, 5mL und 10mL Mikropipetten und Pipettenspitzen Plattenlesegerät für Extinktionsmessungen (E450) über den Bereich von 0,0 bis 3, Vollentsalztes oder destilliertes Wasser Inkubator oder Heizung (37 C) für Mikroassay-Platte Wasserbad (37 C) 5 WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN 5.1 Zur in-vitro-diagnostik Proben als potenziell gefährliches biologisches Material behandeln. Beim Arbeiten mit diesem Kit und den Proben allgemein gültige Vorsichtsmaßnahmen befolgen Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz tragen beim Arbeiten mit diesem Kit. 5.4 Die mitgelieferten Reagenzien als eine zusammengehörende Einheit vor dem auf der Verpackung angegebenen Verfallsdatum verwenden. 5.5 Die Reagenzien des Assays wie angegeben lagern. 5.6 Die beschichteten Teststreifen nicht verwenden, wenn der Beutel beschädigt ist. 5.7 ProClin 300 wird als Konservierungsstoff verwendet. Der unbeabsichtigte Kontakt mit Pufferlösungen oder Reagenzien, die ProClin enthalten, bzw. deren Einnahme kann zu Reizungen der Haut, der Augen oder des Mundes führen. Die Anforderungen guter Laborpraxis beachten, um die Exposition möglichst gering zu halten. Beim Auftreten der ersten Symptome einen Arzt aufsuchen. 5.8 Stopplösung ist ätzend und kann zu Reizungen der Haut. Nicht einnehmen. Berührung mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit Wasser abwaschen. Bei Einnahme einen Arzt konsultieren. 5.9 Alle Spendereinheiten, die für die Standardlösungen und Kontrollseren dieses Produkts verwendet werden, wurden mit einer vom FDA zugelassenen Methode auf Antikörper gegen HIV (HIV1 und HIV2), Hepatitis-C-Viren und HBsAg untersucht. Da keine Testmethode mit 100% iger Sicherheit garantieren kann, dass keine infektiösen Substanzen vorliegen, sollten diese Reagenzien wie alle potenziell infektiösen Humanserum- oder Blutproben gemäß Biosafety Level 2 behandelt werden. Dementsprechende Empfehlungen sind im Handbuch Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 2007, Centers for Disease Control/National Institutes of Health, beschrieben Für ein zügiges und effizientes Dosieren von Flüssigkeiten wird der Gebrauch von Mehrkanal- oder Mehrfachpipetten empfohlen Zum Gewährleisten genauer Messungen bei der Zugabe der Proben und Standardlösungen genau arbeiten. Beim Pipettieren vorsichtig vorgehen und nur kalibrierte Geräte verwenden Für den Erhalt genauer Ergebnisse müssen die Proben fachgerecht entnommen und aufbewahrt werden (siehe ENTNAHME UND LAGERUNG DER PROBEN) Eine mikrobielle Kontamination bzw. Kreuzkontamination von Proben, Reagenzien oder Materialien vermeiden. Eine Kontaminationen kann zu falschen Ergebnissen führen Jede Probe mit Doppelbestimmung testen Die Mikroassay-Vertiefungen jeweils nur für eine Bestimmung verwenden Durch die Verwendung von Inkubationszeiten und - temperaturen, die von den unter TESTVERFAHREN gegebenen Werten abweichen, können falsche Ergebnisse erhalten werden Das TMB-Substrat muss während der Lagerung und Inkubation vor Licht geschützt werden. Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung vermeiden. Bei Kontakt den betroffenen Bereich sofort mit Wasser spülen.

5 5.18 Die Mikroassay-Vertiefungen nach dem Start des Tests nicht austrocknen lassen Beim Hinzufügen oder Ansaugen von Flüssigkeiten zu bzw. von den Mikroassay-Vertiefungen nicht den Boden der Vertiefungen ankratzen oder berühren Hitzeinaktivierte, hyperlipämische oder kontaminierte Proben können zu falschen Ergebnissen führen Um beim Waschen die Bildung von Aerosolen zu vermeiden, eine Vorrichtung verwenden, mit der die Waschflüssigkeit in eine Flasche mit haushaltsüblichem Bleichmittel gesaugt wird Zum Waschen der Platte eine Waschflasche oder ein automatisiertes Dosiergerät verwenden (siehe TESTVERFAHREN, Schritt 9). Für optimale Ergebnisse keine Mehrkanalpipette zum Waschen der Mikroassay-Platte verwenden Behälter und ungenutzte Inhaltsstoffe gemäß den Anforderungen bundesweit, landesweit und örtlich geltender Bestimmungen entsorgen. 6 LAGERUNG Ungeöffnetes Kit bei 2 8 C aufbewahren. Nach dem Öffnen des Kits kann die 20fach konzentrierte Waschlösung bei 2 30 C aufbewahrt werden. Nach der Entnahme der Reagenzien und Materialien, die für den Test verwendet werden sollen, nicht benötigte Reagenzien sofort wieder auf die erforderliche Lagertemperatur bringen. Die Reagenzien und Materialien vor dem Test auf Raumtemperatur (15 30 C) bringen. ANZEICHEN FÜR INSTABILITÄTEN ODER ZERSETZUNGSVORGÄNGE DER REAGENZIEN Eine Trübung oder Verfärbung der verdünnten Waschlösung weist auf eine Zersetzung dieses Reagenzes hin. Die Lösung sollte in diesem Fall entsorgt werden. Der Aktivator enthält u.a. Schwebstoffteilchen. Dies ist normal und beeinträchtigt die Leistungsfähigkeit des Tests nicht. 7 ENTHAHME UND LAGERUNG DER PROBEN Für diesen Test müssen Serumproben verwendet werden. Plasma ist nicht zulässig. Beim Arbeiten und Entsorgen der Proben die allgemein üblichen Vorsichtsmaßnahmen beachten. Entnahme, Bearbeitung, Aufbewahrung und Transport der Proben müssen fachgerecht durchgeführt werden, da die Komplementfaktoren bei einer unsachgemäßen Handhabung der Proben aktiviert werden können. Ungenaue Testergebnisse sind eine mögliche Folge. Die Serumproben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und gemäß Standardverfahren für die klinische Laborpraxis getestet werden. Proben können bis zu 2 Stunden bei Raumtemperatur, bis zu 4 Stunden auf Eis, bis zu 3 Tage bei 4 C und über längere Zeiträume bei 70 C oder tieferen Temperaturen eingefroren werden. Die Proben dürfen nicht mehr als sechsmal eingefroren/ aufgetaut werden. Eingefrorene Proben sollten unmittelbar nach dem Auftauen getestet oder bis zum Testen auf Eis (nicht länger als vier Stunden) gelagert werden. Für den Transport sollten die Proben auf Trockeneis gelegt werden. Proben, die das Labor im aufgetauten Zustand erreichen, sind u.u. beschädigt. Im Labor neu eingetroffene Proben können bei 70 C oder tieferen Temperaturen gelagert werden. 8 VORBEREITUNG VON REAGENZIEN Nach der Entnahme der erforderlichen Reagenzien und Materialien die nicht mehr benötigten Komponenten wieder auf die erforderliche Lagertemperatur bringen (siehe LAGERUNG). Alle Reagenzien und Materialien vor dem Test auf Raumtemperatur (15 30 C) bringen. 8.1 Waschlösung Die 20-fach konzentrierte Waschlösung durch mehrfaches Umdrehen der Flasche mischen. Wird die 20-fach konzentrierte Waschlösung bei 2 8 C gelagert, haben sich u. U. Kristalle gebildet. Zum Auflösen der Kristalle die Flasche in ein C warmes Wasserbad stellen, bis sich alle Kristalle aufgelöst haben und den Inhalt der Flasche dann gründlich mischen. Die Waschlösung vorbereiten, indem der gesamte Inhalt einer 20fach konzentrierten Waschlösungsflasche mit vollentsalztem oder destilliertem Wasser auf 1 Liter verdünnt wird. Gründlich mischen. Die Waschlösung ist bei Aufbewahrung in einem sauberen Behälter bei 2 8 C für 30 Tage haltbar. Das Reagenz beim Auftreten von Verfärbungen oder Trübungen entsorgen. 8.2 Entnehmen der Mikroassay-Teststreifen Die für den Test erforderliche Anzahl der Teststreifen bestimmen. Blindwerte, Kontrollen und Standardlösungen sollten in Doppelbestimmungen getestet werden. Die Teststreifen-Feststelleinrichtung von der Platte entfernen. Die nicht benötigten Teststreifen entnehmen und in den Beutel legen. Den Beutel wieder verschließen und bei 2 8 C aufbewahren. Die für den Test zu verwendenden Teststreifen befestigen. 8.3 Probenverdünnung Vorsicht: Alle Proben als potenziell infektiöses Material behandeln. Hitzeinaktivierte, kontaminierte oder falsch gelagerte Proben dürfen nicht verwendet werden. Für diesen Test werden Serumproben benötigt. Serumproben sollten aufgetaut werden, indem sie bei 37 C kurz in ein Wasserbad gelegt werden. Die Proben unmittelbar nach dem Auftauen bis zur Aktivierung auf Eis legen (siehe TESTVERFAHREN). Die Proben vor der Aktivierung nicht verdünnen. 8.4 Vorbereiten der normalen und niedrigen Kontrollen Zu einem Fläschchen der lyophilisierten normalen und niedrigen Kontrolle 100µL vollentsalztes oder destilliertes Wasser geben. Kurz mischen und dann bei Raumtemperatur fünfzehn (15) Minuten ruhen lassen. Erneut im Vortex-Mixer mischen und bis zur Aktivierung auf Eis legen. 9 TESTVERFAHREN Vor der Durchführung des Tests die gesamte Packungsbeilage lesen. Vor dem Fortfahren die unter VORBEREITUNG VON REAGENZIEN und WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN gegebenen Informationen einsehen. Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 5 of Aktivieren von Proben und Kontrollen. Den Aktivator, der einfach zu suspendierende Teilchen enthält, durch Schwenken der Flasche mischen. Die Flasche in diesem Schritt wiederholt schwenken, um zu gewährleisten, dass die Teilchen gut suspendiert sind. Je 86µL Aktivator in die erforderliche Anzahl an Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen geben.* Je 14µL unverdünnte Serumprobe, normale Kontrolle oder niedrige Kontrolle in die Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen mit dem Aktivator geben. Gründlich mischen. Abdecken, um die Verdampfung/ Verdunstung auf ein Minimum zu reduzieren. Bei 37 C für sechzig (60) Minuten inkubieren. (TIPP: Sollen die Proben in Chargen getestet werden, können die unverdünnten, aktivierten Proben nach der Aktivierung bei 20 C oder tieferen Temperaturen bis zum nächsten Verfahrensschritt maximal 14 Tage aufbewahrt werden.) * Die für die Aktivierung erforderliche Anzahl an Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen entspricht der Anzahl der Proben zuzüglich zwei (2) zusätzlicher Röhrchen/Vertiefungen für die beiden Kontrollen. 9.2 Verdünnen der aktivierten Proben und Kontrollen. Die aktivierten Proben und Kontrollen nach der Aktivierung mit Probenverdünnungsmittel im Verhältnis 1:200 verdünnen. Dazu unbenutzte, saubere Mikroassay-Vertiefungen oder Teströhrchen verwenden. 9.3 Die Mikroassay-Teststreifen wie folgt vorbereiten: a. Die Mikroassay-Vertiefungen rehydrieren, indem mit einer Waschflasche oder einem automatisierten Dosiergerät in jede Vertiefung µL Waschlösung gegeben wird. b. Bei Raumtemperatur (15 30 C) für 2 Minuten inkubieren. c. Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen. d. Die Platte umdrehen und wiederholt vorsichtig auf absorbierendem Papier ausklopfen, um Restflüssigkeiten zu entfernen µL des Probenverdünnungsmittels in diejenige(n) Duplikatvertiefung(en) geben, die zur Bestimmung des Nullwertes des Plattenlesegeräts verwendet werden sollen (die sog. Blindwerte). 9.5 Je 100µL der gebrauchsfertigen Standardlösungen (A E) in die Duplikatvertiefungen geben. Die Standardlösungen sind bereits verdünnt und können ohne weitere Vorbereitungen eingesetzt werden. 9.6 Je 100µL der verdünnten, aktivierten normalen und niedrigen Kontrollen in die Duplikatvertiefungen geben. 9.7 Je 100µL der verdünnten Probe (als Duplikate) in die entsprechenden Mikroassay-Vertiefungen geben. 9.8 Bei Raumtemperatur (15 30 C) für 60 ± 1 Minuten inkubieren. 9.9 Die Mikroassay-Vertiefungen wie folgt waschen: Hinweis: Für diesen Schritt sollte keine Mehrkanalpipette eingesetzt werden. a. Nach der Inkubation von Schritt 8 (und Schritt 12 - siehe unten) die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen. b. Die Vertiefungen mit einer Waschflasche, einem automatisierten Plattenwaschgerät oder einer anderen Wascheinrichtung mit jeweils µL Waschlösung füllen. c. Die Vertiefungen bei Raumtemperatur (15 30 C) für 1 Minute inkubieren. d. Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen. e. Alle Vertiefungen mit jeweils µL Waschlösung füllen. f. Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen. g. Die Schritte e-f weitere fünfmal wiederholen. h. Die Platte nach dem siebenten Waschschritt umdrehen und wiederholt vorsichtig auf absorbierendem Papier ausklopfen, um Restflüssigkeiten zu entfernen Mit einer Mehrkanal- oder Mehrfachpipette jeweils 50µL des Konjugats in die gewaschenen Testvertiefungen und die Blindvertiefungen geben Die Mikroassay-Teststreifen bei Raumtemperatur (15-30 C) für 60 ± 1 Minuten inkubieren Die Mikroassay-Vertiefungen nach der 60 Minuten dauernden Inkubation wie in Schritt 9.9 beschrieben waschen Unmittelbar nach dem Waschschritt je 100µL der TMB Substrat in die Vertiefungen und Blindvertiefung(en) geben Die Mikroassay-Teststreifen bei Raumtemperatur (15-30 C) für 15 ± 1 Minuten inkubieren Zum Stoppen der enzymatischen Reaktion je 100µL Stopplösung in die Vertiefungen geben. Die Zugab der Stopplösung in die Vertiefungen sollte in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgen wie bei der Zugabe der Substratlösung. Die Platte vorsichtig antippen, damit sich die Farbentwicklung gleichmäßig verteilt Innerhalb von einer Stunde nach der Zugabe der Stopplösung die Extinktion der Testvertiefungen bei 450nm bestimmen (E450-Wert) und eine Blindwertkorrektur vornehmen. Die Verwendung eines Referenzfilters ist nicht erforderlich Die verbleibenden verdünnten Proben, Kontrollen, Aktivator und benutzten Mikroassay-Teststreifen entsorgen (siehe Schritt 23 unter WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN). Den Halter und die Feststelleinrichtung für Teststreifen für zukünftige Bestimmungen aufbewahren. 10 QUALITÄTSKONTROLLE 10.1 Qualitätskontrolle Gemäß guter Laborpraxis sollten Kontrollen verwendet werden, um die Richtigkeit der Testergebnisse zu gewährleisten. Zu diesem Zweck enthält das CH50 Eq EIA Kit normale und niedrige Kontrollen. Diese Kontrollen sollten mindestens einmal pro Probensatz, d.h. einmal Aktivierungsserie, getestet werden. Die Befolgung der Anleitungen vorausgesetzt, sollten die Kontrollen CH50 Äq/mL-Werte ergeben, die innerhalb der auf den Flaschenetiketten angegebenen Bereiche liegen. Da diese Kontrollen genau auf die gleiche Weise aktiviert, verdünnt und getestet werden wie die Proben, dienen sie zum einen als Kontrolle und zum anderen als Referenzstands für die Aktivierung und die CH50 Eq EIA Testserie. Darüber hinaus können externe, vom Anwender angesetzte Kontrollen eingesetzt werden, um die Richtigkeit der Testergebnisse zu gewährleisten. Zudem wird auf der Packungsbeilage angegeben, dass Eichgerade, die mit den Standardlösungen A E des Testkits erstellt wurde, strengen Validierungsanforderungen gerecht werden

6 muss (siehe AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE). Die Standardlösungen sollten für jede Testserie als Duplikate gestestet werden. Erfüllt der Test diese Anforderungen nicht, den Test wiederholen oder den technischen Service von Binding Site verständigen Auswertung der Ergebnisse Eichgerade: Die Eichgerade des CH50_Eq_EIA wird mit den Blindwert-korrigierten E450-Werten der verschiedenen Standardlösungen (auf der y-achse) und den entsprechenden Standardkonzentrationen (auf der x-achse) erstellt. Die Eichgerade muss den Validierungsanforderungen gerecht werden. Diese Berechnung wird von den meisten Rechnern und Taschenrechnern unterstützt. Ein Beispiel einer typischen Eichgerade ist in Abb. 1 dargestellt. Berechnen der CH50 E Äq/mL-Werte in den Proben der Patienten: Die Testergebnisse der Proben werden mit Hilfe einer linearen Regression von der Eichgerade berechnet. Für Proben, die vor dem Testen aktiviert und im Verhältnis 1:200 verdünnt wurden, kann der CH50 E Äq/mL-Wert direkt von der Eichgerade abgelesen werden. Auch die Werte (E Äq/mL) der normalen und niedrigen Kontrollen können direkt von der Eichgerade abgelesen werden, da auch sie im Verhältnis 1:200 verdünnt wurden. Um für Proben mit E450-Werten, die über dem E450-Wert von CH50 Eq EIA Standardlösung E (oder unter dem E450-Wert von Standardlösung A) liegen, genaue CH50-Bestimmungen zu erhalten, müssen die Proben u.u. mit einem anderen Verdünnungsverhältnis erneut getestet werden, so dass ihre neuen E450-Werte innerhalb dieser Grenzwerte liegen. Bei allen Testwiederholungen müssen auch Standardlösungen und Kontrollen gemessen werden. Wird eine Probe in einem anderen Verdünnungsverhältnis als 1:200 gemessen, müssen die CH50-Werte der Probe für diese Abweichung entsprechend korrigiert werden. Wird eine Probe z. B. nicht 200fach, sondern 100fach verdünnt und beträgt die anhand der linearen Regression berechnete Konzentration 100 CH50 E Äq/mL, so lautet die tatsächliche Konzentration der Probe 50 CH50 E Äq/mL (d.h. 100 CH50 E Äq/mL geteilt durch 2). Beispiel einer Eichgeraden 12 LEISTUNGDATEN 12.1 Präzision Die Präzision in der Serie und von Serie zu Serie wurde für 16 Replikate von 4 Serumproben in 10 verschiedenen Testserien ermittelt. Probe Serum 1 n = 16 CH50 (E Äq/mL) 13 LITERATURVERWEISE In der Serie 1 C.V. (%) 150,4 3,2 6,0 59,96 4,5 5,4 98,84 3,6 8,7 48,86 3,9 6,2 2 n = 10 Testserien Von Serie zu Serie 2 C.V. (%) 1. Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer, M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1961: Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots. Tentative Guideline, Dec NCCLS Document GP109-T, Vol. 13, No Passing, H. And W. Bablok. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): (1983). 4. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. Hergestellt von Quidel Corp. San Diego, USA für The Binding Site Group Ltd Validierung Für die normalen und niedrigen Kontrollen den Wert CH50 E Äq/mL berechnen. Darüber hinaus für die Regressionsgerade, die mit den Werten der Standardlösungen A E erstellt wurde, den Korrelationskoeffizienten (r) und den Schnittpunkt mit der y-achse (b) bestimmen. Für die erfolgreiche Validierung des Tests müssen die Werte von r, b und der Kontrollen innerhalb der im Folgenden aufgeführten Bereiche liegen: Korrelationskoeffizient (r): > 0,96 y-schnittpunkt (b): ( )0,090 bis (+)0,068 Hang (m): 0,0033 bis 0,0089 Normale und niedrige Kontrolle: siehe Bereiche auf dem Etikett des entsprechenden Fläschchens 10.4 Grenzen der Methode Der CH50 Eq EIA wurde zum Testen von Serumproben verwendet. Die Eignung des Tests für mit verschiedenen Antikoagulanzien versetzten Plasmaproben wurde nicht untersucht. 11 ERWARTETE WERTE Es wurden 234 normale und anormale Serumproben mit dem CH50 Eq EIA getestet. Der für die Gruppe der normalen Proben erhaltene Mittelwert betrug 133 ± 54 CH50 E Äq/mL. Als Richtlinie wurde der Grenzwert von 70 CH50 E Äq/mL, der für diese normalen und anormalen Serumproben mittels ROC (Receiver Operator Characteristics)-Analyse 2 erhalten wurde, festgelegt. Es wird empfohlen, daß jedes Labor seine eigenen Normalbereiche ermittelt. Mit dem CH50 Eq EIA wurden 221 Patientenproben in einem großen Referenzlabor aus den USA getestet. Im Vergleich zu drei hämolytischen Tests und einem Enzym- Immunassay wurde auf Grundlage des Grenzwertes von 70 CH50 E Äq/mL und der ROC-Analyse eine Gesamtgenauigkeit von über 97% erhalten. Auf konventionellen Messungen der klinischen Leistungsfähigkeit beruhend, wurde mit dem CH50 Eq EIA eine klinische Genauigkeit von über 97% erhalten. Die Sensitivität betrug dabei 93,2% und die Spezifität 99,4%. Nach dem Passing-Bablok Test 3 wurde zwischen den CH50 E Äq-Werten des CH50 Eq EIA und den CH50-Werten des konventionellen hämolytischen Tests des klinischen Labors ein Signifikanzniveau von (p < 0,001) gefunden. Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 6 of 14

7 CH50 Eq EIA Zusammenfassung Vorbereitung von Reagenzien, Kontrollen und Proben Konzentrierte Waschlösung 1:20 mit deion. Wasser verdünnen Rekonstituieren Sie die Kontrolle mit 100µL deion. Wasser (15 Minuten stehen lassen. Mischen, dann auf Eis setzen) Testverfahren Den Aktivator während des Gebrauchs kontinuierlich Schwenken Je 86µL Aktivator in die Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen geben Je 14µL der Kontrollen und Proben in die Teströhrchen oder Mikroassay- Vertiefungen geben und gründlich mischen Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen abdecken und bei 37 C 60 ± 1 min inkubieren (Aufbewahrung bis zu 14 Tage bei -20 C ) CH50 Eq Essai Immunoenzymatique Pour un usage en diagnostic in-vitro Code Produit : MK095 The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. Distribué en France par la société : The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, Saint-Egrève Cedex. Téléphone: Fax: Die aktivierten Proben und Kontrollen nach der Aktivierung mit Probenverdünnungsmittel im Verhältnis 1:200 verdünnen Je ~ 300µL Waschlösung in die Testvertiefungen geben 1 APPLICATION Le test immunoenzymatique CH50 Eq quantifie l activité totale du complément de la voie classique dans le sérum humain et permet de détecter un déficit en un ou plusieurs des composants C1 à C9 du complément. 2 RÉSUMÉ ET EXPLICATION Bei C 2 min inkubieren Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Ausklopfen auf einer absorbierenden Unterlage komplett entfernen Je 100µL Komplement-Probenverdünngsmittel (Blindwert), Standardlösungen, aktivierte Kontrollen und aktivierte Proben in die Testvertiefungen geben Bei C 60 ± 1 mininkubieren 7 Wäschezyklen mit Waschlösung (Erster Waschzyklus 1 min inkubieren) Je 50µL Konjugat pipettieren Bei C 60 ± 1 Minute inkubieren 7 Wäschezyklen mit Waschlösung (Erster Waschzyklus 1 min inkubieren) Je 100µL Substratlösung pipettieren Bei C 15 ± 1 min inkubieren Je 100µL Stopplösung pipettieren Optische Dichte bei 450nm ablesen Analysieren Sie die Proben-Resultate mittels linearer Kurvenanpassung (y = mx + b) Le fait que le composant C1q du C1 se lie aux complexes immuns active la voie classique du complément. Cette activation entraîne une cascade de réactions enzymatiques et non enzymatiques aboutissant à la formation de complexes terminaux du complément (TCC). En conditions normales, le taux de TCC qui peut être observé dans un échantillon de sérum est une indication quantitative de l activité totale du complément de la voie classique de cet échantillon. On mesure habituellement l activité totale du complément de la voie classique par le test CH50 1. Ce test est un essai lytique, qui utilise des érythrocytes de mouton sensibilisés avec des anticorps pour activer le complément de la voie classique, ainsi que différentes dilutions du sérum à analyser afin de déterminer la quantité nécessaire pour provoquer une lyse à 50%. Le pourcentage d hémolyse est déterminé à l aide d un spectrophotomètre. Le test CH50 mesure indirectement le taux de TCC, puisque ces derniers sont à l origine de l hémolyse qui est mesurée. En revanche, le test immunoenzymatique CH50 Eq permet de mesurer directement l activité totale du complément de la voie classique dans le sérum en quantifiant les TCC formés dans des conditions normales. Le test CH50 Eq utilise un anticorps monoclonal anti-néoantigène unique pour capturer l analyte des TCC. Étant donné que les tests CH50 Eq et CH50 reposent tous deux sur la formation de TCC et sont étroitement liés, les résultats de le test immunoenzymatique CH50 Eq sont exprimés en équivalents d unités CH50 par millilitre. 3 PRINCIPE DU PROCEDE Le test immunoenzymatique CH50 Eq portant sur la quantification de l activité totale du complément de la voie classique dans le sérum humain comprend trois étapes de base: (1) l activation du complément; (2) la dilution de l échantillon; et (3) la mesure des complexes terminaux du complément (TCC). Pour activer le complément de la voie classique, on ajoute des échantillons de sérum humain non dilués et des échantillons de contrôle dans des tubes à essais (ou des puits de microplaque vierges) contenant de l activateur. Pendant l incubation, la voie classique du complément est activée et des TCC se forment. Au cours de la deuxième étape, les échantillons de sérums activés sont dilués dans des puits de microplaque vierge ou des tubes à essais, et déposés, en même temps que les étalons du coffret, directement dans une microplaque. Les TCC présents dans l échantillon activé se lient aux anticorps monoclonaux recouvrant les parois des puits de microplaqye. Lors de la troisième étape, on lave la microplaque pour les TCC et on la remplit de conjugué-hrp qui se lie aux TCC fixés. Après ce lavage, on verse un substrat enzymatique chromogénique sur la plaque. Après l incubation, on ajoute un réactif pour arrêter la réaction et stopper la coloration. Les valeurs d absorbance (valeurs A450) obtenues pour les contrôles, les étalons du coffret et les échantillons à analyser, sont mesurées à l aide d un spectrophotomètre. L intensité de la coloration du mélange est proportionnelle à sa concentration en TCC et au nombre d unités CH50. Les résultats de du test sont exprimés en équivalents d unités CH50 par millilitre (U Eq de CH50/mL) à l aide de la courbe étalon du test. 4 REACTIFS ET MATERIAUX FOURNIS 4.1 Materiaux Fournis Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 7 of CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Échantillons étalon A-E) 1 x 1.5mL, Chacun contient du sérum humain avec le nombre d unités équivalentes CH50 par ml (U Eq/mL) attribué, des conservateurs de protéines CH50 Eq Normal Control (Contrôle normal) 3 x 100µL, (lyophilisés). A reconstituer. Contient du sérum humain CH50 Eq Low Control (Contrôle bas) 3 x 100µL, (lyophilisés) A reconstituer. Contient du sérum humain Anti-TCC Coated Wells (Plaque de microtitration) Plaque de 96 puits avec portoir et support composée de 12 barettes de huit puits recouverts d anticorps monoclonal de souris, dans une sachet d aluminium refermable.

8 4.1.5 CH50 Eq Stop Solution (Solution d arrêt) 12mL, Contient 1N (4 %) d acide chlorhydrique CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (Solution de lavage 20x) 2 x 50mL, Chacun contient une solution saline de tampon phosphate (PBS), 1,0 % de Tween-20, et 0,035% de ProClin CH50 Eq Sample Diluent (Diluant de l échantillon de complément) 50mL, Contient du PBS, 0,05% de Tween-20, 2,5% de conservateurs de protéines, et 0,035 % de ProClin CH50 Eq TMB Substrate, (Substrat TMB) 12mL, Contient 3,3,5,5 tetramethylbenzidine (TMB) et peroxyde d'hydrogène (H2O2) CH50 Eq Conjugate (Conjugué) 7mL, Contient des anticorps (de chèvre) anti-tcc conjugués à de la peroxydase de raifort CH50 Eq Activator (Activateur) 10mL, Contient des gammaglobulines humaines et des anticorps monoclonaux murins dans une solution saline de tampon phosphate (PBS) avec 0,035 % de ProClin 300. Tween-20 est une marque d ICI Americas Inc. ProClin est une marque de Rohm and Haas Company. 4.2 Matériaux nécessaires non fournis Minuterie (60 minutes) Calculateur ou tout autre équipement informatique permettant de valider le test Microplaques et/ou tubes à essais et supports de tests propres et non utilisés Récipient pour dilution de tampon de lavage Flacon de lavage ou tout autre système de lavage adapté aux dosages immunologiques Pipettes multi-canaux réglables (8 ou 12 canaux) ou micropipettes automatisées (en option) Pipettes propres de 1mL, 5mL, et 10mL Embouts de micropipettes et de pipettes Lecteur de plaque capable de mesurer la densité optique A450 entre 0,0 et 3, Eau déionisée ou distillée Incubateur ou réchauffeur de plaque de microtitration (37 C) Bain-marie (37 C) 5 AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS 5.1 Pour utilisation en diagnostic in vitro. 5.2 Traiter les échantillons comme du materiel potentiellement contaminant. Suivre les precautions standard lors de la manipulation du contenu de ce coffret et de tous les échantillons de patients Porter des vêtements, des gants et un appareil de protection des yeux /du visage appropriés lors de la manipulation du contenu de ce coffret. 5.4 Utiliser les réactifs fournis ensemble avant la date de péremption indiquée sur l étiquette. 5.5 Stocker les réactifs du coffret selon les indications. 5.6 Ne pas utiliser les microplaques si la sache perçé. 5.7 Le ProClin 300 est utilisé comme conservateur. Tout contact ou toute ingestion accidentelle de tampons ou de réactifs contenant du Proclin peut provoquer une irritation de la peau, des yeux ou de la bouche. Le respect des bonnes pratiques de laboratoire permet de réduire l exposition. Consulter un médecin en cas d observation de ces symptômes. 5.8 La solution d arrêt est considéré corrosive et peut provoquer une irritation de la peau. Ne pas ingérer. Eviter le contact avec la peau, les yeux ou les vêtements. En cas de contact, laver à l eau. En cas d ingestion, appeler un médecin. 5.9 Chacun des prélèvements de donneurs utilisés pour préparer les sérums étalons et témoins (contrôles) de ce produit a été testé selon une méthode agréée par la FDA pour détecter la présence d anticorps dirigés contre le virus de l immunodéficience humaine (VIH1 et VIH2) et le virus de l hépatite C, ainsi que l antigène de surface du virus de l hépatite B. Aucune méthode de test ne pouvant garantir totalement l absence d agents infectieux, ces réactifs doivent être manipulés selon le niveau 2 de sécurité biologique comme le recommande, pour tout prélèvement sérique ou sanguin humain potentiellement infectieux, le manuel des Centers for Disease Control/National Institutes of Health intitulé «Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories», L utilisation de pipettes multi-canaux ou de robots pipetteurs est recommandée pour assurer la distribution rapide des réactifs Pour une mesure exacte des échantillons, ajouter les échantillons et les solutions étalon avec précision. Pipetter avec soin, en utilisant uniquement un équipement étalonné Il est essentiel de prélever et de conserver les échantillons avec soin pour obtenir des resultats corrects (voir la section PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS) Éviter toute contamination microbienne ou croisée des échantillons, des réactifs et du matériel. En cas de contamination, des résultats inexacts pourraient être obtenus Tester chaque échantillon en double Ne pas réutiliser un puits de la microplaque pour un deuxième test Le fait de ne pas appliquer les durées et températures d incubation indiquées dans PROCÉDURE DE L ESSAI est susceptible de conduire à des résultats erronés Le substrat TMB doit être protégé de toute exposition à la lumière lors de la conservation et de l incubation. Éviter le contact avec les yeux, la peau et les vêtements. En cas de contact, rincer immédiatement la zone concernée à l eau Ne pas laisser sécher les puits de la microplaque une fois que le test a commencé Ne pas effleurer ni toucher le fond des puits en ajoutant ou en aspirant des liquides Des échantillons inactivés par la chaleur, hyperlipémiques ou contaminés, peuvent entraîner des résultats erronés. Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 8 of Afin d éviter la production d aérosols pendant le lavage, utiliser un appareil pour aspirer le liquide de lavage et le déverser directement dans un flacon contenant de l eau de Javel Utiliser un flacon de lavage ou un dispositif de remplissage automatique pour laver la plaque (PROCÉDURE DE L ESSAI, étape 9). Pour obtenir des résultats optimaux, ne pas utiliser de pipette multicanaux pour laver la microplaque Éliminer les récipients et leur contenu inutilisé conformément aux dispositions réglementaires nationales et locales. 6 CONSERVATION Conserver les coffrets non ouverts entre 2 et 8 C. Après ouverture du coffret la solution de lavage concentrée 20x peut être conservée entre 2 et 30 C. Après avoir choisi les réactifs ou les produits à utiliser pour l essai, replacer immédiatement les réactifs non utilisés à une température de conservation appropriée. Amener les réactifs et produits du test à température ambiante (entre 15 à 30 C) avant utilisation. SIGNES D INSTABILITÉ ET DE DÉTÉRIORATION DES RÉACTIFS Toute turbidité ou décoloration de la solution de lavage indique une détérioration du réactif. Le cas échéant, la solution doit être jetée. Il arrive que l activateur contienne des particules. Cela est tout à fait normal et n influence en rien la performance de l essai. 7 PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS Pour ce test, utiliser du sérum comme échantillon. Il n est pas possible d utiliser du plasma. Manipuler et éliminer tous les échantillons en suivant la précaution standard. Il est très important de prélever, traiter, conserver et transporter les échantillons avec soin, étant donné qu une manipulation inappropriée de ces derniers peut activer le complément. Cela peut entraîner des résultats erronés. Les échantillons doivent être prélevés dans des conditions d asepsie et préparés suivant la technique standard pour les tests en laboratoire d analyse. On peut conserver les échantillons 2 heures à température ambiante, 4 heures sur de la glace, 3 jours à 4 C, ou bien à -70 C ou moins pour une conservation plus longue. Ne pas congeler/décongeler à plus de 6 reprises. Les échantillons congelés doivent être testés dès que possible après avoir été décongelés ou bien conservés sur de la glace (pendant quatre heures maximum) avant d être testés. Les échantillons doivent être emballés dans de la glace sèche pour le transport. Les résultats des échantillons parvenant décongelés sur les lieux du test risque d être altérés. Une fois livrés, les échantillons peuvent être conservés à -70 C ou moins. 8 PREPARATION DES REACTIFS Après avoir choisi les réactifs et les matériaux nécessaires, replacer immédiatement les produits inutilisés dans un environnement aux températures de conservation adaptées (voir la partie CONSERVATION). Amener tous les réactifs et matériaux de l essai à température ambiante (de 15 à 30 C) avant utilisation. 8.1 Solution de lavage Mélanger la solution de lavage 20x en retournant plusieurs fois le flacon. Si la solution de lavage 20x a été conservée entre 2 et 8 C, il est possible que des cristaux se soient formés. Pour les dissoudre, réchauffer le flacon au bain-marie entre 37 C et 50 C jusqu à dissolution complète, puis bien mélanger. Préparer la solution de lavage en diluant tout le contenu d un flacon de solution de lavage 20x avec de l eau distillée ou déionisée jusqu à obtention d un litre de produit. Bien mélanger. La solution de lavage reste stable pendant 30 jours quand elle est conservée dans un récipient propre entre 2 et 8 C. Si le réactif devient trouble ou se décolore, il doit être jeté. 8.2 Sélection des barettes de microtitration Déterminer le nombre de puits nécessaire pour le test. Il est recommandé de tester les puits blanc et les échantillons de contrôle et étalon en double. Retirer le support pour barettes de la plaque assemblée. Remettre les barettes inutilisées dans le sac de conservation refermé, et le stocker entre 2 et 8 C. Fixer solidement les barettes utilisées pour le test. 8.3 Dilution de l échantillon Avertissement: Manipuler tous les échantillons comme s ils étaient potentiellement infectieux. Ne pas utiliser d échantillons inactivés par la chaleur, contaminés, ou conservés dans des conditions inappropriées. Des échantillons de sérum sont nécessaires pour ce essai. Les échantillons de sérum doivent être décongelés rapidement dans un bain-marie à 37 C. Dès que l échantillon est décongelé, le déposer sur de la glace jusqu à l étape d activation (voir la partie PROCÉDÉ DU TEST). Ne pas diluer l échantillon à analyser avant l activation. 8.4 Préparation des contrôles normaux et bas Ajouter 100µL d eau déionisée ou distillée dans un flacon de contrôle normal et dans un autre de contrôle bas lyophilisés. Mélanger brièvement de manière à assurer la reconstitution, et laisser reposer pendant quinze (15) minutes à température ambiante. Mélanger de nouveau, puis poser sur de la glace jusqu à la phase d activation. 9 PROCEDE DU TEST Lire la notice produit dans son intégralité avant de commencer l essai. Voir les parties PRÉPARATION DES RÉACTIFS et AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS avant de poursuivre. 9.1 Activation des échantillons et des contrôles. Mélanger l activateur, qui contient des particules en suspension, en remuant le flacon avant utilisation. Le remuer fréquemment pendant cette étape afin que les particules restent en suspension. Ajouter 86µL d activateur dans le nombre requis de tubes à essais ou de puits de microplaque.* Ajouter ensuite 14µL d échantillon de sérum non dilué et

9 de contrôle normal ou bas dans chaque tube à essai ou puits de microplaque contenant de l activateur. Mélanger doucement. Couvrir afin de limiter l évaporation. Incuber à 37 C pendant soixante (60) minutes. (PRATIQUE : Si vous souhaitez faire des lots d échantillons, vous pouvez conserver les échantillons non dilués et activés à 20 C minimum pendant 14 jours maximum, juste après l activation, et avant de passer aux étapes suivantes.) *Le nombre de tubes à essais ou de puits de microplaque nécessaires pour l activation correspond au nombre d échantillons à analyser plus deux (2), pour l activation des deux échantillons de contrôle. 9.2 Dilution des échantillons et des contrôles activés. Après l activation, diluer les échantillons et les contrôles activés à 1:200 avec du diluant échantillon dans des tubes à essais ou des puits de microplaque propres et non utilisés. 9.3 Préparer les barettes comme indiqué ci-après: a. Réhydrater les puits de microplaque en les remplissant de solution de lavage (250 à 300µl/puits) dans chaque puits à l aide d un flacon de lavage ou d un équipement de lavage automatique. b. Incuber à température ambiante (15 30 C) pendant deux minutes. c. Vider chaque puits. d. Retourner la plaque et la taper sur du papier absorbant à plusieurs reprises afin d éliminer toute trace de liquide. 9.4 Ajouter 100µL de diluant de l échantillon dans les puits en double qui seront utilisés pour pour faire le blanc du lecteur de plaque. 9.5 Ajouter 100µL de chaque échantillon étalon prêt à l emploi (A E) dans les puits en double. Remarque: les échantillons étalon ont déjà été dilués et sont prêts à l emploi. 9.6 Ajouter 100µl des contrôles normaux et bas dilués et activés dans les puits en double. 9.7 Ajouter 100µl de chaque échantillon dilué dans le puits la microplaque qui lui a été attribué. 9.8 Incuber à température ambiante (15 30 C) pendant 60 minutes ± 1 minute. 9.9 Laver les puits de microplaque comme suit: Remarque: Il n est pas recommandé de se servir d une pipette multicanaux pour cette étape a. Après l incubation de l étape 8 (ou de l étape 12 ci-après), vider chaque puits. b. Remplir chaque puits de solution de lavage ( µl/puits) à l aide d un flacon de lavage, d un lave-plaques automatique ou de tout autre équipement de lavage. c. Incuber les puits pendant 1 minute à temperature ambiante (15-30 C). d. Vider chaque puits. e. Remplir tous les puits de solution de lavage ( µL/puits). f. Vider chaque puits. g. Répéter les étapes e à f cinq fois supplémentaires. h. Après le septième cycle de lavage, retourner la plaque et la taper sur du papier absorbant à plusieurs reprises afin d éliminer toute trace de liquide Verser 50µL de conjugué dans chaque puits lavé, y compris dans le(s) puits blanc(s), à l aide d une pipette multi-canaux ou automatisée Incuber la barette de à temperature ambiante (15 30 C) pendant 60 minutes ± 1 minute Laver les puits de microplaque après l incubation de 60 minutes, comme décrit dans l étape Immédiatement après le lavage, verser 100µL de la solution de substrat TMB dans chaque puits, y compris dans le(s) puits blanc(s) Incuber la barette de à temperature ambiante (15 30 C) pendant 15 minutes ± 1 minute Ajouter 100µL de solution d arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction enzymatique. La solution d arrêt doit être ajoutée dans les puits dans le même ordre et au même rythme que l a été la solution de substrat. Taper doucement la plaque pour que la couleur se propage régulièrement Déterminer le degré d absorbance à 450nm (valeur A450) pour chaque puits dans l heure suivant l ajout de la solution d arrêt, en corrigeant à l aide du puits. Aucun filtre de référence n est nécessaire Jeter les échantillons, l activateur et les contrôles dilués restants, ainsi que les barettes de utilises (voir la partie AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS, étape 23). Garder le portoir et le support pour barettes en vue d une réutilisation. 10 RESULTATS ET CONTROLE QUALITE 10.1 Contrôle qualité Les bonnes pratiques de laboratoire recommandent l utilisation d échantillons de contrôle afin de garantir le bon fonctionnement du test. Chaque coffret EIA CH50 Eq contient des contrôles normaux et bas qui peuvent être utilisés à cet effet. Ces contrôles doivent être testés au moins une fois pour chaque lot d échantillons, c està-dire pour chaque procédure d activation. Les contrôles, si utilisés comme indiqué, doivent donner des valeurs en unités équivalentes CH50 dans les limites précisées sur les étiquettes des flacons. Puisque ces contrôles doivent être activés, dilués et testés exactement comme un échantillon type, ils servent de contrôles et d échantillons étalon de référence pour chaque activation et pour chaque série de tests immunoenzymatiques CH50 Eq. Des contrôles externes, préparés par votre laboratoire, peuvent également être utilisés afin de s assurer du bon fonctionnement du test. En outre, la notice du produit exige que la courbe étalon générée à l aide des échantillons étalon A à E du coffret corresponde à des critères de validation rigoureux (voir la partie INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS). Les échantillons étalon doivent être analysés en double lors de chaque série de tests. Si le test ne remplit pas ces critères, le renouveler, ou contacter l assistance technique Binding Site Interpretation des résultats Utilisation de la courbe étalon: On obtient la courbe étalon pour le test EIA CH50 Eq en utilisant les valeurs A450 pour chaque échantillon étalon, auxquelles on soustrait le blanc échantillon à blanc (en ordonnée), et la concentration correspondant à chaque échantillon étalon (en abscisse). La courbe étalon doit remplir les critères de validation. La plupart des ordinateurs et des calculateurs sont capables d exécuter ces calculs. La Figure 1 est un exemple de courbe étalon type. Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 9 of 14 Calcul du taux réel d U Eq de CH50 dans les échantillons de patients: Les valeurs pour chaque échantillon sont calculées à partir de la courbe étalon, grâce à l analyse par régression linéaire. Si les échantillons à analyser ont été activés et dilués à 1:200 avant d être testés, on peut lire le taux en U Eq de CH50/mL directement sur la courbe étalon. On peut également lire les valeurs (U Eq/mL) pour les contrôles normaux et bas directement sur la courbe étalon, si ceux-ci ont également été dilués à 1:200. Afin d obtenir des résultats CH50 exacts pour les échantillons à analyser qui donnent des valeurs A450 supérieures à celles de l échantillon étalon E du test immunoenzymatique CH50 Eq (ou des valeurs A450 inférieures à celles obtenues pour l échantillon étalon A), les échantillons à analyser peuvent être testés à nouveau avec une dilution différente. Leurs nouvelles valeurs A450 peuvent alors se situer entre ces limites. Lors de tous ces nouveaux tests, les échantillons étalon et les contrôles doivent aussi être testés. Si un échantillon est testé à une dilution autre que 1:200, le taux de CH50 de l échantillon est calculé en tenant compte de la différence entre la dilution testée et la dilution à 1:200 habituelle. Par exemple, si un échantillon est dilué à 1:100 au lieu de la dilution habituelle de 1:200, et que la courbe de régression linéaire indique une concentration de 100 U Eq de CH50/mL, alors le taux reel de U Eq de CH50/mL dans l échantillon est de 50 (soit 100 U Eq de CH50/mL divisé par 2). Exemple de courbe etalon 10.3 Validation Calculer le taux en U Eq de CH50/mL pour les contrôles normaux et bas. Déterminer également le coefficient de corrélation (r) et le point d intersection sur l axe des ordonnées (b) de la meilleure courbe linéaire obtenue pour les valeurs des échantillons étalon A à E. Pour que le test soit validé, les valeurs r et b, et celles du contrôle, doivent se situer entre les limites indiquées ci-dessous: Coefficient de corrélation (r): > 0,96 Y - intercepter (b): de ( )0,090 à (+)0,068 pente (m): 0,0033 0,0089 Valeurs du contrôle normal et bas: Entre les limites indiquées sur l étiquette de leur flacon respectif Limites du procédé Le test immunoenzymatique CH50 Eq est utilisé pour analyser les échantillons de sérum. La performance clinique des échantillons de plasma préparés avec différents anticoagulants n a pas été déterminée. 11 VALEURS ATTENDUES Deux cent trente-quatre (234) échantillons de sérums normaux ont été testés avec le test CH50 Eq. La valeur moyenne obtenue avec les échantillons normaux était de 133 U Eq de CH50/mL ± 54. À titre indicatif, le seuil obtenu à l aide de l analyse de fonction d efficacité de l observateur 2 avec ces échantillons de sérums était de 70 U Eq de CH50/mL. Chaque laboratoire doit établir sa propre plage de références. Deux cent vingt-et-un (221) échantillons prélevés sur des patients ont été testés à l aide du test CH50 Eq dans l un des principaux laboratoires de référence des États- Unis. À partir du seuil établi de 70 U Eq de CH50/mL et de l analyse de fonction d efficacité de l observateur, l exactitude du test EIA CH50 Eq, en comparaison avec les résultats obtenus par trois tests d hémolyse et un test immunoenzymatique, était supérieure à 97%. Selon les méthodes classiques de mesure de la performance clinique, le test EIA CH50 Eq présente également un degré de précision clinique supérieur à 97% avec une sensibilité de 93,2% et une spécificité de 99,4%. Le test de régression par les moindres carrés 3 indique que les valeurs U Eq de CH50 obtenues avec le test immunoenzymatique CH50 Eq étaient très proches des valeurs CH50 obtenues avec le test de l hémolyse classique réalisé par le laboratoire clinique, obtenant un seuil de signification de p < 0, CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE 12.1 Précision On a dosé à 16 reprises 4 échantillons de sérums (Précision intra essai) et on a dosé ces mêmes échantillons dans 10 dosages différents (Précision inter-essais). Echantillon Sérum 1 n = REFERENCES CH50 (U Eq/mL) CV Intra-essai 1 (%) n = 10 dosages CV Inter-essais 2 (%)

10 1. Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer, M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1961: Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots. Tentative Guideline, Dec NCCLS Document GP109-T, Vol. 13, No Passing, H. And W. Bablok. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): (1983). 4. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. Fabriqué pour The Binding Site Group Ltd par Quidel Corp. San Diego, USA. Sommaire CH50 Eq EIA Préparation des réactifs, des contrôles, des standards et des échantillons Diluer la solution de lavage concentrée au 1:20 avec de l eau désionisée Reconstituez chaque Contrôle avec 100µL d eau désionisée (Laisser reposer pendant 15 minutes. Mélanger. Puis poser sur de la glace). Procédure de test Melanger sans interruption en remuant pendant l utilisation Ajouter 86µL d activateur dans les tubes à essais ou des puits de la microplaque Ajouter 14µL d'échantillon ou de contrôle dans chaque tube à essai ou puits de microplaque et mélanger doucement Couvrir chaque tube à essai ou puits et incuber pendant 60 ± 1 minute à 37 C (conserver à -20 C pendant 14 jours maximum) Diluer les échantillons et les contrôle activés au 1:200 avec du diluant échantillon dans des tubes à essais ou des puits de microplaque propres et non utilisés Ajouter ~ 300µL de solution de lavage dans puits à tester Incuber pendant 2 minutes entre 15 et 30 C Vider chaque puits (Tache séche) Ajouter 100µL de diluant échantillon (puits blanc), Étalons prêts à l'emploi, contrôles dilués et activés et échantillons dilués et activés dans les puits tester Incuber pendant 60 ± 1 minute entre 15 et 30 C Laver 7x avec Solution de Lavage (Incuber le premier lavage 1 minute) Ajouter 50µL de Conjugué Incuber pendant 60 ± 1 minute entre 15 et 30 C Laver 7x avec Solution de Lavage (Incuber le premier lavage 1 minute) Ajouter 100µL de Solution de Substrat Incuber pendant 15 ± 1 minute entre 15 et 30 C Ajouter 100µL de Solution d Arrêt Lire la densité optique à 450 nm. Analysez les résultats en utilisant un ajustement linéaire de courbe (y = mx + b) Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 10 of 14

11 CH50 Eq ENZIMOINMUNOENSAYO Para uso diagnóstico in-vitro Código de producto: MK095 The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. The Binding Site Spain S.L.U., C/ Balmes 243 4º 3ª, Barcelona Teléfono Fax: web: 1 USO PREVISTO El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq mide la actividad total de la vía clásica del complemento en suero humano y permite la detección de deficiencias en uno o más de los componentes del complemento C1 a C9. 2 RESUMEN Y EXPLICACION La unión del componente C1q de C1 a complejos immunes activa la vía clásica del complemento. Esta activación da como resultado una cascada de reacciones enzimáticas y no enzimáticas, que culminan en la formación de complejos de complemento terminales (CCT). Bajo condiciones normales, el nivel de CCT que puede generarse en un suero es una expresión cuantitativa de la actividad total de la vía clásica del complemento en el suero. El método tradicional para medir la actividad total de la vía clásica del complemento en el suero es el ensayo CH50 1. Este ensayo es un análisis lítico, que utiliza eritrocitos de oveja sensibilizados a anticuerpos (EA) como activador de la vía clásica del complemento y varias diluciones del suero del ensayo para determinar la cantidad requerida para producir una lisis del 50 %. La hemólisis porcentual se determina mediante espectrofotometría. El ensayo CH50 es una medida indirecta de los CCT, ya que los CCT son directamente responsables de la hemólisis que se mide. El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq proporciona una medida directa de la actividad total de la vía clásica del complemento en el suero cuantificando la cantidad de CCT generados bajo condiciones normales. El enzimoinmunoensayo CH50 Eq utiliza un anticuerpo monoclonal contra un neoantígeno único para capturar el analito de los CCT. Debido a que tanto el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq como la prueba CH50 dependen de la generación de CCT y parecidos, los resultados del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq se expresan en unidades CH50 equivalentes por mililitro. 3 PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq para cuantificar la actividad total de la vía clásica del complemento en suero humano se divide en tres procedimientos básicos: (1) activación del complemento, (2) dilución de la muestra y (3) ensayo de los complejos de complemento terminales (CCT). Para activar la vía clásica del complemento, muestras de suero humano sin diluir y los controles a los tubos de ensayo (o pocillos de microensayo sin fijar) que contienen el activador. Durante la incubación, se activa la vía clásica del complemento y se generan los CCT. En el segundo paso, se diluyen los sueros activados en pocillos de microensayo sin fijar o tubos de ensayo y se aplican, junto con los patrones del kit, directamente a una placa de microensayo. Los CCT presentes en las muestras activadas se unen a los anticuerpos monoclonales que recubren la superficie de los pocillos de microensayo. En el tercer paso, la placa de microensayo de CCT se lava y se carga con un conjugado con peroxidasa de rábano, que se unirá a los CCT unidos. Después de lavarla, la microplaca de CCT se carga con un sustrato de enzima cromogénico. Después de la incubación, se añade un reactivo para detener la formación de color. Las absorbancias (valores A450) generadas con los controles, patrones del kit y muestras del ensayo se miden mediante una espectrofotometría. La intensidad del color de la mezcla de reacción es proporcional a la concentración de CCT presentes y a unidades de CH50. Utilizando la curva estándar del kit, los resultados del ensayo se expresan en equivalentes de unidades de CH50 por mililitro (CH50 U Eq/mL). 4 REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Patrones A-E) 1 x 1,5mL Cada uno contiene suero humano con equivalentes a unidades de CH50 por ml asignados (U Eq/mL), estabilizadores de proteínas CH50 Eq Normal Control (Control normal) 3 x 100µL, (liofilizado) Una vez reconstituido, cada uno contiene suero humano CH50 Eq Low Control (Control bajo) 3 x 100µL, (liofilizado) Una vez reconstituido, cada uno contiene suero humano Anti-TCC Coated Wells (Placa de microensayo) 96 pocillos con retén y soporte, en doce tiras de ocho pocillos recubiertas con un anticuerpo monoclonal de ratón en una bolsa de papel de aluminio resellable CH50 Eq Stop Solution (Solución de parada) 12mL, Contiene Ácido Clorhídrico 1N (4%) CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (Concentrado de solución de lavado) 2 x 50mL, Cada uno contiene solución salina tamponada de fosfato (PBS), Tween-20 al 1,0% y ProClin 300 al 0,035% CH50 Eq Sample Diluent (Diluyente de muestras de complemento) 50mL, Contiene PBS, Tween-20 al 0,05 %, estabilizadores al 2,5%, ProClin 300 al 0,035% CH50 Eq TMB Substrate, (Sustrato TMB) 12mL, Contiene 3,3, 5,5 tetramethylbenzidine (TMB) y Peróxido de Hidrógeno (H2O2) CH50 Eq Conjugate (Conjugado) 7mL, Contiene anticuerpos anti-cct (de cabra) conjugados en peroxidasa de rábano CH50 Eq Activator (Activador) 10mL, Contiene gammaglobulinas humanas y anticuerpos monoclonales murinos en solución salina tamponada de fosfato (PBS) con ProClin 300 al 0,035% Tween-20 es una marca de ICI Americas Inc. ProClin es una marca registrada de Rohm and Haas Company. 4.2 Materiales necesarios pero no suministrados Cronómetro (de 60 minutos) Calculadora u otro método de cálculo para validar el ensayo Placas de microensayo limpias y sin usar y/o tubos de ensayo y portatubos Recipiente para dilución del tampón de lavado Botella para lavado u otro sistema de lavado para inmunoensayo Pipeta multicanal ajustable (8 ó 12 canales) o micropipetas de repetición (opcionales) Pipetas limpias, 1mL, 5mL y 10mL Micropipetas y puntas de pipeta Lector de placas apto para valores A450 de densidad óptica de 0,0 a 3, Agua desionizada o destilada Incubador o calentador de placas de microensayo (37 C) Baño de agua (37 C) 5 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 5.1 Para uso diagnóstico in vitro. 5.2 Respete las precauciones universales al manipular el contenido de este kit y las muestras de los pacientes Use ropa protectora adecuada, guantes y protección ocular/facial al manipular el contenido de este kit. 5.4 Use los reactivos suministrados como una unidad integral antes de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del envase. 5.5 Guarde los reactivos de ensayo según lo indicado. 5.6 No emplee las tiras recubiertas si la bolsa está pinchada. 5.7 El ProClin 300 se utiliza como conservante. El contacto o la ingestión accidentales de tampones que contienen ProClin pueden provocar irritación en la piel, los ojos o la boca. Utilice buenas prácticas de laboratorio para reducir la exposición. Busque atención médica en caso de experimentar estos síntomas. 5.8 El Solución de parada se considera corrosivo y puede provocar irritación en la piel. No lo ingiera. Evite el contacto con la piel, los ojos y la ropa. En caso de contacto, lave con agua. En caso de ingestión, solicite asistencia médica. 5.9 Cada unidad donante utilizada en la preparación de las muestras y sueros de control de este producto fue analizada con un método aprobado por la FDA para detectar la presencia de anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH1 y VIH2) y contra el virus de la hepatitis C y antígenos de superficie de la hepatitis B. Debido a que ningún método puede garantizar totalmente que no hay agentes infecciosos, estos reactivos deben manipularse a un nivel de bioseguridad 2, como cualquier suero humano o muestra de sangre potencialmente infecciosos, según se recomienda en el manual de los Centers for Disease Control/National Institutes of Health Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Se recomienda utilizar pipetas multicanal o dosificadores de repetición para garantizar la administración de los reactivos en el momento adecuado Para una medición exacta de las muestras, añada las muestras y los patrones con precisión. Pipetee cuidadosamente utilizando sólo equipo calibrado Es fundamental recoger y almacenar de forma adecuada las muestras de ensayo para obtener resultados precisos (vea la sección RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS) Evite la contaminación microbiana o cruzada de las muestras, reactivos o materiales. Su contaminación puede llevar a la obtención de resultados incorrectos Analice cada muestra por duplicado No utilice un pocillo de microensayo para más de un ensayo El uso de tiempos y temperaturas de incubación que no sean los indicados en la sección PROCEDIMIENTO DE ENSAYO puede dar resultados erróneos El sustrato de TMB debe protegerse de la luz durante su almacenamiento e incubación. Evite el contacto con los ojos, la piel y la ropa. En caso de contacto, lave inmediatamente el área afectada con agua No permita que los pocillos de microensayo se sequen una vez iniciado el ensayo Al añadir o aspirar líquidos de los pocillos de microensayo, no raspe ni toque el fondo de los pocillos Las muestras inactivadas por calor, hiperlipémicas o contaminadas pueden dar resultados erróneos Para evitar la formación de aerosoles durante el lavado, utilice un aparato para aspirar el líquido de lavado al interior de un frasco que contenga lejía de uso doméstico Utilice una botella para lavado o un dispositivo de llenado automático para lavar la placa (PROCEDIMIENTO DE ENSAYO, Paso 9). Para obtener los mejores resultados, no utilice una pipeta multicanal para lavar la placa de microensayo. Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 11 of 14

12 5.23 Deseche los recipientes y el contenido no utilizado de acuerdo con la normativa internacional, nacional y local. 6 CONSERVACIÓN Conserve el kit no abierto a 2 8 C. Una vez abierto, el concentrado de solución de lavado 20X puede guardarse a 2-30 C. Después de seleccionar los reactivos o materiales que se utilizarán en el ensayo, vuelva a guardar inmediatamente los reactivos no utilizados a las temperaturas de conservación adecuadas. Deje que los reactivos y los materiales para el ensayo se estabilicen a temperatura ambiente (15 30 C) antes de su uso. INDICACIONES DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE REACTIVOS Si la solución de lavado diluida se vuelve turbia o se decolora significa que el reactivo se ha echado a perder y debe desecharse. El activador puede contener partículas. Esto es normal y no afecta el buen funcionamiento del ensayo. 7 RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS Utilice suero como muestra en este ensayo. El plasma no es aceptable. Manipule y deseche todas las muestras utilizando las precauciones universales. Es fundamental recoger, procesar, almacenar y enviar las muestras de forma adecuada ya que las muestras mal manipuladas pueden activar el complemento y llevar a resultados erróneos. Las muestras de suero deben recogerse utilizando técnicas asépticas y prepararse según las técnicas habituales para el análisis clínico en laboratorio. Las muestras pueden ser almacenadas hasta 2 horas a temperatura ambiente, hasta 4 horas en hielo, hasta 3 días a 4 C, y a 70 C o menos para almacenamiento a largo plazo. Se recomienda no someter las muestras a más de seis ciclos de congelación/descongelación. Las muestras congeladas deben analizarse lo antes posible después de descongelarlas o guardarse en hielo (no más de cuatro horas) hasta su ensayo. Las muestras deben guardarse en una gran cantidad de hielo seco para su transporte. Las muestras que llegan descongeladas al centro de ensayo pueden estar comprometidas. Después de recibirlas, las muestras pueden conservarse a -70 C o a una temperatura inferior. 8 PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS Tras retirar los reactivos y materiales necesarios, vuelva a guardar los elementos no utilizados a la temperatura correspondiente indicada (vea la sección CONSERVACIÓN). Deje que todos los reactivos y materiales para el ensayo se estabilicen a temperatura ambiente (15 30 C) antes de su uso Solución de lavado Mezcle el concentrado de solución de lavado 20x invirtiendo el frasco varias veces. Si el concentrado de solución de lavado 20x se ha guardado a una temperatura de 2 8 C, es posible que se hayan formado cristales. Para disolver los cristales, caliente el frasco en un baño de agua de C hasta que todos los cristales se hayan disuelto y, a continuación, mézclelo bien. Prepare la solución de lavado diluyendo todo el contenido de uno de los frascos de concentrado de solución de lavado 20X, hasta un litro, con agua destilada o desionizada. Mezcle bien. La solución de lavado es estable durante 30 días si se conserva en un recipiente limpio a 2 8 C. En caso de decoloración o turbiedad, deseche el reactivo Selección de las tiras de microensayo Determine la cantidad de pocillos requeridos para el ensayo. Se recomienda realizar el ensayo de los pocillos testigo, controles y patrones por duplicado. Retire el retén de la tira de la placa montada. Retire las tiras que no necesita y colóquelas en la bolsa de conservación. Vuelva a sellar la bolsa y guárdela a 2-8 C. Fije las tiras que utilizará en el ensayo Dilución de muestras Atención: trate todas las muestras como si fueran potencialmente infecciosas. No utilice muestras inactivadas por calor o contaminadas ni muestras mal conservadas. Se requieren muestras de suero para este ensayo Las muestras de suero deben descongelarse rápidamente colocándolas brevemente en un baño de agua de 37 C. Inmediatamente después de descongelarlas, coloque las muestras en hielo hasta el paso de activación (vea la sección PROCEDIMIENTO DE ENSAYO). No diluya las muestras de ensayo antes de la activación Preparación de los controles normal y bajo Añada 100µL de agua desionizada o destilada a un vial de control normal y a un vial de control bajo liofilizados. Mezcle brevemente para asegurar su reconstitución y deje reposar durante quince (15) minutos a temperatura ambiente. Vuelva a agitar en el vórtex y coloque en hielo hasta que esté listo para el paso de activación. 9 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO Lea el prospecto del producto en su totalidad antes de iniciar el ensayo. Vea las secciones PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS y ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES antes de continuar. 9.1 Activación de muestras y controles. Mezcle el activador, que contiene partículas de fácil suspensión, haciendo girar el frasco antes de usarlo. Hágalo girar varias veces durante este paso para asegurar la suspensión de las partículas. Añada 86µL de activador a la cantidad adecuada de tubos de ensayo o pocillos de microensayo.* A continuación, añada 14µL de muestra de suero sin diluir, control normal o control bajo a los tubos de ensayo individuales o pocillos de microensayo que contienen el activador. Mezcle con cuidado. Cubra para reducir al mínimo la evaporación. Incube a 37 C durante sesenta (60) minutos. (PARA SU CONVENIENCIA: si desea agrupar las muestras en lotes, después de la activación puede guardar las muestras activadas sin diluir a 20 C o Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 12 of 14 a una temperatura inferior hasta 14 días antes de continuar con los siguientes pasos.) * La cantidad de tubos de ensayo o pocillos de microensayo requeridos para la activación es igual a la cantidad de muestras de ensayo más dos (2) para la activación de los dos controles. 9.2 Dilución de las muestras activadas y controles Después de la activación, diluya las muestras activadas y los controles activados en 1:200 con diluyente de muestras en pocillos de microensayo limpios no usados o en tubos de ensayo. 9.3 Prepare las tiras de microensayo de la siguiente forma: a. Rehidrate los pocillos de microensayo llenándolos con solución de lavado ( µL/pocillo) utilizando una botella para lavado o un dispositivo automático. b. Incube a temperatura ambiente (15-30 C) durante dos minutos. c. Elimine el líquido de cada pocillo. d. Invierta la placa y golpéela con fuerza sobre papel absorbente varias veces para eliminar todo el líquido restante. 9.4 Añada 100µL de diluyente de muestras a los pocillos duplicados que se utilizarán como pocillos testigo con el lector de placa. 9.5 Añada 100µL de cada patrón listo para usar (A E) a los pocillos duplicados. Tenga en cuenta que los patrones ya se han diluido y están listos para usar. 9.6 Añada 100µL de los controles normal y bajo activados y diluidos a los pocillos duplicados. 9.7 Añada 100µL de cada muestra diluida por duplicado a los pocillos de microensayo asignados. 9.8 Incube a temperatura ambiente (15 30 C) durante 60 ± 1 minutos. 9.9 Lave los pocillos de microensayo como se indica a continuación: Nota: no se recomienda utilizar una pipeta multicanal para este paso. a. Después de la incubación del paso 8 (o del paso 12 a continuación), elimine el líquido de cada pocillo. b. Utilizando una botella para lavado, un lavador de placas automático u otro dispositivo de lavado, llene cada pocillo con la solución de lavado ( µL/pocillo). c. Incube los pocillos durante 1 minuto a temperature ambiente (15-30 C). d. Elimine el líquido de cada pocillo. e. Llene cada pocillo con solución de lavado ( µL/pocillo). f. Elimine el líquido de cada pocillo. g. Repita los pasos e f cinco veces más. h. Después del séptimo ciclo de lavado, invierta la placa y golpéela con fuerza sobre papel absorbent varias veces para eliminar todo el líquido restante Utilizando una pipeta multicanal o de repetición, aplique 50µL de conjugado en cada pocillo de ensayo lavado, incluyendo los pocillos testigo Incube las tiras de microensayo a temperature ambiente (15 30 C) durante 60 ± 1 minutos Lave los pocillos de microensayo después de la incubación de 60 minutos, tal como se describe en el paso Inmediatamente después del procedimiento de lavado, aplique 100µL de la solución de TMB sustrato a cada pocillo, incluyendo los pocillos testigo Incube las tiras de microensayo a temperature ambiente (15 30 C) durante 15 ± 1 minutos Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción enzimática. La solución de parada debe añadirse a los pocillos en el mismo orden y a la misma velocidad que la solución de sustrato. Golpee suavemente la placa para que la formación de color sea uniforme Determine el valor de absorbancia a 450nm (valor A450) para cada pocillo de ensayo dentro de una hora después de añadir la solución de parada, realizando una corrección en blanco según el sistema espectrofotométrico en uso. No se requiere filtro de referencia Deseche las muestras diluidas restantes, el activador, los controles y las tiras de microensayo usadas (vea la sección ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES, punto 23). Conserve el soporte y el retén de la tira para su uso futuro. 10 RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD 10.1 Control de calidad Las buenas prácticas de laboratorio recomiendan el uso de controles para asegurarse de que el ensayo funciona correctamente. Cada kit de enzimoinmunoensayo de CH50 Eq de Quidel contiene controles normales y bajos que pueden utilizarse para este propósito. Estos controles deben analizarse al menos una vez por cada lote de muestras, es decir, una vez por ciclo de activación. Los controles, cuando se los utiliza según las instrucciones, deberían dar valores equivalentes a unidades CH50 dentro de los intervalos especificados en las etiquetas de sus viales. Debido a que estos controles deben activarse, diluirse y analizarse exactamente como una muestra típica, sirven como controles y muestras de referencia para cada activación y ciclo del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq. También pueden utilizarse controles externos, preparados por su laboratorio, para asegurarse de que el ensayo está funcionando correctamente. Asimismo, el prospecto del producto requiere que la curva estándar generada con los patrones A E del kit cumplan con estrictos requisitos de validación (vea la sección INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS). Los patrones deben analizarse por duplicado para cada ciclo de ensayo. Si el ensayo no cumple con estos requisitos, repítalo o póngase en contacto con el Servicio técnico de Binding Site Interpretación de los resultados Uso de la curva estándar: la curva estándar del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq se genera utilizando el valor A450 sustraído del testigo de cada patrón (en el eje Y) en función de la concentración asignada a cada patrón (en el eje X). La curva estándar generada debe cumplir con los requisitos de validación. La mayoría de los ordenadores y calculadoras es capaz de realizar este cálculo. En la Figura 1 se muestra un ejemplo de una curva estándar típica. Cálculo del nivel de CH50 U Eq real en muestras del paciente: los valores de las muestras se calculan a partir de la curva estándar utilizando análisis de regresión

13 lineal. Para las muestras de ensayo activadas y diluidas en 1:200 antes del ensayo, el valor CH50 U Eq/mL puede leers directamente de la curva estándar. Los valores (UEq/mL) de los controles normal y bajo también pueden leerse directamente de la curva estándar, ya que también se diluyeron en 1:200. A fin de obtener determinaciones de CH50 precisas para muestras de ensayo que dan valores A450 superiores a los del patrón E del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq (o que dan valores A450 inferiores a los obtenidos con el patrón A), las muestras de ensayo pueden volver a analizarse a una dilución diferente para que sus nuevos valores A450 se encuentren dentro de estos límites. En todos los ensayos repetidos también deben analizarse los patrones y los controles. Si una muestra se analiza a una dilución distinta de 1:200, el nivel de CH50 de la muestra se determina corrigiéndolo según la diferencia entre la dilución examinada y la dilución de 1:200 habitual. Por ejemplo, si una muestra se diluye a 1:100 en lugar de a 1:200 como es habitual y la curva de regresión lineal da una concentración de 100 CH50 U Eq/mL, el valor de CH50 U Eq/mL real de la muestra es de 50 (es decir, 100 CH50 U Eq/mL dividido por 2). Ejemplo de curva estándar 12 REFERENCIAS 1. Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer, M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C Thomas, 1961: Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots. Tentative Guideline, Dec NCCLS Document GP109-T, Vol. 13, No Passing, H. And W. Bablok. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. Application of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): (1983). 4. Centers for Disease Control. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001. Producido por Quidel Corp. San Diego, USA para The Binding Site Group Ltd Validación Calcule el valor CH50 U Eq/mL para los controles normal y bajo. Determine también el coeficiente de correlación (r) y la intersección Y (b) de la curva lineal de ajuste óptimo derivada para los valores obtenidos con los patrones A E. Para validar el ensayo, los valores r, b y de control deben encontrarse dentro de los siguientes intervalos: coeficiente de correlación (r): > 0,96 intersección Y (b): entre ( )0,090 y (+)0,068 pendiente (m): entre 0,0033 y 0,0089 valores de controles normal y bajo: Dentro de los intervalos indicados en las etiquetas de sus respectivos viales Limitaciones del procedimiento El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq se ha utilizado para analizar muestras recogidas como suero. Aún no se ha determinado el comportamiento clínico de las muestras de plasma preparadas con otros coagulantes. 11 VALORES ESPERADOS Se analizaron doscientas treinta y cuatro (234) muestras de suero normales y anormales con en enzimoinmunoensayo de CH50 Eq. El valor promedio obtenido con la población de muestra normal fue de 133 ± 54 CH50 U Eq/mL. A modo de orientación, el valor de corte obtenido mediante la técnica de análisis ROC (características operativas del receptor) 2 con estas muestras de suero normales y anormales de suero fue de 70 CH50 U Eq/mL. Cada laboratorio debe establecer su propio intervalo de referencia normal. Utilizando el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq, se analizaron doscientas veintiuna (221) muestras de pacientes en un laboratorio clínico de referencia importante de los Estados Unidos. Utilizando un valor de corte de 70 CH50 Eq U/mL y la técnica de análisis ROC, la exactitud general del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq, comparada con los resultados combinados de tres ensayos hemolíticos y un enzimoinmunoensayo, fue superior al 97%. Utilizando mediciones tradicionales de comportamiento clínico, el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq también dio una exactitud clínica superior al 97% con una sensibilidad del 93,2% y una especificidad del 99,4%. Utilizando el método algorítmico de Passing y Bablok 3, los valores de CH50 U Eq obtenidos con el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq mostraron una estrecha correlación con los valores de CH50 obtenidos con el ensayo hemolítico tradicional informado por el laboratorio clínico, con un nivel de significancia de p < 0, CARACTERÍSTICAS DE COMPORTAMIENTO 12.1 Precisión La precisión Intra-ensayo y Inter-ensayo fue determinada con 16 réplicas de 4 muestras de suero en 10 ciclos diferentes. Muestra Suero 1 n = 16 réplicas CH50 U Eq/mL Intra-ensayo 1 C.V. (%) n = 10 ciclos Inter-ensayo 2 C.V. (%) Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 13 of 14

14 CH50 Eq EIA Resumen Preparación del Reactivo, Control y de la Muestra Diluya la concentrado de solución de Lavado 1:20 con agua desionizada Reconstituya cada control con 100µL agua desionizada (Déjelo durante 15 minutos. Agitar en el vórtex y coloque en hielo). Procedimiento de ensayo Agite continuamente el activador durante su uso. Añada 86µL de Activador a los tubos de ensayo o pocillos de microensayo Añada 14µL de muestras y controles a los tubos de ensayo individuales o pocillos de microensayo y mezcle con cuidado Cubra los tubos de ensayo individuales o pocillos de microensayo e incubar 60 ± 1 min a 37 C (puede guardar a -20 C hasta 14 días) Diluya las muestras y los controles a 1:200 con diluyente de muestras en pocillos de microensayo limpios Añada ~ 300µL de Solución de Lavado a pocillos de ensayo Incubar 2 minutos a C Elimine el líquido de cada pocillo (Mancha seca) Añadir 100µL de: diluyente de muestra (blanco), de estándares, controles y muestras activaos en los pocillos de ensayo Incubar 60 ± 1 min a C Lave 7x con la Solución de Lavado (Incube el primer lavado durante 1min) Añada 50µL de Conjugado Incubar 60 ± 1 min a C Lave 7x con la Solución de Lavado (Incube el primer lavado durante 1min) Añada 100µL de Solución de Sustrato Incubar 15 ± 1 min a C Añada 100µL de Solución de Parada Leer densidad optica a 450nm Analice los resultados del análisis usando un ajuste linear de la curva (y = mx + b) Insert Code: E095, Version: 21 st September 2009, Page 14 of 14

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