These instructions apply to the Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+).

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1 Dako EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+) Code K4065 English Intended use For In Vitro diagnostic use. These instructions apply to the Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). This kit is intended for use with primary antibodies from mouse and rabbit supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy in normal and pathological paraffin-embedded tissues, cryostat tissues or cell preparations. Tissues processed in a variety of fixatives including ethanol, B-5, Bouin s, zinc formalin, and neutral buffered formalin may be used. Summary and explanation Principles of procedure Reagents provided The EnVision+ Dual Link System-HRP is a two-step IHC staining technique. This system is based on an HRP labelled polymer which is conjugated with secondary antibodies. The labelled polymer does not contain avidin or biotin. Consequently, nonspecific staining resulting from endogenous avidin-biotin activity in liver, kidney, lymphoid tissues and cryostat sections is eliminated or significantly reduced. All reagents in the EnVision+ Dual Link System-HRP with substrate (excluding the Liquid DAB+ Substrate-Chromogen) are ready-to-use. This system is an extremely sensitive method and, as a result, optimal dilutions of the primary antibody are up to 20 times higher than those used for the traditional PAP technique and several-fold greater than those used for the traditional ABC or LSAB methods. This protocol offers an enhanced signal generating system for the detection of antigens present in low concentrations or for low titer primary antibodies. Primary antibodies produced in mouse or rabbit react well with the labelled polymer. The interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with proper controls. Any endogenous peroxidase activity is quenched by incubating the specimen for 5 10 minutes with Dual Endogenous Enzyme Block. The specimen is then incubated with an appropriately characterized and diluted mouse or rabbit primary antibody, followed by incubation with the labelled polymer using a recommended 30 minute incubation for each. It should be noted that for antibodies requiring enzyme digestion or target retrieval, it may be necessary to increase incubation times of the primary antibody and labelled polymer by 5 10 minutes. Staining is completed by a 5 10 minute incubation with 3,3 -diaminobenzidine (DAB+) substratechromogen which results in a brown-colored precipitate at the antigen site. (DAB is a potential carcinogen; see Precautions Section.) Code K4065 The following materials, sufficient for 150 tissue sections based upon 100 µl per section, are included in this kit: Quantity 1x15 ml Description Dual Endogenous Enzyme Block 0.3% hydrogen peroxide containing sodium azide and levamisole. 1x15 ml Labelled Polymer Peroxidase labelled polymer conjugated to goat anti-mouse and goat anti-rabbit immunoglobulins in Tris-HCl buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent. 1x18 ml Substrate Buffer Substrate buffer solution, ph 7.5, containing hydrogen peroxide and a preservative. 1x1 ml DAB+ Chromogen 3,3 -diaminobenzidine chromogen solution. ( ) EFG_002_K4065/ p. 1/18

2 Materials required, but not supplied Precautions Deionized or Distilled water Ethanol, absolute and 95% Xylene, toluene or xylene substitutes Primary antibodies and negative control reagent Slides, poly-l-lysine coated or Silanized Slides (code S3003) (see Adherence of Paraffin-Embedded Tissue) Control tissue, positive and negative Ammonium hydroxide, 15 mol/l diluted to mol/l Counterstain; aqueous based, such as Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (code S3002 for automated use; code S3001 for manual use) (see Reagent Preparation Section) Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) is recommended for aqueous mounting; or nonaqueous permanent mounting medium, Ultramount (code S1964) or Permanent Mounting Medium (Code S3026) Coverslips Light microscope (20x 800x) Absorbent wipes Staining jars or baths Timer (capable of 3 40 minute intervals) Wash bottles Wash Buffer Solution, such as Automation Buffer (code S3006), TBS (code S3001) or PBS (code S3024) 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN 3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as hazardous, NaN 3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent metal azide build-up in plumbing. 3. Do not substitute reagents from other lot numbers or from kits of other manufacturers. 4. Enzymes and substrate-chromogens may be affected adversely if exposed to excessive light levels. Do not store kit components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. 5. Incubation times or temperatures other than those specified may give erroneous results; any such changes must be validated by the user As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 7. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 8. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 9. Safety Data Sheet available for professional users on request. Risk and Safety statements Liquid DAB Chromogen R40 Limited evidence of a carcinogenic effect. R43 May cause sensitization by skin contact. R68 Possible risk of irreversible effects. S35 This material and its container must be disposed of in a safe way. S36/37 Wear suitable protective clothing and gloves. As a main rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the proper work procedure, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Storage Reagents of the EnVision+ Dual Link System-HRP are to be stored at 2 8 C. Do not freeze. Do not use af ter expiration printed on reagent vials and kit label. If reagents are stored under any conditions other than those specified, the conditions must be verified by the user. 1 Alteration in the appearance of any reagent, such as precipitation, may indicate instability or deterioration. In such cases, the reagent(s) is (are) not to be used. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact Dako Technical Support. Specimen preparation Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user. For specific information regarding tissue fixation and processing, refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining. ( ) EFG_002_K4065/ p. 2/18

3 Reagent preparation Wash Buffer Solution Investigation has shown that 0.05 mol/l Tris-HCl, ph 7.6, containing 0.15 mol/l NaCl and 0.05% Tween 20, without sodium azide, significantly aids in minimizing background staining with this system. A recommended wash buffer is Automation Buffer (code S3006). Wash buffers containing sodium azide inactivate horseradish peroxidase and result in negative staining. Store unused buffer at 2 8 C. Discard buffer if cloudy in appearance. MANUAL STAINING Tissue sections should be washed in up to three fresh baths of Automation Buffer (code S3006), TBS (code S3001) or PBS (code S3024) for 3 5 minutes between each step of the EnVision+ Dual Link System staining protocol. Primary Antibody Ready-to-use antibodies for the EnVision+ Dual Link System are available from Dako. Concentrated antibodies are also available from Dako; however, optimal dilutions must be determined experimentally by the user. Due to the high sensitivity of the EnVision+ Dual Link System, primary antibody dilutions may range from 5- to 20- fold greater than those used in traditional IHC methods. If concentrated antibodies are to be used, dilutions should be prepared using Antibody Diluent (code S0809). For most primary antibodies used with this kit, an incubation time of 30 minutes is sufficient. Negative Control Reagent Ideally, a negative control reagent contains an antibody which exhibits no specific reactivity with human tissues or normal/non-immune serum in the same matrix/solution as the diluted primary antibody. The negative control reagent should be the same subclass and animal species as the primary antibody, diluted to the same immunoglobulin or protein concentration as the diluted primary antibody using the same diluent. The incubation period for the negative control reagent should correspond to the primary antibody. For convenience, a universal negative control reagent for mouse primary antibodies and universal negative control reagent for rabbit primary antibodies are available from Dako, supplied as ready-to-use products. For specific information regarding negative control reagent preparation, refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining. Substrate-Chromogen Solution The following protocol for the preparation of 1 ml of the DAB+ substrate-chromogen solution is sufficient for up to 10 tissue sections or up to 5 cell smears. STEP 1 STEP 2 Depending on the number of slides to be stained, transfer enough 1 ml aliquots of Substrate Buffer into an appropriately sized container. For each 1 ml of buffer, add one drop (20 µl) of Liquid DAB+ Chromogen. Mix immediately. The prepared DAB+ substrate-chromogen solution is stable approximately 5 days when stored at 2 8 C. This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing in the solution does not affect staining quality. Used in its entirety, the 18 ml of Substrate Buffer provided will provide adequate volume for 150 tests. An excess volume may remain. Mounting Media Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025) is recommended for aqueous mounting. For permanent mounting, use Ultramount (code S1964) or Permanent Mounting Medium (code S3026). Staining procedure Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the kit contents prior to use. See the Precautions Section. The Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution and EnVision+ Dual Link System polymer should be equilibrated to room temperature prior to immunostaining. Likewise, all incubations are optimized for performance at room temperature. The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the kit reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous results. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place tissues in a humid environment. The sensitivity of the EnVision+ Dual Link System-HRP can be further increased by lengthening the incubation times of Steps 2 and 3 for 5 10 minutes. ( ) EFG_002_K4065/ p. 3/18

4 MANUAL STAINING PROTOCOL STEP 1 ENDOGENOUS ENZYME BLOCK Tap off excess buffer. Using a lint-free tissue (such as Kimwipe or gauze pad), carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagent within the prescribed area. Apply enough Dual Endogenous Enzyme Block to cover specimen. Incubate 5 10 (±1) minutes. Rinse gently with distilled water or buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. STEP 2 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough optimally diluted primary antibody or negative control reagent to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes. Rinse gently with buffer solution from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue) and place in a fresh buffer bath. If the staining procedure must be interrupted, slides may be kept in a buffer bath following incubation of the primary antibody (Step 2) for up to one hour at room temperature without affecting the staining performance. STEP 3 LABELLED POLYMER-HRP Tap off excess buffer and wipe slides as before. Apply enough Labelled Polymer to cover specimen. Incubate 30 (±1) minutes. Rinse slides as in Step 2 and place in buffer bath for 5 (±1) minutes. STEP 4 SUBSTRATE-CHROMOGEN Wipe slides as before. Apply enough substrate-chromogen solution to cover specimen (see Reagent Preparation Section). Incubate 5 10 (±1) minutes. Rinse gently with distilled water from a wash bottle (do not focus flow directly on tissue). Collect substratechromogen waste in a hazardous materials container for proper disposal. STEP 5 HEMATOXYLIN COUNTERSTAIN (optional) Immerse slides in a bath of aqueous hematoxylin. Length of incubation depends on the strength of Hematoxylin used. Rinse gently in a distilled water bath. Dip slides 10 times into a bath of mol/l ammonia or similar bluing agent. Rinse slides in a bath of distilled or deionized water for 2 5 minutes. Proceed to mounting. Mounting Specimens may be mounted and coverslipped with an aqueous-based mounting medium such as Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025). For permanent mounting, use Ultramount (code S1964) or Permanent Mounting Medium (code S3026). Note: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are exposed to strong light over a period of one week. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20 25 C). Quality control Differences in tissue processing and technical procedures in the user s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls. Consult the quality control guidelines of the American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry and references 3 through 5 for additional information. Refer to the specification sheet of each primary antibody used for details regarding sensitivity and immunoreactivity. Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining for further information on positive and negative controls. Staining interpretation General limitations Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining for interpretation guidelines. Refer to Dako s General Instructions for Immunohistochemical Staining for general limitations. ( ) EFG_002_K4065/ p. 4/18

5 Product specific limitations Use of old or unbuffered fixatives, or exposure of tissues to excessive heat (greater than 60 C) durin g processing may result in decreased staining sensitivity. Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome, and catalase as well as in eosinophils. 2,3 This activity can be inhibited by incubating specimens with Dual Endogenous Enzyme Block of the EnVision+ Dual Link System-HRP for five to ten minutes prior to the application of the primary antibody. Blood and bone marrow smears and frozen tissues can also be treated with this reagent. Alternately, a solution of methanol-hydrogen peroxide can be used. Some antigens may become denatured with this procedure. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase. 4 Normal/non-immune sera from the same animal source as the secondary antisera used in blocking steps may cause false-negative or false-positive results due to auto-antibodies or natural antibodies. The reagents supplied in this kit have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen detection. Troubleshooting MANUAL Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of 1a. Reagents not used in 1a. Review application of reagents. any slides. proper order. 1b. Sodium azide in buffer 1b. Use fresh azide-free buffer. bath. 2. Weak staining of all slides. 2a. Sections retain too much solution after wash bath. 2a. Gently tap off excess solution before wiping around section. 2b. Slides not incubated long 2b. Review recommended incubation times. enough with antibodies or substrate. 3. Excessive background in all slides. 3a. Specimens contain high peroxidase activity. 3a. Use longer incubation time of Dual Endogenous Enzyme Block. 3b. Paraffin incompletely removed. 3b. Use fresh xylene or toluene baths. If several slides are stained simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene. 3c. Slides not properly rinsed. 3c. Use fresh solutions in buffer baths and wash bottles. Use Automation Buffer as wash buffer (see Reagent Preparation Section). 3d. Faster than normal substrate reaction due to e.g. excessive room temperature. 3e. Sections dried during staining procedure. 3f. Nonspecific binding of reagents to tissue section. 3d. Use shorter incubation time with substratechromogen solution. 3e. Use humidity chamber. Wipe only three to four slides at a time before applying reagent. 3f. Apply a blocking solution containing an irrelevant protein (see Staining Interpretation Section). 3g. Antibody too concentrated. 3g. Use higher dilution of the primary antibody. NOTE: If the problem cannot be attributed to any of the above causes, or if the suggested corrective action fails to resolve the problem, please call Dako Technical Support for further assistance. Additional information on staining techniques and specimen preparation can be found in the Handbook Immunochemical Staining Methods 5 (available from Dako), Atlas of Immunohistology 6 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 ( ) EFG_002_K4065/ p. 5/18

6 Français Utilisation prévue Réf. K4065 Pour utilisation en diagnostic in vitro. Ces instructions concernent le kit EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+) de Dako. Ce kit est conçu pour être utilisé avec des anticorps primaires de souris ou de lapin (fournis par l utilisateur) pour l identification qualitative d antigènes par microscopie optique dans différents tissus sains et pathologiques inclus en paraffine, tissus cryostat ou préparations cellulaires. Les tissus peuvent être traités à l aide de divers fixateurs : éthanol, B-5, liquide de Bouin, zinc-formol et formol neutre tamponné. Résumé et explication Principes de la procédure Réactifs fournis Le kit EnVision+ Dual Link System-HRP est une technique de coloration par IHC à deux étapes. Ce système repose sur l utilisation d un polymère marqué à la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à des anticorps secondaires. Le polymère marqué ne contient pas d avidine ou de biotine. Par conséquent, la coloration non spécifique due à l activité avidine-biotine endogène dans le foie, le rein, les tissus lymphoïdes et les coupes cryostat est éliminée ou réduite de manière significative. Tous les réactifs du kit EnVision+ Dual Link System- HRP avec substrat (à l exception du Liquid DAB+ Substrate-Chromogen) sont prêts à l emploi. Ce système est une méthode extrêmement sensible. Par conséquent, les dilutions optimales de l anticorps primaire sont jusqu à 20 fois plus élevées que celles utilisées pour la technique PAP classique, et plusieurs fois plus élevées que celles utilisées pour les méthodes ABC ou LSAB traditionnelles. Ce protocole comporte une fonction de génération d un signal amélioré pour la détection des antigènes présents à de faibles concentrations ou pour les anticorps primaires à faible titre. Les anticorps primaires de souris ou de lapin réagissent bien avec le polymère marqué. L interprétation de toute coloration positive ou absence de coloration doit être complétée par des analyses morphologiques et histologiques utilisant les contrôles adaptés. Toute activité de peroxydase endogène est inhibée en incubant l échantillon avec du Dual Endogenous Enzyme Block pendant 5 à 10 minutes. L échantillon est alors incubé avec un anticorps primaire de souris ou de lapin caractérisé et dilué de manière appropriée, puis incubé avec le polymère marqué, via une incubation recommandée de 30 minutes pour chaque. Il convient de noter que si vous utilisez des anticorps nécessitant une digestion enzymatique ou un démasquage des cibles, il peut être nécessaire d augmenter les temps d incubation de l anticorps primaire et du polymère marqué de 5 à 10 minutes. La coloration se termine par une incubation de 5 à 10 minutes avec un substrat chromogène 3,3 -diaminobenzidine (DAB+) qui entraîne un précipité brun sur le site de l antigène. (Le DAB est un produit potentiellement cancérigène, voir la section «Précautions»). Réf. K4065 Le kit comprend les matériels suivants, en quantité suffisante pour 150 coupes de tissus, sur la base de 100 µl par coupe : Quantité Description 1 x 15 ml Dual Endogenous Enzyme Block Peroxyde d hydrogène à 0,3 % contenant de l azide de sodium et du lévamisole. 1 x 15 ml Polymère marqué Polymère marqué à la peroxydase conjugué à des immunoglobulines de chèvre anti-souris et anti-lapin, dans du tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien. 1 x 18 ml Tampon substrat Solution de tampon substrat, de ph 7,5, contenant du peroxyde d'hydrogène et un conservateur. 1 x 1 ml Chromogène DAB+ Solution de chromogène 3,3'-diaminobenzidine. ( ) EFG_002_K4065/ p. 6/18

7 Matériels requis mais non fournis Précautions Eau déionisée ou distillée Éthanol, absolu et à 95 % Xylène, toluène ou substituts de xylène Anticorps primaires et réactif de contrôle négatif Lames, revêtues de poly-l-lysine ou Silanized Slides (réf. S3003) (voir «Adhérence des tissus inclus en paraffine») Tissu de contrôle, positif et négatif Hydroxyde d ammonium, 15 mol/l, dilué à 0,037 mol/l Contre-colorant avec base aqueuse, de type Mayer s Hematoxylin (hématoxyline de Mayer) ou Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (hématoxyline de Mayer modifiée par Lillie) (réf. S3002 pour un usage automatisé ; réf. S3001 pour un usage manuel) (voir la section «Préparation des réactifs») Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (réf. S3025) recommandé pour le montage aqueux ; ou milieu de montage permanent non aqueux, Ultramount (réf. S1964) ou Permanent Mounting Medium (réf. S3026) Lamelles de protection Microscope optique (20x 800x) Lingettes absorbantes Cuves de coloration Chronomètre (pouvant accepter des intervalles de 3 à 40 minutes) Flacons de lavage Solution de tampon de lavage, telle que l Automation Buffer (réf. S3006), le TBS (réf. S3001) ou le PBS (réf. S3024) 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l azide de sodium (NaN 3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l azide de sodium (NaN 3) peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l élimination, rincer abondamment à l eau pour éviter toute accumulation d azide métallique dans les canalisations. 3. Ne pas utiliser de réactifs portant un autre numéro de lot ou provenant de kits d autres fabricants. 4. Les enzymes et les substrats chromogènes peuvent être endommagés s ils sont exposés à une lumière excessive. Ne pas stocker les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière directe du soleil. 5. Des temps ou des températures d incubation autres que ceux indiqués peuvent produire des résultats erronés et doivent être validés par l utilisateur Comme avec tout produit d origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées. 7. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau. 8. Les solutions inutilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. 9. La Fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. Déclarations de risque et de sécurité Chromogène DAB liquide R40 Effet cancérogène suspecté sans preuves suffisantes. R43 Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. R68 Risque d effets irréversibles. S35 Les procédures de sécurité doivent toujours être respectées pour jeter ce produit et son récipient. S36/37 Porter un vêtement de protection et des gants appropriés. En règle générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne doivent pas utiliser ce produit. Les utilisateurs doivent avoir reçu des instructions concernant la bonne procédure de travail à suivre, les propriétés dangereuses du produit et les instructions de sécurité nécessaires. Conservation Les réactifs du kit EnVision+ Dual Link System-HRP doivent être conservés entre 2 et 8 C. Ne pas cong eler. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur les flacons de réactifs et l étiquette du kit. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées, celles-ci doivent être validées par l utilisateur. 1 Une modification de l apparence d un réactif, tel un précipité, peut indiquer une instabilité ou une détérioration du produit. Dans ce cas, ne pas utiliser le(s) réactif(s). Il n y a aucun signe évident indiquant l instabilité de ces produits. Par conséquent, les contrôles positif et négatif doivent être testés en même temps que les échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d un problème dans le kit, contacter l assistance technique Dako. ( ) EFG_002_K4065/ p. 7/18

8 Préparation des échantillons Préparation des réactifs Avant la coloration IHC, les tissus doivent être fixés et traités. Leur fixation empêche l autolyse et la putréfaction des tissus excisés, préserve l antigénicité, améliore l indice de réfraction des composants tissulaires et accroît la résistance des éléments cellulaires au traitement des tissus. Le traitement des tissus inclut la déshydratation, l élimination des agents déshydratants, l infiltration du milieu d inclusion, l inclusion et la coupe des tissus. Il ne s agit là que de conseils. Les procédures optimales doivent être déterminées et vérifiées par l utilisateur. Consulter les «Instructions générales de coloration immunohistochimique» de Dako pour des informations spécifiques sur la fixation et le traitement des tissus. Solution de tampon de lavage Des recherches ont montré que le tampon Tris-HCl à 0,05 mol/l, de ph 7,6, contenant du NaCl à 0,15 mol/l et du Tween 20 à 0,05 %, sans azide de sodium, facilite de manière significative la réduction du bruit de fond avec ce système. L Automation Buffer (réf. S3006) est recommandé comme tampon de lavage. Les tampons de lavage contenant de l azide de sodium inactivent la peroxydase de raifort et entraînent une coloration négative. Conserver le tampon inutilisé entre 2 et 8 C. Jeter le tampon s il semble trouble. COLORATION MANUELLE Les coupes de tissus doivent être rincées dans un à trois bains d Automation Buffer (réf. S3006), de TBS (réf. S3001) ou de PBS (réf. S3024) pendant 3 à 5 minutes entre chaque étape du protocole de coloration du EnVision+ Dual Link System. Anticorps primaire Des anticorps prêts à l emploi pour l EnVision+ Dual Link System sont disponibles auprès de Dako. Des anticorps concentrés sont également disponibles auprès de Dako ; cependant, l utilisateur devra déterminer expérimentalement leurs dilutions optimales. Dû à la haute sensibilité du EnVision+ Dual Link System, les dilutions des anticorps primaires peuvent être 5 à 20 plus élevées que celles utilisées dans les méthodes d IHC traditionnelles. Si vous devez utiliser des anticorps concentrés, les dilutions doivent être préparées avec l Antibody Diluent (réf. S0809). Pour la plupart des anticorps primaires utilisés avec ce kit, une durée d incubation de 30 minutes est suffisante. Réactif de contrôle négatif Dans l idéal, un réactif de contrôle négatif contient un anticorps qui ne présente pas de réactivité spécifique avec les tissus humains ou avec le sérum normal/non immun dans la même matrice/solution que l anticorps primaire dilué. Le réactif de contrôle négatif doit provenir de la même espèce et sous-espèce animale que l anticorps primaire et être dilué à la même concentration en immunoglobulines ou protéines que l anticorps primaire dilué, à l'aide du même diluant. La période d'incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l'anticorps primaire. Dans un souci pratique, un réactif de contrôle négatif universel pour les anticorps primaires de souris et un réactif de contrôle négatif universel pour les anticorps primaires de lapin sont disponibles auprès de Dako et sont fournis prêts à l emploi. Consulter les «Instructions générales de coloration immunohistochimique» de Dako pour des informations spécifiques sur la préparation des réactifs de contrôle négatif. Solution de substrat chromogène Le protocole suivant pour la préparation de 1 ml de solution de substrat chromogène DAB+ est suffisante pour un maximum de 10 coupes de tissus ou un maximum de 5 frottis cellulaires. ÉTAPE 1 En fonction du nombre de lames à colorer, transférer des aliquotes de 1 ml de tampon substrat dans un récipient de taille appropriée. ÉTAPE 2 Pour chaque 1 ml de tampon, ajouter 1 goutte (20 µl) de chromogène DAB+ liquide. Mélanger immédiatement. La solution de substrat-chromogène DAB+ ainsi préparée est stable environ 5 jours lorsqu elle est conservée entre 2 et 8 C. Cette solution doit être mélangée vigoureusement avant utilisation. La formation d un précipité dans la solution n'affecte pas la qualité de la coloration. S il est complètement utilisé, le tampon substrat de 18 ml fourni sera suffisant pour 150 tests. Il se peut qu il reste un volume en excès. Milieu de montage Le milieu de montage Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (réf. S3025) est recommandé pour le montage aqueux. Pour un montage permanent, utiliser l Ultramount (réf. S1964) ou le Permanent Mounting Medium (réf. S3026). ( ) EFG_002_K4065/ p. 8/18

9 Procédure de coloration Remarques sur la procédure L utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec le contenu du kit avant utilisation. Voir la section «Précautions». La solution Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution et le polymère du EnVision+ Dual Link System doivent être portés à température ambiante avant la procédure immunologique de coloration. De même, toutes les incubations sont optimisées pour être effectuées à température ambiante. Les réactifs fournis dans ce kit et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs du kit, ainsi que toute modification des temps ou températures d incubation, peuvent produire des résultats erronés. Ne pas laisser les lames sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Couvrir les lames exposées aux courants d'air. Si les durées d incubation sont prolongées, placer les tissus dans un environnement humide. La sensibilité du kit EnVision+ Dual Link System-HRP peut être augmentée en allongeant la durée d'incubation des étapes 2 et 3 de 5 à 10 minutes. PROTOCOLE DE COLORATION MANUEL ÉTAPE 1 AGENT BLOQUANT LES ENZYMES ENDOGÈNES Tapoter pour enlever l excès de tampon. Avec un tissu non pelucheux (ex. : Kimwipe ou gaze), essuyer avec précaution autour de l échantillon pour enlever tout liquide restant et maintenir le réactif dans la zone indiquée. Appliquer suffisamment de Dual Endogenous Enzyme Block pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 5 à 10 minutes (±1 minute). Rincer doucement à l eau distillée ou avec une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé. ÉTAPE 2 ANTICORPS PRIMAIRE OU RÉACTIF DE CONTRÔLE NÉGATIF Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d anticorps primaire à dilution optimale ou de réactif de contrôle négatif pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 30 minutes (±1 minute). Rincer doucement avec une solution tampon contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé. Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être maintenues dans un bain de tampon après incubation de l anticorps primaire (étape 2) pendant une heure maximum à température ambiante sans que cela n affecte les performances de la coloration. ÉTAPE 3 POLYMÈRE MARQUÉ À LA HRP Tapoter pour enlever l excès de tampon et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de polymère marqué pour recouvrir l échantillon. Incuber pendant 30 minutes (±1 minute). Rincer les lames de la même façon qu à l étape 2 puis les placer dans un bain de tampon pendant 5 minutes (±1 minute). ÉTAPE 4 SUBSTRAT-CHROMOGÈNE Essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de solution de substrat chromogène pour recouvrir l échantillon (voir la section «Préparation des réactifs»). Incuber pendant 5 à 10 minutes (±1 minute). Rincer doucement avec de l eau distillée contenue dans un flacon de lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus). Recueillir les déchets du substrat chromogène dans un conteneur pour déchets dangereux pour les éliminer de manière appropriée. ÉTAPE 5 CONTRE-COLORATION À L HÉMATOXYLINE (facultatif) Immerger les lames dans un bain d'hématoxyline aqueuse. La durée d incubation dépend de la puissance de l hématoxyline utilisée. Rincer doucement dans un bain d eau distillée. Tremper les lames 10 fois dans un bain d ammoniaque à 0,037 mol/l ou d un agent de bleuissement similaire. Rincer les lames dans un bain d eau distillée ou déionisée pendant 2 à 5 minutes. Procéder au montage. Montage Les échantillons peuvent être montés et recouverts d une lamelle en utilisant un milieu de montage aqueux de type Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (réf. S3025). Pour un montage permanent, utiliser l Ultramount (réf. S1964) ou le Permanent Mounting Medium (réf. S3026). Remarque : les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont exposées à une lumière vive pendant plus d une semaine. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l obscurité à température ambiante (20 25 C). ( ) EFG_002_K4065/ p. 9/18

10 Contrôle de qualité Les différences dans les procédures techniques et le traitement des tissus du laboratoire peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers. Consulter les consignes de contrôle de qualité de l American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry et les références 3 à 5 pour plus d informations. Consulter la fiche technique de chaque anticorps primaire utilisé pour plus de détails concernant la sensibilité et l immunoréactivité. Consulter les «Instructions générales de coloration immunohistochimique» de Dako pour plus d informations sur les contrôles positifs et négatifs. Interprétation de la coloration Limites générales Limites spécifiques au produit Consulter les «Instructions générales de coloration immunohistochimique» de Dako pour les consignes d interprétation. Consulter les «Instructions générales de coloration immunohistochimique» de Dako pour les limites générales. L utilisation de fixateurs périmés ou non tamponnés, ou l exposition des tissus à une température excessive (supérieure à 60 C) au cours du traitement peut ré duire la sensibilité de coloration. Une activité peroxydasique ou pseudoperoxydasique endogène peut se manifester dans les hémoprotéines telles que l'hémoglobine, la myoglobine, les cytochromes et la catalase, ainsi que dans les éosinophiles. 2,3 Cette activité peut être inhibée en incubant les échantillons avec le Dual Endogenous Enzyme Block du kit EnVision+ Dual Link System-HRP pendant cinq à dix minutes avant application de l anticorps primaire. Les frottis sanguins et médullaires, ainsi que les coupes de tissus congelés peuvent également être traités en utilisant ce réactif. Il est également possible d utiliser une solution de méthanol-peroxyde d hydrogène. Certains antigènes peuvent être dénaturés au cours de cette procédure. Les tissus de patients infectés par le virus de l hépatite B et porteurs de l antigène de surface de l hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort. 4 Des sérums normaux/non immuns provenant de la même source animale que les antisérums secondaires utilisés dans les étapes de blocage peuvent générer des faux négatifs ou des faux positifs du fait des auto-anticorps ou des anticorps naturels. Les réactifs fournis dans ce kit sont dilués de manière optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de détection des antigènes. ( ) EFG_002_K4065/ p. 10/18

11 Dépannage MANUEL Problème Cause probable Action recommandée 1. Coloration 1a. Les réactifs n ont pas été 1a. Revoir l application des réactifs. d aucune lame. utilisés dans l ordre. 1b. Azide de sodium dans un 1b. Utiliser un nouveau tampon sans azide. 2. Coloration faible de toutes les lames. 3. Bruit de fond excessif sur toutes les lames. bain de tampon. 2a. Les coupes conservent trop de solution après un bain de lavage. 2b. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou le substrat. 3a. Les échantillons présentent une forte activité peroxydasique. 3b. La paraffine n a pas été complètement enlevée. 3c. Les lames ne sont pas bien rincées. 3d. La réaction du substrat est plus rapide que la normale du fait, par exemple, d une température ambiante trop élevée. 3e. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration. 3f. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus. 2a. Tapoter doucement pour éliminer l excès de solution avant d essuyer autour des coupes. 2b. Revoir les temps d incubation recommandés. 3a. Augmenter la durée d incubation du Dual Endogenous Enzyme Block. 3b. Utiliser de nouveaux bains de xylène ou de toluène. Si plusieurs lames se colorent en même temps, le second bain de xylène doit contenir du xylène fraîchement renouvelé. 3c. Utiliser de nouvelles solutions dans les bains de tampon et les flacons de lavage. Utiliser l Automation Buffer comme tampon de lavage (voir la section «Préparation des réactifs»). 3d. Raccourcir le temps d incubation avec la solution de substrat chromogène. 3e. Utiliser une chambre humide. Essuyer seulement trois à quatre lames en même temps avant d appliquer le réactif. 3f. Appliquer une solution de blocage contenant une protéine non pertinente (voir la section «Interprétation de la coloration»). 3g. Anticorps trop concentré. 3g. Utiliser une dilution plus élevée de l anticorps primaire. REMARQUE : si le problème ne peut pas être attribué à l une des causes mentionnées ci-dessus, ou si l action corrective échoue, appeler l assistance technique de Dako pour obtenir de l aide. Pour plus d informations sur les techniques de coloration et la préparation des échantillons, consulter les ouvrages Handbook - Immunochemical Staining Methods 5 (disponibles auprès de Dako), Atlas of Immunohistology 6 et Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 ( ) EFG_002_K4065/ p. 11/18

12 Deutsch Code-Nr. K4065 Verwendungszweck Zur In-vitro-Diagnostik. Diese Anweisungen gelten für Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). Dieses Kit dient zur qualitativen Identifizierung von Antigenen in normalen und pathologischen paraffineingebetteten Geweben, Kryostatgeweben und Zellpräparaten durch Lichtmikroskopie unter Verwendung vom Anwender bereitgestellter primärer Maus- bzw. Kaninchen-Antikörper. Es können Gewebe verwendet werden, die mit unterschiedlichen Fixiermitteln wie Ethanol, B-5, Bouin-Lösung, Zink-Formalin und neutralem gepuffertem Formalin behandelt wurden. Zusammenfassung und Erklärung Verfahrensprinzip Mitgelieferte Reagenzien EnVision+ Dual Link System-HRP ist ein aus zwei Schritten bestehendes IHC-Färbeverfahren. Das System beruht auf einem HRP-markierten Polymer, das an sekundäre Antikörper konjugiert ist. Das markierte Polymer enthält weder Avidin noch Biotin. Deshalb werden unspezifische Färbungen aus endogenen Avidin-Biotin- Aktivitäten in Leber, Niere, Lymphgewebe und Gefrierschnitten eliminiert oder bedeutend abgeschwächt. Alle Reagenzien für EnVision+ Dual Link System-HRP sind gebrauchsfertig (ausgenommen das Liquid DAB+ Substratchromogen). Dieses System ist äußerst empfindlich, daher sind optimale Verdünnungen des primären Antikörpers bis zu 20mal höher als Verdünnungen, die für herkömmliche PAP-Verfahren verwendet werden, und um mehrere Male höher als die herkömmlichen ABC- oder LSAB-Verfahren. Dieses Verfahren bietet eine verbesserte Signalerzeugung, um Antigene in geringen Konzentrationen oder in geringem primärem Antikörpertiter nachzuweisen. In Mäusen bzw. Kaninchen erzeugte primäre Antikörper reagieren gut mit dem markierten Polymer. Die Auswertung vorhandener oder fehlender Färbungen sollte durch morphologische und histologische Untersuchungen mit entsprechenden Kontrollen ergänzt werden. Durch eine 5 10 Minuten lange Inkubation der Probe mit Dual Endogenous Enzyme Block wird jegliche Aktivität endogener Peroxidase unterdrückt. Die Probe wird dann mit einem gekennzeichneten und verdünnten primären Maus- bzw. Kaninchen-Antikörper und anschließend mit dem markierten Polymer jeweils 30 Minuten inkubiert. Bei Antikörpern, die eine Enzymandauung oder eine Demaskierung erfordern, kann die erforderliche Inkubationszeit des primären Antikörpers und des markierten Polymers um 5 bis 10 Minuten länger sein. Eine fünf- bis zehnminütige Inkubation mit 3,3 -Diaminobenzidin (DAB+) Substratchromogen schließt die Färbung ab, die sich als braun gefärbtes Präzipitat am Ort des Antigens darstellt. (DAB ist potenziell karzinogen, siehe Abschnitt Vorsichtsmaßnahmen). Code-Nr. K4065 Die folgenden Materialien sind in diesem Kit enthalten und reichen für 150 Gewebeschnitte, berechnet für 100 µl pro Schnitt. Menge Beschreibung 1 x 15 ml Dual Endogenous Enzyme Block 0,3 % Wasserstoffperoxid, enthält Natriumazid und Levamisol. 1 x 15 ml Labelled Ploymer (Markiertes Polymer) Mit Peroxidase markiertes Polymer, konjugiert mit Anti-Maus- und Anti-Kaninchen- Immunglobulinen (Ziege) in Tris-HCl-Puffer mit Stabilisierungsproteinen und einem antimikrobiellen Wirkstoff. 1 x 18 ml Substratpuffer Substratpufferlösung, ph 7,5, enthält Wasserstoffperoxid und Konservierungsmittel. 1 x 1 ml DAB+ Chromogen 3,3'-Diaminobenzidin-Chromogenlösung. ( ) EFG_002_K4065/ p. 12/18

13 Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien Vorsichtsmaßnahmen Entionisiertes oder destilliertes Wasser Ethanol, absolut und 95 % Xylol, Toluol oder Xylolersatz Primäre Antikörper und Negativkontrolle Objektträger, mit Poly-L-Lysin beschichtet oder Silanized Slides (Code-Nr. S3003) (siehe Haftung paraffineingebetteter Gewebeschnitte) Kontrollgewebe, positiv und negativ Ammoniakhydroxid, 15 mol/l, verdünnt auf 0,037 mol/l Gegenfärbung auf wässriger Basis wie Mayer-Hämatoxylin oder Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (Code- Nr. S3002 für automatisierte, Code-Nr. S3001 für manuelle Verfahren) (siehe Abschnitt Reagenzvorbereitung) Zur Fixierung im wässrigen Medium wird Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (Code-Nr. S3025), zur nicht-wässrigen permanenten Fixierung Ultramount (Code-Nr. S1964) oder Permanent Mounting Medium (Code-Nr. S3026) empfohlen. Deckgläser Lichtmikroskop (20x 800x) Absorbierende Tücher Färbeschalen oder Bäder Zeitmesser (muss Intervalle von 3 40 Minuten anzeigen können) Waschflaschen Waschpufferlösung, z.b. as Automation Buffer (Code-Nr. S3006), TBS (Code-Nr. S3001) oder PBS (Code-Nr. S3024) 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN 3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN 3 können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen. 3. Keine Reagenzien aus anderen Chargen oder aus Kits anderer Hersteller verwenden. 4. Zu starke Lichteinstrahlung kann für Enzyme und Substrat-Chromogene schädlich sein. Keine Komponenten des Kits bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie z.b. direktem Sonnenlicht, vornehmen. 5. Andere als die angegebenen Inkubationszeiten und -temperaturen können zu fehlerhaften Ergebnissen führen; solche Abänderungen müssen vom Anwender bestätigt werden Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend gehandhabt werden. 7. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 8. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. 9. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich. Risiko- und Sicherheitsangaben Liquid DAB Chromogen R40 Krebserregende Wirkung nicht auszuschließen. R43 Sensibilisierung durch Kontakt mit der Haut möglich. R68 Irreversible Schäden möglich. S35 Abfälle und Behälter müssen auf sichere Weise entsorgt werden. S36/37 Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzkleidung tragen. Personen unter 18 Jahren dürfen mit diesem Produkt grundsätzlich nicht arbeiten. Alle Anwender müssen sorgfältig in das richtige Arbeitsverfahren, die gefährlichen Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen eingewiesen werden. Aufbewahrung Reagenzien des EnVision+ Dual Link System-HRP bei 2 8 C aufbewahren. Nicht einfrieren. Nach Ablauf de s auf den Reagenzgläsern oder Kit-Etiketten aufgedruckten Datums nicht mehr verwenden. Werden die Reagenzien nicht entsprechend den angegebenen Bedingungen aufbewahrt, müssen die Bedingungen vom Anwender geprüft werden. 1 Veränderungen der Reagenzien wie z.b. Präzipitate deuten auf Instabilität oder Produktzerfall hin. In solchen Fällen das Reagenz/die Reagenzien nicht mehr verwenden. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Positiv- und Negativkontrollen sollten daher zum gleichen Zeitpunkt wie die Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht aus Unterschieden bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem Kit hindeutet, muss der technische Kundendienst von Dako verständigt werden ( ) EFG_002_K4065/ p. 13/18

14 Vorbereitung der Probe Vorbereitung der Reagenzien Vor der IHC-Färbung muss das Gewebe fixiert und verarbeitet werden. Eine Fixierung schützt vor Autolyse und Zerfall des exzidierten Gewebes, erhält die Antigenität, verstärkt den Refraktionsindex der Gewebeteile und steigert die Resistenz der Zellelemente gegen Gewebeverarbeitung. Zur Gewebeverarbeitung gehört Dehydrierung, Abscheidung von Dehydrierungsmitteln, Infiltration des Einbettungsmediums, Einbetten und Schneiden des Gewebes. Diese Angaben sind nur Richtlinien. Optimale Verfahren müssen vom Anwender selbst ermittelt und verifiziert werden. Spezielle Angaben zur Gewebefixierung und -verarbeitung bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako entnehmen. Waschpufferlösung Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass 0,05 mol/l Tris-HCl, ph 7,6, mit 0,15 mol/l NaCl und 0,05% Tween 20, ohne Natriumazid, die Hintergrundfärbung bei diesem System deutlich reduziert. Als Waschpuffer wird Automation Buffer (Code-Nr. S3006) empfohlen. Natriumazid-haltige Waschpuffer inaktivieren die Meerrettichperoxidase (HRP) und haben eine negative Färbung zur Folge. Nicht verwendeten Puffer bei 2 8 C aufbewahren. Getrübten Puffer verwerfen. MANUELLES FÄRBEVERFAHREN Gewebeschnitte zwischen den einzelnen Schritten des EnVision+ Dual Link System-Färbeprotokolls bis zu dreimal 3 5 Minuten in frischem Automation Buffer (Code-Nr. S3006), TBST (Code-Nr. S3001) oder PBS (Code-Nr. S3024) spülen. Primärer Antikörper Gebrauchsfertige Antikörper für das EnVision+ Dual Link System sind von Dako erhältlich. Konzentrierte Antikörper sind ebenfalls über Dako erhältlich, allerdings sind optimale Verdünnungen vom Anwender experimentell zu bestimmen. Das EnVision+ Dual Link System ist sehr empfindlich, daher können optimale Verdünnungen des primären Antikörpers 5 20fach höher sein als bei herkömmlichen IHC-Verfahren. Bei Verwendung konzentrierter Antikörper die Verdünnungen mit Antibody Diluent (Code-Nr. S0809) ansetzen. Für die meisten der mit diesem Kit verwendeten primären Antikörper ist eine Inkubationszeit von 30 Minuten ausreichend. Negativkontrolle Ein negatives Kontrollreagenz enthält im Idealfall entweder einen Antikörper, der keine spezifische Reaktivität mit menschlichen Geweben aufweist, oder normales/nichtimmunes Serum in der gleichen Grundsubstanz/Lösung wie der verdünnte primäre Antikörper. Die Negativkontrolle sollte der gleichen Unterklasse und Tierart entstammen wie der primäre Antikörper und mit demselben Lösungsmittel auf dieselbe Immunglobulin- oder Proteinkonzentration wie dieser verdünnt sein. Die Inkubationszeit für die Negativkontrolle sollte mit der für den primären Antikörper übereinstimmen. Der Einfachheit halber ist eine universelle Negativkontrolle sowohl für die primären Maus- als auch Kaninchen-Antikörper gebrauchsfertig von Dako erhältlich. Spezielle Angaben zum Ansetzen der Negativkontrolle bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako entnehmen. Substratchromogenlösung Das nachstehende Protokoll für das Ansetzen von 1 ml DAB+ Substratchromogenlösung ist für bis zu 10 Gewebeschnitte oder bis zu 5 Zellausstriche ausreichend. SCHRITT 1 Je nach Anzahl der zu färbenden Objektträger eine hinreichende Menge an Substratpuffer- Aliquoten von 1 ml in ein Gefäß von geeigneter Größe einfüllen. SCHRITT 2 Für jeden Milliliter (1 ml) Puffer einen Tropfen (20 µl) Liquid DAB Chromogen zugeben. Sofort mischen. Die angesetzte DAB+ Substratchromogenlösung ist bei Aufbewahrung zwischen 2 8 C etwa fünf Tage stabil. Das Reagenz vor Gebrauch gründlich mischen. Die Qualität der Färbung wird durch ein in der Lösung auftretendes Präzipitat nicht beeinträchtigt. Insgesamt sind die gelieferten 18 ml Substratpuffer für 150 Tests ausreichend. Es kann ein Rest übrig bleiben. Fixiermittel Zur wässrigen Fixierung wird Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code-Nr. S3025) empfohlen. Für die permanente Fixierung werden Ultramount (Code-Nr. S1964) oder Permanent Mounting Medium (Code-Nr. S3026) empfohlen. ( ) EFG_002_K4065/ p. 14/18

15 Färbeverfahren Hinweise Vor der Verwendung sollte der Anwender diese Anweisungen sorgfältig durchlesen und sich mit dem Inhalt des Kits vertraut machen. Siehe Abschnitt Vorsichtsmaßnahmen. Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution und das EnVision+ Dual Link System-Polymer vor dem Immunfärbeverfahren Raumtemperatur annehmen lassen. Auch alle Inkubationen sind für die Durchführung bei Raumtemperatur optimiert. Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationszeiten können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Gewebeschnitte dürfen während der Färbung nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Dem Luftzug ausgesetzte Objektträger abdecken. Falls längere Inkubationszeiten erforderlich sind, die Gewebe in eine feuchte Umgebung stellen. Die Sensitivität des EnVision+ Dual Link System-HRP kann durch eine Verlängerung der Inkubationszeiten bei den Schritten 2 und 3 um 5 10 Minuten weiter gesteigert werden. PROTOKOLL FÜR MANUELLE FÄRBUNG SCHRITT 1 ENDOGEN-ENZYM-HEMMER Überschüssigen Puffer abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (z.b. Kimwipe oder Gaze) sorgfältig den Bereich um die Probe herum abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und um das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu behalten. Genügend Dual Endogenous Enzyme Block zugeben, um die Probe zu bedecken (±1) Minuten inkubieren. Mit destilliertem Wasser oder Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) vorsichtig spülen und in ein frisches Pufferbad legen. SCHRITT 2 PRIMÄRER ANTIKÖRPER ODER NEGATIVKONTROLLE Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend optimal verdünnten primären Antikörper oder Negativkontrolle zugeben, um die Probe abzudecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Mit Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) vorsichtig spülen und in ein frisches Pufferbad legen. Falls das Färbeverfahren unterbrochen werden muss, können Objektträger nach der Inkubation des primären Antikörpers (Schritt 2) bis zu einer Stunde bei Raumtemperatur in einem Pufferbad belassen werden, ohne dass die Färbung beeinträchtigt wird. SCHRITT 3 MARKIERTE POLYMER-HRP Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend markiertes Polymer zugeben, um die Probe zu bedecken. 30 (±1) Minuten inkubieren. Objektträger wie in Schritt 2 spülen und 5 (±1) Minuten in ein Pufferbad einlegen. SCHRITT 4 SUBSTRATCHROMOGEN Objektträger wie zuvor abwischen. Eine ausreichende Menge Substratchromogenlösung zugeben, um die Probe zu bedecken (siehe Abschnitt Reagenzvorbereitung) (±1) Minuten inkubieren. Mit destilliertem Wasser aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das Gewebe richten) vorsichtig spülen. Abfallprodukte des Substratchromogens in einem Sondermüllbehälter auffangen und entsprechend entsorgen. SCHRITT 5 GEGENFÄRBUNG MIT HÄMATOXYLIN (optional) Objektträger in ein Bad mit wässrigem Hämatoxylin eintauchen. Die Inkubationsdauer richtet sich nach der Stärke der verwendeten Hämatoxylinlösung. Vorsichtig in einem Bad mit destilliertem Wasser spülen. Objektträger zehnmal in ein Bad mit 0,037 mol/l Ammoniak oder ähnlichem Bläuungsmittel tauchen. Objektträger 2 5 Minuten in einem Bad mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. Mit der Fixierung fortfahren. Fixierung Proben können mit wässrigen Fixiermitteln wie Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code- Nr. S3025). fixiert und abgedeckt werden. Für die permanente Fixierung werden Ultramount (Code-Nr. S1964) oder Permanent Mounting Medium (Code-Nr. S3026) empfohlen. Hinweis: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Es kann jedoch zu einem Verblassen kommen, wenn die Objektträger mehr als eine Woche lang starker Lichteinwirkung ausgesetzt sind. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20 25 C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden. ( ) EFG_002_K4065/ p. 15/18

16 Qualitätskontrolle Da Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und technischen Verfahren im Labor des Anwenders zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen können, müssen regelmäßige Leistungskontrollen vor Ort durchgeführt werden. Weitere Informationen siehe Richtlinien zur Qualitätskontrolle des American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry und Literaturhinweise 3 bis 5. Weitere Angaben zu Sicherheit und Immunreaktivität sind dem Sicherheitsdatenblatt jedes verwendeten primären Antikörpers zu entnehmen. Weitere Informationen über Positiv- und Negativkontrollen bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako entnehmen. Auswertung der Färbung Allgemeine Beschränkungen Produktspezifische Beschränkungen Richtlinien zur Auswertung bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako entnehmen. Allgemeine Beschränkungen bitte den Allgemeinen Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung von Dako entnehmen. Alte oder nicht gepufferte Fixiermittel oder die Einwirkung hoher Temperaturen auf das Gewebe (höher als 60 C) während des Verfahrens können zu einer verri ngerten Sensitivität der Färbung führen. In Hämoproteinen wie Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom und Katalase sowie in eosinophilen Zellen kann endogene Peroxidase-Aktivität oder Pseudoperoxidase-Aktivität auftreten. 2,3 Diese Wirkungen können durch eine fünfminütige Inkubation der Proben mit Dual Endogenous Enzyme Block des EnVision+ Dual Link System-HRP vor Zugabe des primären Antikörpers vermieden werden. Auch Blut- bzw. Knochenmarkabstriche und gefrorenes Gewebe eignen sich für eine Behandlung mit diesem Reagenz. Als Alternative kann eine Methanol-Wasserstoffperoxidlösung verwendet werden. Einige Antigene können bei diesem Verfahren denaturiert werden. Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B-Virus- Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen. 4 Normale/nichtimmune Sera desselben tierischen Ursprungs wie die in den Blockierungsschritten verwendeten sekundären Antisera können durch Auto-Antikörper oder natürliche Antikörper zu falsch negativen oder falsch positiven Ergebnissen führen. Die in diesem Kit gelieferten Reagenzien wurden optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu vermindertem Antigennachweis führen. ( ) EFG_002_K4065/ p. 16/18

17 Fehlersuche und -behebung MANUELL Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der Objektträger 1a. Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet. 1a. Reagenzienverwendung überprüfen 2. Schwache Färbung aller Objektträger. 3. Übermäßige Hintergrundfärbung aller Objektträger 1b. Natriumazid im Pufferbad. 1b. Frischen azidfreien Puffer verwenden. 2a. Schnitte enthalten nach 2a. Überschüssige Lösung sorgfältig abschütteln, dem Waschbad zu viel bevor um den Schnitt herum abgewischt wird. Lösung. 2b. Objektträger nicht lange genug mit Antikörpern oder Substrat inkubiert. 3a. Proben weisen hohe Peroxidaseaktivität auf. 3b. Paraffin nicht vollständig entfernt. 3c. Objektträger nicht ordnungsgemäß gespült. 3d. Schnellere als normale Substratreaktion z.b. wegen zu hoher Raumtemperatur 3e. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet. 3f. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebeschnitte. 3g. Zu stark konzentrierter 2b. Empfohlene Inkubationszeiten überprüfen. 3a. Inkubationszeit mit Dual Endogenous Enzyme Block verlängern. 3b. Bäder mit frischem Xylol oder Toluol verwenden. Werden mehrere Objektträger gleichzeitig gefärbt, sollte das zweite Xylolbad in frischem Xylol erfolgen. 3c. In Puffer-Bädern und Waschflaschen frische Lösungen verwenden. Als Waschpuffer Automation Buffer verwenden (siehe Abschnitt Reagenzvorbereitung) 3d. Kürzere Inkubationszeit für Substratchromogenlösung verwenden 3e. Feuchtkammer verwenden. Nur drei bis vier Objektträger auf einmal abwischen, bevor das Reagenz zugegeben wird. 3f. Blockierungslösung mit irrelevantem Protein zugeben (siehe Abschnitt Auswertung der Färbung). 3g. Höhere Verdünnung des primären Antikörpers verwenden. Antikörper. HINWEIS: Falls das Problem keiner der oben genannten Ursachen zugewiesen werden kann oder wenn die vorgeschlagene Maßnahme das Problem nicht behebt, bitte den technischen Kundendienst von Dako verständigen. Weitere Informationen zu Färbetechniken und Probenvorbereitung sind in den folgenden Werken enthalten: Handbook Immunochemical Staining Methods 5 (erhältlich von Dako), Atlas of Immunohistology 6 und Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 ( ) EFG_002_K4065/ p. 17/18

18 References Références bibliographiques Literaturangaben Additional references Références supplémentaires Zusätzliche Literaturangaben 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4 2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition. Dako Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 07/13 ( ) EFG_002_K4065/ p. 18/18