L immunoenzymologie. Technique puissante couramment utilisée e en recherche et en diagnostic cificité des anticorps pour leurs nes

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1 L immunoenzymologie Technique puissante couramment utilisée e en recherche et en diagnostic Basée e sur la très s grande spécificit cificité des anticorps pour leurs antigènes nes Test qualitatif Détection de protéines après électrophorèse : Western-blot Détection de protéines sur une coupe histologique Test quantitatif Dosage d antigènes Dosage d anticorps LISA (direct, compétitif titif ) MIT Principe de la réactionr Ag-traceur + Ac Ag + Ac-traceur complexes Ac-Ag Ag-traceur Ag-Ac Ac-traceur signal Composé coloré Spectrophotométrie trie Composé fluorescent fluorimétrie substrat mission de lumière luminescence

2 1. l anticorps l primaire Anticorps primaire Anticorps primaire Ag Ag x: Méthode M LISA compétition Histologie : immunofluorescence directe spèces chez qui l anticorps l primaire peut-être obtenu : souris, lapin, rat, chèvre vre Isotype IgG 2. l anticorps l secondaire Anticorps secondaire Immunoglobuline dirigée e contre la partie Fc de l anticorps l I et produit chez une autre espèce que cet anticorps I Ag x : Ac I = IgG lapin Ac II = IgG de chèvre anti-igg de lapin

3 Ag Détection du complexe Ag-Ac AcI-AcII Ac secondaire conjugué Ag Avantage du système : amplification du signal 3. Les composés conjugués Les enzymes nzyme d oxydord oxydoréductionduction La peroxydase du raifort («Horseradish peroxydase», HRP) nzymes hydrolytiques Les radio-isotopes isotopes Phosphatase alcaline β-galactosidase Principalement l iodel iode-125 et le tritium (H 3 ) Les fluorophores Principalement en microscopie (rhodamine, FITC)

4 4. Le système (strept)avidine-biotine Avidine: glycoprotéine du blanc d œuf ( daltons) Streptavidine : protéine synthétisée par Streptomyces avidinii ( daltons) 4 sites de liaison pour la biotine Biotine : vitamine H Système d amplification d des signaux Affinité (strept)avidine-biotine est extrêmement élevée e (10-15 M) (supérieur à Ag- Ac: : M) B Av B nz nz B B Av B B nz + Substrat Signal Ag Ag Ag Ag

5 Les différentes méthodesm Détection Western blot, immunohistochimie Antigène ne Phase hétérogh rogène Dosage LISA compétition Immunométrique (LISA sandwich) Phase homogène MIT (nzymes( Dosage Multiplied Immunoassay Technique Anticorps Phase hétérogh rogène Dosage Immunométrique de type LISA

6 Phase hétérogh rogène: l él étape de blocage (saturation) Les supports physiques utilisés s ont une affinité élevée e pour les protéines Dépôt d antigènene Dépôt d anticorps Plaque LISA Membrane nitrocellulose Les protéines adsorbées sur le support n occupent qu une petite fraction de la surface Nécessité d occuper l espace l afin d éd éviter des fixations non spécifiques d anticorps et/ou d antigd antigènesnes Ac II Sérum Albumine Lait en poudre Collagène Ac I Ag Détergent doux (tween20) Protéines inertes

7 Détection d antigd antigène: ne: Western-blot Détection de protéines Détermination du poids moléculaire From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al. tape 1: séparation s des protéines selon leur poids moléculaire SDS-PAG : Sodium Dodécylsulfate- PolyAcrylamide Gel lectrophoresis

8 tape 2: Transfert des protéines sur un support solide (membrane de nitrocellulose)

9 /ch331/techniques/techlectrophoresis.htm tape 3: Incubation avec les anticorps et révélationr From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al.

10 Révélation par émission de lumière et impression de films photographiques : lectrochemiluminescence (CL) Révélation colorimétrique de bandelettes

11 Dosage d antigd antigènes nes en phase hétérogh rogène 1. Méthode LISA compétition (nzyme Linked Immunosorbent Assay) Compétition à l Ag marqué Ag recherché de petite taille (hormones, médicaments) Ac I fixé Ag marqué (quantité fixe) Ag à doser (non marqué; quantité variable) Réalisation d une d courbe d étalonnage avec des solutions d Agd de concentrations connues Intensité signal Courbe d étalonnage Dosage avec le sérum s du patient. Détermination de la concentration d Ag contenu dans le sérum s à l aide de la courbe étalon [Ag]] non marqué ng/ml

12 Compétition à l Ac marqué Ag fixé Ag à doser (quantité variable) liminés s par lavage + Ac marqué (quantité fixe) A l él équilibre de la réaction r Ag-Ac Ac,, l anticorps l s est s réparti r entre l Agl à doser et l Agl fixé Plus l Agl à doser est abondant, moins l Acl marqué peut accéder à la phase solide

13 2. Dosage immunométrique de type sandwich Ag circulant dans le sérum et divalent (ex: Ag bactériens, viraux, parasitaires) Méthode LISA sandwich (100 fois plus sensible que LISA compétition) + Ag divalent recherché Intensité signal Signal augmente en fonction de la concentration d Agd [Ag] pg/ml + Substrat Signal

14 Dosage d antigd antigènes nes en phase homogène Technique MIT = nzyme Multiplied Immunoassay Technique Méthode de recherche d antigd antigènes nes de petite taille (drogues, médicamentsm dicaments ) ) dans les échantillons biologiques (sang, urine ) méthode compétitive et automatisable (couramment utilisée e dans les laboratoires de toxicologie) Ag recherché Substrat de l enzl Ac + nz Ag recherché présent Ag recherché absent Signal Dégradation du substrat Signal [Ag] Site catalytique inaccessible Signal inchangé

15 Dosage d anticorps d en phase hétérogh rogène 1. Dosage LISA à l antiglobuline marquée e (LISA indirect) Sérodiagnostics bactériens, viraux, parasitaires recherche d anticorps d dans le sérum de patients suite à une infection ou une vaccination Ag fixé Ac sérique recherché + Ac secondaire marqué + + Substrat Signal Intensité signal [Ac]

16 2. Recherche des IgM spécifiques d un d Ag donné Immunocapture des IgM totales IgM non spécifique Ag Ag + Substrat Signal IgM spécifique

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18 Sériodiagnostic du VIH

19 Protéine d enveloppe d gp120 et gp41 (précurseur gp160) Gène env Protéine de nucléocapside p24 Gène gag Cinétique de détection d des marqueurs de l infection l VIH Protéine de Transcriptase inverse p32, p55, p65 Gène pol

20 Le sérodiagnostic s de l infection l à VIH Test LISA (en première intention) Western-blot (en confirmation d une d séropositivits ropositivité VIH) Test LISA sandwich (LISA de 3ème 3 génération) g Test LISA de 4ème 4 générationg VIDAS HIV DUO ULTRA (Biom( Biomérieux) Ag VIH Ac anti-vih recherché Ac anti- p24 fixé Ag p24 nz + substrat Ag VIH marqué Ac anti-p24 marqué nz Signal [Ac anti VIH] (IgG et IgM) Ag VIH Ag VIH marqué Ac anti-vih

21 Western-blot Mise en évidence des Ac anti-vih du patient 1. Séparation S des protéines virales par SDS-PAG 2. Transfert sur bandelette de nitrocellulose 3. Incubation avec le sérum s du patient 4. Révélation R avec un anticorps anti-igg humain marqué La présence de bandes révèle r l existence l d anticorps d dirigés contre des Ag du VIH dans le sérum s du patient Positif si reconnaissance de gp160, gp120 et au moins une protéine pol (p32, p65 ou p55) ou une protéine gag (p24 ou p18)

22 Bandelette positive Bandelette négativen