HRP H 2 O 2. O-nitro aniline (λmax = 490 nm) O-phénylène diamine NO 2 NH 2

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1 ! #"%$'&#()"*!(,+.-'/0(,()1)2"%$ Avant d effectuer le dosage en IR de la biotine, il est nécessaire de s assurer de la reconnaissance du traceur par la streptavidine immobilisée sur les puits. Pour cela, nous allons utiliser une méthode indirecte basée sur la compétition entre le traceur et une enzyme biotinylée. Un dosage ELISA de type compétitif entre la biotine et une enzyme biotinylée puis entre notre traceur et la même enzyme permettra en plus de comparer l affinité du traceur à celle de la biotine vis-à-vis des molécules de streptavidine. La première étape de ce dosage consiste à déterminer la quantité d enzyme nécessaire pour effectuer la compétition ;:=<;>@?BA CD3D:EA FDCGD<IH=3J;FDCDJ;<;CD:=>@3D:EA FDC<;C<;CDKML?9<INOA FD:EA CPLH=8;<IQRD:EA HEA S@<;> L enzyme biotinylée utilisée est la peroxydase de raifort (HRP) couplée à la biotine par une fonction amide et qui contient 1.5 à 3 biotines par mole de peroxydase (masse molaire = ). Son activité est mesurée par colorimétrie, le substrat de révélation correspondant étant l orthophenylenediamine dihydrochlorure (OPD). L enzyme joue le rôle de catalyseur de la réaction d oxydation de l OPD en présence de H 2 O 2 : NH 2 NO 2 NH 2 HRP NH 2 O-phénylène diamine H 2 O 2 O-nitro aniline (λmax = 490 nm) Différentes concentrations de cette enzyme sont placées dans les puits imprégnés de streptavidine, en triple. Après incubation, rinçage, incubation du substrat et arrêt de la réaction enzymatique par ajout d acide, la mesure de l absorbance à 490 nm est effectuée par un lecteur de microplaques et les résultats suivants sont obtenus : TVU;WYX;ZD[\U;]OWY^D_=[\` a9byc@dd[\edzdu;wywyu f;g;hdi;jlkljlzdmyu WYnomYpYq=jlc A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C A, B, C 16

2 Les valeurs de l absorbance pour les concentrations supérieures à ng/ml sont trop fortes pour pouvoir être mesurées par l appareil. plaque de microtitration Normalement, la courbe attendue devrait être une droite sur une certaine gamme de concentration puis elle devrait atteindre un palier correspondant à la saturation des sites de streptavidine par l enzyme biotinylée. Nous n observons en fait que la partie linéaire de cette courbe car nous sommes limités par l absorbance qui devient supérieure à 3 et donc non mesurable par l appareil dès [enzyme] = ng/ml. 3,5 3 y = 0,2671x + 0,0692 R 2 = 0,9987 ƒ 2,5 2 1,5 1 0, s t@uevlwpxyt5yzu {} x~ Conclusion : Pour la suite des manipulations, il faut choisir une concentration en enzyme biotinylée qui donne une absorbance dans la gamme linéaire de l appareil de mesure et proche de 1 afin de vérifier la loi de Beer-Lambert. Nous avons donc choisi de travailler avec une ˆ; DŠYˆ; ;ŠYŒl ;ŽDŒl = DŠ! ;Š! ;ŠY ; D \ 9 Y 9 )ŠY D = \. Nous pouvons remarquer que ce premier dosage a confirmé la présence de streptavidine dans les puits et la reconnaissance de l enzyme biotinylée par la streptavidine. r

3 š5 7œž ;ŸD = DŸD E D D D D I D Iª«= ;ª D Iª@ E O =ŸD O D IŸD ; ; ;ª@ª«šD = ;ª Afin d avoir une idée de la quantité de sites de streptavidine présents dans les puits que nous utilisons, nous avons mis au point un dosage par préincubation de quantités croissantes de biotine, puis par incubation d enzyme biotinylée à 4 ng/ml. L interaction entre la biotine et la streptavidine étant pratiquement irréversible (à ph=7.4 le temps de demi-vie du complexe est de 3 jours), l enzyme ajoutée ne pourra pas déplacer la biotine et se fixera alors sur les sites libres de la streptavidine. On représente en général les variations du rapport B/B 0 en fonction de la concentration en biotine, avec B=Abs. mesurée et B 0 = Abs. de l enzyme en l absence de biotine. Toutes les absorbances sont corrigées par la valeur de l absorbance du substrat seul. Comme précédemment, trois points sont effectués pour chaque concentration en biotine. Abs. substrat seul = Abs. en l absence de biotine = soit une valeur corrigée = 3.3 = B 0 V Y±=²D³l±=ݵ; 9 ½;º;¾D»;³l l³làdáyµ ÂÄÃ=Â0Å ÆYÇoÈYÉYÊ=ËlÌ ng/ml % A, B, C ng/ml % A, B, C ng/ml % A, B, C ng/ml % A, B, C 5 80 ng/ml % A, B, C 4 16 ng/ml % A, B, C ng/ml % A, B, C ng/ml % A, B, C 1 Plaque de microtitration 100 ÝÛ ÜÛ , Í ÎÐÏ Ñ ÒÓÏ Ô}Õ5ÖzÔ }Ø ÙÚ

4 On remarque que la courbe peut être divisée en deux parties : Si [biotine] < 16ng/ml soit une quantité de biotine inférieure à 13 pmoles, on est alors en défaut de biotine par rapport au nombre de sites de streptavidine présents et la totalité de l enzyme ajoutée peut se fixer sur les puits (0.018 pmoles d enzymes par puits et comme il y a 1.5 à 3 moles de biotines par mole d enzyme, cela correspond à environ pmoles de sites de streptavidine nécessaires). On observe alors un plateau correspondant au signal maximum. Si [biotine] > 80 ng/ml soit une quantité de biotine supérieure à 65 pmoles, on a alors un excès de biotine par rapport aux sites de streptavidine présents, et l enzyme biotinylée ne peut alors pas se fixer car il ne reste plus aucun site libre. On peut remarquer que l on n arrive pas à B/B0=0, probablement à cause des interactions non-spécifiques que l on étudiera plus tard. Conclusion : Ce dosage permet de donner une estimation de la quantité de sites de streptavidine accessibles à la biotine dans les puits de polystyrène utilisés : il y a de ßPàâáâãDäâåYæ\çDè=é;ê7ëYé)ê@ì=ílé;ê åyîdïðåyñyì=ílê. Cette valeur semble correcte car les puits devaient être imprégnés par environ 2.4 pmoles de streptavidine, et comme chaque streptavidine possède 4 sites, on devait trouver environ 10 pmoles par puits. ò=ó7ôžõ=öd DøI DøIù=úò;ûDü ýoþ;õeÿ õeÿ û ø ü9ø Oÿ ûdõeÿ ù=þ;ø žõ@údò;ø;ö Nous avons réalisé un dosage de entre le traceur 5 (dont le rapport marqueur / biotine = 115) et l enzyme biotinylée (concentration = 4 ng/ml). Nous avons pour cela choisi d incuber simultanément le mélange enzyme biotinylée-traceur. Nous avons également réalisé en parallèle le dosage compétitif entre l enzyme biotinylée et la biotine afin de comparer les comportements des deux espèces. Comme nous le verrons dans le chapitre suivant, le choix du tampon d incubation devient important à ce niveau de l étude. Afin de limiter les interactions non-spécifiques, nous avons utilisé pour ce dosage une préincubation de poly-l-lysine diluée dans du PBS (M = 35200, 10-5 mol/l). La biotine et le traceur sont dilués dans du PBS et on fait trois points pour chaque concentration en biotine et deux points pour chaque concentration en traceur. [biotine] ng/ml Abs. corrigée écart-type B/B 0 BIOTINE n puits % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C % A, B, C 1 2Þ

5 [biotine] ng/ml Abs. corrigée écart-type B/B 0 Traceur 5 n puits % D, E % D, E % D, E % D, E % D, E % D, E % D, E % D, E % D, E 1 Abs. substrat seul = 0.08 Abs. en l absence de biotine = soit une valeur corrigée = = B 0 Plaque de microtitration B/BO biotine B/BO traceur , !#"$ %'&)(*%#+', -/.

6 Conclusion : Ces graphes permettent de calculer la valeur d un indice caractéristique, l 35476)8 : c est la concentration en biotine nécessaire pour avoir B/B 0 = 50%, soit une fixation de la moitié des molécules d enzyme biotinylée. La valeur de l IC 50 pour la biotine seule est de 9;:=<>?@AB En ce qui concerne le traceur 5, on trouve un C5D7E)FHGIKJ L MONP QRS. Il faut donc environ 8 fois plus de biotine liée au polymère que de biotine libre pour «déplacer» une même quantité d enzyme. Ce phénomène pourrait indiquer que la biotine fixée sur la poly-l-lysine a moins d affinité pour la streptavidine que la biotine libre. On peut cependant penser que cette différence vient en fait de la gène stérique occasionnée par le polymère qui fait que toutes les biotines présentes ne peuvent pas réagir. On peut alors dire que sur le traceur, TVUWX YWZ[]\5^_]à[ \5Y b c c [ \5\5WUd[. Un autre point qui apparaît à la lecture de ce graphe est l existence d un effet décrit par FELTUS (FELTUS, 1997) : le egfgfghji=klkli=mon qui traduit le fait que B/B 0 passe par un maximum. Il serait dû à une interaction coopérative : une biotine étant fixée sur un site, la streptavidine aurait tendance à fixer d autres biotines sur ses 3 autres sites au détriment de l enzyme biotinylée. La forme de la courbe semble montrer qu il n y a pas d interactions pq prs5tu v wx)wyz{ s même sans ajouter de BSA dans le PBS car un excès de biotine ou de traceur empêche totalement la fixation de l enzyme (B/B0 = 0%). Les sites de streptavidine étant tous occupés, l enzyme ne se fixe donc pas de manière non-spécifique sur le puits. Enfin, ce dosage ELISA montre qu il y a bien } ~ ƒ5ƒ5 ~ } entre les streptavidines imprégnées sur le puits et les biotines fixées sur le traceur que nous avons synthétisé. Ce traceur semble donc être utilisable pour un 5 ˆ ŠŒ 5. Ž Ž H ] šg šgœ Ž ž L évaluation de la fixation non-spécifique du traceur 5 sur les puits est indispensable à ce stade du dosage. Classiquement, ceci consiste à utiliser des puits identiques mais imprégnés d une autre protéine. Nous ne disposons pas de tels puits alors nous allons tester cette non-spécificité d une autre manière : en saturant les sites de la streptavidine imprégnée par un excès de biotine, puis en ajoutant une certaine quantité de traceur. Le traceur ne devrait alors pas se fixer dans le puits car l interaction biotine-streptavidine est trop forte pour pouvoir être déplacée. Normalement, les puits que nous utilisons sont déjà traités de manière à minimiser les interactions non-spécifiques, mais il est souvent nécessaire de prendre des précautions supplémentaires. Nous avons choisi de travailler avec [biotine] traceur = 125 ng/ml et nous avons testé les milieux suivants : - PBS - PBS + sérum de cheval (1 % soit mg/ml) - PBS % de Tween 20, détergent non-ionique (DIAMANDIS, 1996)

7 - PBS + BSA (0.1 %) - préincubation de polylysine (M = , 10-5 mol/l) pendant 1 heure à température ambiante. - préincubation de BSA (0.5 % soit 5 mg/ml) pendant 1 heure à température ambiante Nous n avons pas testé le lait écrémé, qui est un agent de blocage couramment utilisé en immunoanalyse, car il contient un inhibiteur de la liaison biotine-streptavidine (HOFFMAN, 1989). De plus, nous avons constaté que le traceur 5 précipite en présence de BSA, c est pour cette raison que nous avons également testé la préincubation de BSA dans les puits. On observe les trois bandes caractéristiques de l ester de cobalt lorsque l incubation se fait dans du PBS, en présence de Tween 20, de sérum de cheval et lors des préincubation de poly-llysine ou de BSA (spectre ci-contre) ce qui implique qu il existe une 5 ª 5 «) du polymère sur les puits. Ces interactions non-spécifiques ne peuvent donc pas être totalement éliminées, mais on peut remarquer qu elles sont nettement moins importantes lors de l utilisation du ±5² ³ µ ¹ º» ¼ ½ (spectres ci-contre). Nous avons cependant voulu vérifier que la diminution du signal non-spécifique lors d une incubation dans du sérum de cheval n était pas due à une inhibition de l interaction biotinestreptavidine. Nous avons pour cela effectué un test comparatif au HABA en diluant l avidine dans du tampon ph=6 et dans une solution de tampon ph=6 contenant 1% de sérum de cheval. La biotine étant diluée dans du PBS, à une concentration de mol/l. Lorsque l avidine est dans le tampon, on trouve en moyenne [biotine] = mol/l et lorsque ce tampon contient du sérum de cheval, on trouve [biotine] = mol/l. Compte tenu de la précision des mesures, ce test a montré que ¾ ÁÀ5 à ÄÅÇÆ ÁÈ É Ê Ë ¾ÍÌ ÁÅÎ ÆÏÐ)Ï ÁÑË À ¾ÓÒÔÏÌÕ Ã Ë È ÕÏÎ ÌÍ ÌÕà ־ËØ ÏÎ ÕÏÌ Ö ÕÙ¾ËØÀ5Õà ÑÕË Ê ÏÆÏÌ. Nous pourrons donc utiliser ce milieu pour la suite de l étude. L étude du pic à 2090 cm -1 permet d évaluer la valeur du signal spécifique. Nous avons en effet utilisé une série de puits saturés par un excès de biotine et une série de puits sans biotine. Nous leur avons ensuite fait subir les mêmes conditions d incubation et nous avons obtenu les résultats suivants : milieu d incubation hauteur à 2090 cm -1 biotine en excès hauteur à 2090 cm -1 sans biotine soustraction des 2 hauteurs PBS préincubation de Polylysine sérum de cheval préincubation de BSA milieu d incubation aire à 2090 cm -1 biotine en excès aire à 2090 cm -1 sans biotine soustraction des 2 aires PBS préincubation de Polylysine sérum de cheval #Ÿ

8 préincubation de BSA Nous pouvons ainsi remarquer que la soustraction entre les deux valeurs mesurées donne en fait la valeur réelle du Û5ÜÝ Þß à Û5áâ ã Üä)Üåæç que l on devrait observer. Cette différence peut être observée sur les spectres ci-contre. Les valeurs obtenues dans les quatre milieux sont du même ordre de grandeur et on a en moyenne : hauteur du pic à 2090 cm aire du pic à 2090 cm Une dernière remarque peut être faite concernant ces résultats : nous avons utilisé une [biotine] traceur = 125 ng/ml et comme le rapport marqueur / biotine = 115, nous avons donc introduit è è éôêëìí îï ðkñï7ìò ó ôõï õó par puits (0.102 nmoles de biotine). La droite d étalonnage construite précédemment permet de déduire que le signal spécifique observé correspond à environ ö øgùúû üý þ=ÿýoú ý (1.13 pmoles de biotine) soit une quantité 90 fois plus petite que celle attendue. Ce décalage entre la quantité de marqueur déposée dans le puits et celle restant effectivement après incubation et lavage provient certainement de la gène stérique engendrée par le polymère : toutes les biotines ne peuvent pas atteindre des sites de streptavidine. Conclusion : Cette étude des milieux d incubation nous a permis de mettre en évidence l existence d une entre la biotine du traceur et la streptavidine immobilisée sur les puits. Nous avons également montré que l utilisation du "! # $ % & permettait de réduire efficacement les interactions non-spécifiques. Nous avons cependant constaté les limites de notre traceur : nous avons créé une amplification grâce à un rapport marqueur/biotine = 115, mais nous ne pouvons pas saturer les sites de streptavidine à cause de la gène stérique due à la poly-l-lysine. En effet, sur les 10 pmoles de sites présents, nous en utilisons au maximum 1.13 pmoles. Nous pouvons alors penser qu un moyen d optimiser ces résultats serait de synthétiser un traceur qui serait un compromis entre un bon rapport marqueur/biotine et une gène stérique acceptable. Ces résultats sont encourageant pour la suite des recherches mais nous ne pourrons cependant pas réaliser le dosage de la biotine dans le cadre de ce stage. En effet, même si l on arrive à observer un signal spécifique, celui-ci est extrêmement faible. Si on parvenait à amplifier suffisamment le signal, il suffirait alors de tracer les courbes de dilution de la biotine pour réaliser son dosage. Deux méthodes semblent alors possibles : Méthode par ' ( ) * +,.-,.-( / : incubation d un mélange biotine-traceur dans les puits en utilisant des concentrations croissantes de biotine et une concentration fixe de traceur (celle donnant le signal maximum). On observera alors une diminution du signal due à la fixation préférentielle des molécules de biotine. Méthode par : 4 : incubation de quantités croissantes de biotine, puis incubation d une quantité fixe de traceur après avoir soigneusement lavé les puits. Le traceur (en excès) va alors saturer les sites libres de la streptavidine tant que la biotine sera en défaut. On observera alors le même type de courbe, décroissante. #Ú