Biochimie I. Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1. Assistants : Tatjana Schwabe Marcy Taylor Gisèle Dewhurst

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1 Biochimie I Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1 Daniel Abegg Sarah Bayat Alexandra Belfanti Assistants : Tatjana Schwabe Marcy Taylor Gisèle Dewhurst Laboratoire 104A 12 mai levures

2 2

3 Table des matières 1 Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae Introduction But de l expérience Techniques utilisées Méthodes Résultats Méthode de Bradford Electrophorèse sur gel SDS-PAGE Western blot ECL Calculs des concentrations Discussion Conclusion Annexe Scanne original du Ponceau S Bibliographie 17 3

4 4 Table des matières

5 1 Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1.1 Introduction L hexokinase est une enzyme active dans la glycolyse qui catalyse la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate[4] But de l expérience Le but de cette expérience est d isoler l hexokinase dans une souche de levure RH981 qui a la caractéristique d avoir le gême pep4 remplacé par URA3 dans le but d inhiber la protéine qui active les protéases. 5

6 INTRODUCTION Techniques utilisées Iosolation des protéines Les cellules sont cassée par vortex avec des billes de verres puis le contenu est solubilisé dans le tampon TAE. Les protéines sont précipitées avec le TCA et isolées. Méthode de Bradford Une solution de Bradford, composée de Bleu de Coomassie et d eau est ajoutée à une solution de protéine. l absorbance de cette solution est mesurée à 595 nm. Le Bleu de Coomassie a une absorbance maximum à 465 nm alors que complexé aux protéines elle atteint 595 nm[3]. Electrophorèse sur gel SDS-PAGE Le gel est constitué en deux partie, un gel de concentration et un de séparation. Le gel de concentration est composé de Tris(pH 8.8), de SDS, d acrylamide à 4%, d un colorant et d APS. L autre gel possède les mêmes constituant sauf que l acrylamide y est plus concentré (10%) et qu il n y a pas de colorant. Ce qui induit que le gel de séparation est plus dense et les protéines sont séparées par taille 1 tandis que le gel de concentration sert uniquement à mettre les protéines sur la même ligne. Coloration par bleu de Coomassie Le bleu de Coomassie est ajouté au gel est toutes les protéines sont colorées car c est un colorant non spécifique. Le but est de voir que les protéines ont bien migrées. Western blot Le Western blot sert à transférer les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose. Ceci permet l accès aux protéines pour une détection immunologique[1]. 1 Les protéines ont été chargées uniformément par le SDS.

7 1.2 7 Coloration par Ponceau S. Le transfert des protéines sur la feuille de nitrocellulose est vérifié par coloration avec Ponceau S. Cette coloration est aussi non spécifique et facilement réversible. ECL Une solution de TBST et de protéine de lait est ajoutée sur la feuille de nitrocellulose afin de remplir et de bloquer les espaces entre les protéines. Cette technique de détection consiste à ajouter un premier anticorps spécifique de la protéine d intérêt. Un deuxième anticorps spécifique du premier qui est marqué avec HRP est ajouté. Une solution d enzyme peroxydase est ajoutée et se lie au deuxième anticorps. Cette réaction est photoluminescente et est ensuite détectée au moyen d un film aux rayons X. 1.2 Méthodes Nous avons suivi les méthodes décrites dans le Basic protocol of protein analysis in yeast [3] Notre OD 600 initale était de 3.78 et après une nuit d incubation en milieu de culture nous avons prélevé les levures en phase expendentielle car leur activité métabolique est alors au maximum et avons obtenu une OD 600 de

8 RÉSULTATS 1.3 Résultats Méthode de Bradford Tube BSA-sol µl protein extract ddh 2 O µl BSA conc. µg/µl A 595 nm 1 st A 595 nm 2 nd Tab. 1.1: Tableau des valeurs de concentrations et de l absorbance pour la courbe d étalonnage et des protéines l extrait de levure La concentration de BSA est égale à : C ini dilution cuvette dil. Bradford = = mg/ml f(x) = x R 2 = Absorbance fit Abs 1st Abs 2nd C BSA [µg/µl] Fig. 1.1: Courbe standard avec BSA pour le calcul de la concentration de protéines Les valeurs d absorbances pour le graphique sont la moyenne des absorbances. La concentration de protéines est égale à : C graph dil. ini dil. cuvette dil. Brad = = 3.42 mg/ml = = 2.97 mg/ml = = 2.47 mg/ml

9 1.3 9 Nous prenons la moyenne de ces valeurs et obtenu une concentration en protéines qui est égale à 2.96 mg/ml Electrophorèse sur gel SDS-PAGE Coloration avec le Bleu de Coomassie Fig. 1.2: Gel SDS (0.375 M Tris ph 8.8, 0.1% SDS, 10% acrylamide, 0.06& APS) coloré avec le bleu de Coomassie. Les échantillons dans 30 µl dans sample buffer (1x). Ligne 1-4 et 7-10 : 10 µg, 20 µg, 50 µg, culot. Ligne 5-6 : hexokinase purifiée 150 ng, masse moléculaire standard. Les 2 extrémités sont chargé avec du sample buffer (1x). La coloration du gel au bleu de Coomassie permet de vérifier la bonne séparation des protéines, ainsi que leur concentration qui est proportionnelle à l intensité de la coloration. Cette coloration est tenace ce qui permet de mieux voir et donc analyser plus facilement les protéines. Les différentes protéines ont été séparé les unes des autres.

10 RÉSULTATS Western blot Coloration par Ponceau S. Fig. 1.3: La feuille de nitrocellulose coloré au Ponceau S. Les échantillons dans 20 µl dans sample buffer (1x) (électrophorèse). Ligne 1 et 8 : masse moléculaire standard, ligne 2-7 : 0.5 µg, 1.0 µg, 2.0 µg, 4.0 µg, 8.0 µg, culot. Ligne 9-13 ; hexokinase purifiée : 6.25 ng, 12.5 ng, 25 ng 50 ng, 100 ng. Les 2 extrémités sont chargé avec du sample buffer (1x). Les bandes ne sont que peu visible voir invisible 2 pour les faibles concentrations d échantillons, mais les lignes contenant les échantillons les plus concentrés sont lisibles. 2 Le contraste a été modifié pour facilité la lecture. L original se situe en annexe (figure 1.6)

11 ECL Fig. 1.4: Le film au rayon X de la feuille de nitrocellulose avec ECL. Les échantillons dans 20 µl dans sample buffer (1x) (électrophorèse). Ligne 1 et 8 : masse moléculaire standard, ligne 2-7 : 0.5 µg, 1.0 µg, 2.0 µg, 4.0 µg, 8.0 µg, culot. Ligne 9-13 ; hexokinase purifiée : 6.25 ng, 12.5 ng, 25 ng 50 ng, 100 ng. Les 2 extrémités sont chargé avec du sample buffer (1x) Nous observons comme attendu que l intensité de l hexokinase augmente graduellement car la concentration des protéines croît. Les traînées avant l hexokinase est le bruit de fond. Tandis que en dessous, il s agit d une dégradation de cette dernière. Avec l intensité du signal il est possible d estimer, grâce aux concentrations d hexokinases pur connues, la masse de l enzyme dans notre échantillon. Le film nous permet de calculer la masse moléculaire de l hexokinase en faisant un graphique du logarithme des masses en fonction de la distance de migration (log Mm = f(distance)).

12 RÉSULTATS Masse de l hexokinase masse kda log masse distance cm Tab. 1.2: Les masses moléculaires standard avec leurs distances de migrations log masse f(x) = x R 2 = distance de migration [cm] Fig. 1.5: La régression linéaire avec les données du film (figure 1.4). m expérimentale = kda m littérature[2] = kda erreur = 9.2%

13 Calculs des concentrations La quantité d hexokinase dans notre échantillon Les calculs sont faits avec les concentrations des lignes 5 et 13 (figure 1.4) car leurs intensités sont similaires. m hexokinase purifié = 100 ng = 0.1 µg m protéines = 4 µg C protéines (Bradford) = 2.96 µg/µl C hexokinase = = µg/ml 4 La masse d hexokinase et de protéines par cellule DO cellules/ml 10 DO cellules/ml C hexokinase = = mg cellule C protéines = = mg cellule Le pourcentage d hexokinase par rapport aux protéines et le nombre de molécule de l enzyme % hexokinase = = 2.5% m hexokinaseexp = kda = g/mol n hexokinase = = mol nb hexokinase = N A = molécules/cellule

14 DISCUSSION 1.4 Discussion La courbe de régression linéaire pour la méthode de Bradford est très bonne mais nous aurions pu ignorer certains points de la première série. Sur le gel coloré au Bleu de Coomassie (figure 1.2), nous observons que la concentration de protéines dans le culot (ligne 4) est petite, ce que l on voit par la faible intensité de couleur bleu. Nos extractions ce sont donc bien déroulées. Nous notons aussi que l hexokinase (ligne 5) est pour une certaine raison pas coloré. La coloration par Ponceau S. (figure 1.3) est comme déjà expliqué, facilement réversible (lavage à l eau), ce qui entrave de manière importante la lecture des protéines. Donc cette technique se limite à la vérification du transfert des protéines sur la membrane de nitrocellulose. Bien qu une analyse ne puisse être faite, il est quand même pratique de pouvoir contrôler la présence des protéines pour la suite de l expérience. La seule information que nous voyons est que comme déjà observé avec le Bleu de Coomassie, la concentration de protéines dans le culot est faible. Le film aux rayons X nous permet, comme avec les deux colorations, de constater que l extraction de l hexokinase du culot était bonne. En plus nous pouvons calculer la quantité restante qui est de 1.5 µg (estimation faite par rapport à l intensité des colonnes 3 et 4). Cette estimation confirme notre observation sur les gels car, dans le cas du Bleu de Coomassie la concentration la plus faible étant visible est de 10 µg. Idem peut être dit pour Ponceau S., où les seuls concentrations que l on voit sont de 4 et 8 µg. La masse moléculaire de l hexokinase a pu être définie de manière plus ou moins précise en considérant les erreurs qui sont grandes et multiples : distances mesurées approximativement (règle) et la diffusion des bandes. Une autre méthode pour calculer le pourcentage d hexokinase par rapport aux protéines totales est de diviser la masse de l enzyme pur par la quantité de protéines correspondante (figure 1.4). Il existe une troisième méthode qui passe par les volumes utilisés pour arriver au même résultat. Nous n avons pas trouvé d articles relatant les différentes quantités que nous avons calculés, ce qui ne nous permet donc pas de comparer et limite l analyse et l interprétation. 1.5 Conclusion Nous avons réussi a atteindre l objectif de ce TP qui était d isoler l hexokinase d une souche de levure. Les différentes méthodes (Bradford, colorations et ECL) ont données des résultats acceptables et suffisants qui ont été analysés.

15 J atteste que dans ce texte toute affirmation qui n est pas le fruit de ma réflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d une autre source est en outre placé entre guillemets. Daniel Abegg Sarah Bayat Alexandra Belfanti 1.6 Annexe Scanne original du Ponceau S. Fig. 1.6: La feuille de nitrocellulose coloré au Ponceau S. Les échantillons dans 20 µl dans sample buffer (1x) (électrophorèse). Ligne 1 et 8 : masse moléculaire standard, ligne 2-7 : 0.5 µg, 1.0 µg, 2.0 µg, 4.0 µg, 8.0 µg, culot. Ligne 9-13 ; hexokinase purifiée : 6.25 ng, 12.5 ng, 25 ng 50 ng, 100 ng. Les 2 extrémités sont chargé avec du sample buffer (1x).

16 ANNEXE

17 Bibliographie [1] Clément Bordier. Cours Biochimie I. [2] Expasy. UniProtKB/Swiss-Prot [3] Howard Riezman s lab. Basic protocol of protein analysis in yeast. [4] Lubert Stryer, Jeremy M.Berg, and John L. Tymoczko. Biochimie. Médecine- Science Flammarion, ème édition. 17

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