SEQUENÇAGE LI-COR DNA 4200

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1 SEQUENÇAGE LI-COR DNA 4200 Le gel de séquence contient 64 puits au maximum soit 16 clones traités en parallèle. Les oligos utilisés (modifiés en 5 ) fluorescent à 700/800 nm. Une amorce permet de séquencer environ 800 pb. Préparation du gel : Mélanger dans un bécher : ml de solution Long Ranger (qui contient l acrylamide et le bis-acrylamide) - 6 ml de tampon TBE 10X - 28 ml d eau distillée - Peser 25.2 g d urée et les verser dans le bécher - Placer le tout dans un bain-marie chauffé à 37 C et remuer régulièrement (pour mieux dissoudre l urée) Montage des plaques : Matériel : - plaques de verre Starphire 41 cm (arrière : rectangle plein, avant : bord ouvert) - Spacers 0.2 mm - Serre-joints 41 cm - Peigne 64 dents - Base pour couler le gel Montage des plaques : - Laver les plaques à l eau et à l éthanol (la moitié inférieure des plaques doit être la plus propre possible pour la lecture du laser) - Le bord biseauté des plaques doit se situer à l interface entre les 2 plaques - Positionner la plaque arrière sur la paillasse avec les bords biseautés orientés vers le haut - Placer les spacers sur les bords les plus longs de la plaque arrière en prenant soin de les faire dépasser légèrement de chaque côté de la plaque (ils se repositionneront correctement au moment de l utilisation des serre-joints) - Recouvrir la plaque arrière par la plaque avant dont les bords biseautés sont orientés vers le bas - Border les deux plaques avec les deux serre-joints - Mettre l ensemble sur la base pour aligner les 2 plaques et les spacers - Coller chaque serre-joint aux 2 plaques et serrer correctement chaque vis (sauf la vis supérieure) pour former un ensemble étanche

2 - Incliner sur la base les 2 plaques fixées par les serre-joints pour faciliter le coulage du gel Coulage du gel : Une fois l urée dissoute, filtrer la solution avec un filtre de nitrate de cellulose 0.45 µm puis dégaser quelques minutes (l oxygène dissout dans la solution ne pourra pas ainsi perturber la réaction de polymérisation). Puis rajouter : µl de TEMED 400 µl d APS (aliquoté dans le congélateur pièce B4) au moment de couler le gel Mélanger rapidement et verser la solution entre les 2 plaques tout en «tapotant» la plaque avant avec la base pointue d une pipette pour éviter la formation de bulles dans le gel Une fois le gel coulé, mettre les 2 plaques horizontalement sur la paillase Placer le peigne côté maxi-puits entre les 2 plaques (au niveau du bord échancré de la plaque avant) et reverser un peu de la solution sur le peigne Placer la plaque de plexiglass dans le niveau supérieur des plaques pour renforcer le tout Laisser polymériser 1h30

3 Réaction de séquençage : Le kit utilisé pour la réaction de séquençage est le Sequitem Excel II DNA sequencing kit LC. Des tubes de couleur différente sont utilisés pour chaque ddntp : A : C : G : T : vert bleu orange rose La préparation des tubes pour la PCR peut se faire soit à la main soit au robot TECAN. Suivre au choix l un des 2 protocoles suivants : Préparation à la main : Un prémix est préparé pour chaque type d amorce utilisé. Dans un tube eppendorf, préparer (volume final de 16 µl): - 1 µl d amorce marquée avec le fluorophore 700 ou 800 nm (3 pmol/µl) µl d ADN plasmidique µl de tampon de séquençage 3.5X - 1 µl d ADN polymérase SequiTherm EXCEL II (5U/µL) Puis préparer 4 tubes de couleur différente (A,C,G,T) pour une amorce pour chaque clone à séquencer : Tube vert : 2 µl du tube contenant le ddatp + 4 µl du prémix Tube bleu : 2 µl du tube contenant le ddctp + 4 µl du prémix Tube orange : 2 µl du tube contenant le ddgtp + 4 µl du prémix Tube rose : 2 µl du tube contenant le ddttp + 4 µl du prémix Préparation au robot : Un prémix est préparé pour chaque type d amorce utilisé. Dans un tube PCR, préparer (volume final de 20 µl) : µl de tampon de séquençage 3.5X - 1 µl d amorce marquée avec le fluorophore 700 ou 800 nm (3 pmol/µl) préparé fraîchement à partir du stock. La dilution ne se conserve que quelques semaines µl d ADN plasmidique (mini-prep) - 1 µl d ADN polymérase SequiTherm EXCEL II (5U/µL) Il existe des barrettes de 4 toutes prêtes de A,C,G,T terminaison Mix (A repréparer si nécessaire).

4 Dans le robot : - placer dans le support noir «robot position 1» au fond (voir schéma sur le robot) - placer les mix de terminaison en colonne 1 et 2 - placer les pré-mix en colonne 10, 11 et 12 (voir aussi schéma) - placer le support blanc «support PCR» (et non le support noir en position 2, c est-àdire au centre de la plateforme) - positionner dessus la plaque blanche souple 96 puits spéciale PCR - faire un wash 40mL ou un lavage EtOH-H 2 O-Javel (attention à l initialisation le bras de droite se déplace sur toute la surface de la table en venant taper sur le bras de gauche!!) - lancer le programme «aliquotseq multi plaque 96» - A la fin, transférer directement la plaque dans l appareil à PCR 96 puits avec l obturateur en caoutchouc et démarrer le programme pour le séquençage (voir protocole ci-dessous) Ensuite, lancer le programme PCR suivant (durée 1h30 environ) : 5 min à 95 C 30s à 95 C 15s à 50 C 30 cycles 1min à 70 C Temps infini à 4 C Attention! Surtout ne pas oublier l obturateur en caoutchouc, sinon vous ne pourrez lire que bases maxi. Pour gagner du temps, pendant la réaction PCR, monter le gel dans le séquenceur et réaliser l étape de pré-électrophorèse. Une fois la réaction PCR terminée, rajouter 3 µl de tampon d arrêt (95% formamide, 10 mm EDTA et colorant rouge) par tube, remettre l obturateur en caoutchouc et laisser chauffer dans l appareil à PCR 5 minutes à 95 C. Puis garder les tubes dans la glace en attendant de charger les échantillons sur le gel. Montage du gel dans le séquenceur : - Après polymérisation du gel, retirer la plaque de plexiglass, le peigne et laver le maxi-puits avec de l eau. Utiliser aussi le coin du peigne pour enlever l excès de gel - Bien nettoyer les plaques de verre au niveau de la lecture du laser (qui balaye une région située entre les 2 grosses visses du bas des serre-joints) avec de l eau et de l éthanol - Bien sécher les 2 plaques avant l utilisation du séquenceur

5 Utilisation du séquenceur : Instructions pour le LI-COR DNA Allumer le séquenceur - Allumer l ordinateur tournant sur OS/2 relié au séquenceur - Ouvrir la porte du séquenceur - Positionner le bac inférieur noir en bas - Remplir le bac de tampon TBE 0.8X (80 ml TBE 10X pour 1 L final) - Placer les 2 plaques de façon à ne pas créer de bulles lorsqu elles sont dans le bac inférieur. Les 2 plaques doivent aussi coller fermement à la plaque chauffante du séquenceur - Vérifier qu aucune trace se situe au niveau de la lecture laser - Placer le couvercle du bac inférieur et brancher l électrode qui lui est associée - Mouiller le joint du bac supérieur et le positionner à la place de la plaque de plexiglass - Remplir le bac de tampon TBE 0.8X - Nettoyer le maxi-puits avec une seringue contenant du tampon TBE 0.8X - Vérifier qu il n y a pas d eau derrière le gel (sinon risque d arc électrique) - Placer le couvercle du bac supérieur et brancher l électrode qui lui est associée - Refermer la porte du séquenceur Pré-électrophorèse : La pré-électrophorèse est une étape importante : la tension utilisée lors de la migration du gel est appliquée au gel afin de vérifier que le montage des plaques et que les paramètres utilisés pour la migration sont corrects. Cette étape permettra d évacuer certains ions résultant de la polymérisation (NH 4 + et SO 4 2- ) pouvant modifier la migration des brins monocaténaires d ADN. Elle permettra aussi de chauffer le gel (50 C) pour une migration homogène des différentes pistes. Pour cela démarrer le programme BaseImagIR4.0 Data Collection sur l ordinateur. - Cliquer sur l icône Configuration - Cliquer sur le bouton ouvrir pour charger des paramètres nécessaires à la migration - Sélectionner le fichier 41cm_16col dans la liste proposée

6 - Cliquer sur OK - Réduire maintenant la fenêtre configuration - Aller dans le menu File puis cliquer sur New - Rentrer le nom du projet et sélectionner le dossier dans lequel les fichiers seront écrits. Créer un dossier si nécessaire. - Aller dans les tabulations 700 et 800 si nécessaire pour ajouter des remarques - Cliquer sur OK De nouvelles fenêtres s affichent : Scanner control, N700 et N800 - Cliquer dans la fenêtre Scanner control sur les boutons ON pour High Voltage et Scan Status, puis appuyer sur Entrée (attendre que la température du gel atteigne 50 C). Si tout fonctionne bien, cliquer sur les boutons Off de High Voltage et Scan Status et passer à l étape suivante. Sinon vérifier qu il n y a pas de solution qui a coulé entre la plaque arrière et la plaque chauffante du séquenceur et que les électrodes ne sont pas mouillées - Choisir dans le menu Parameters de la fenêtre Scanner control l option Load Configuration. Ceci chargera les paramètres de la configuration dans la mémoire de l ordinateur - Dans les fenêtres N700 et N800, entrer 50 et 105 comme valeurs de Gain et d offset. Valider par Entrée (les caractères rouges repassent en noir). Si ce bandeau n est pas visible, choisir «show gain and offset» dans le menu View de la fenêtre N700 ou N800 - Choisir maintenant dans le menu Options de la fenêtre Scanner control, l option Focus (voir image ci-dessous)

7 - Sélectionner le canal 700 et cliquer sur Auto - La courbe obtenue représente la fluorescence détectée par la lentille lorsque la focale du faisceau commence sur la plaque arrière du gel, passe dans le gel, puis dans la plaque avant. Le gel a une fluorescence intrinsèque moindre que les plaques, donc il y a un fossé quand le faisceau focalisé passe dans le gel. La ligne rouge devrait normalement être placée sur le pic du fossé qui représente le mileu du gel. Le centrage de cette ligne est facilité par la deuxième fenêtre qui est un zoom (10x) de la première. Si besoin, changer la position de cette ligne rouge avec le bouton Move. - Vérifier le même centrage du point focal sur la fenêtre RIGHT - Cliquer sur Done quand l opération est terminée - Cliquer sur la fenêtre N700 et choisir dans le menu Options l option Auto gain - Cliquer sur Auto dans la nouvelle fenêtre - Cliquer sur Done - Faire la même chose avec la fenêtre N800 si l amorce utilisée est couplée au fluorophore excitable à 800 nm - Vérifier que la haute tension et le scanner ne sont pas allumées et passer à l étape suivante Chargement des échantillons : - Ouvrir la porte du séquenceur - Débrancher l électrode du bac supérieur - Enlever le couvercle du bac supérieur - Placer le peigne 64 puits dans le maxi-puits et l enfoncer très légèrement dans le gel

8 - Placer un papier de couleur derrière le gel afin de mieux voir les puits (allumer la lampe à côté du séquenceur si nécessaire). Déposer du tampon d arrêt pour vérifier que tous les puits sont correctement formés. Laver les puits avec du tampon TBE 0.8X - Charger les échantillons à l aide d une pipette Hamilton 8 voies (maximum µl par puits) - Retirer le papier de couleur - Replacer le couvercle du bac supérieur - Rebrancher l électrode du bac supérieur - Fermer la porte du séquenceur - Cliquer dans la fenêtre Scanner control sur les boutons ON pour High Voltage et Scan Status, puis appuyer sur Entrée. C est parti. La migration durera environ une dizaine d heures Après la migration : - Eteindre le Scan Status et la haute tension dans la fenêtre Scanner Control - Cliquer sur Exit dans le menu File - Ouvrir la porte du séquenceur - Débrancher l électrode du bac supérieur - Enlever le couvercle du bac supérieur - Enlever le couvercle du bac inférieur - Enlever les plaques et vider le tampon du bac supérieur dans l évier - Enlever le bac supérieur en dévissant les vis supérieure des serre-joints - Nettoyer le tout pour l utilisateur suivant Analyse des résultats : Pour interpréter les résultats obtenus lors de la migration des échantillons, il faut utiliser le programme Base ImagIR Image Analysis Cliquer sur l icône configuration - Cliquer sur le bouton Open - Sélectionner le type de peigne utilisé - Cliquer sur OK - Réduire la fenêtre configuration - Dans la grande fenêtre, ouvrir le fichier image en cliquant sur File > Open - Sélectionner l image voulue (700 ou 800) sauvegardée dans le bon dossier - Cliquer sur Enter - Dans la fenêtre Image, cliquer sur Sequence > Auto Sequence All - Activer l onglet Load sur la droite de la fenêtre

9 - Entrer le nombre de clones séquencés (et non le nombre de puits) et l ordre des bases utilisées (par exemple : ACGT répété plusieurs fois en fonction du nombre de clones séquencés) - Activer l onglet Samples sur la droite de la fenêtre - Entre le nom et les remarques de chaque clone séquencé - Cliquer ensuite sur le bouton Find lanes en bas de la fenêtre - Cliquer maintenant sur le bouton Find dans la nouvelle fenêtre. Aligner les limites de chaque ligne de migration en fonction des séquences obtenues. Si besoin, double cliquer sur la ligne et la positionner à l endroit correct. - Cliquer sur le bouton Sequence - Entrer le nombre de bases à lire (en général, on peut lire jusqu à bases) - Puis, cliquer sur Start (l opération prend plusieurs minutes en fonction du nombres de clones à séquencer - Si le programme ne trouve pas le front de migration, il faut faire l opération de façon manuelle. Il faut d abord délimiter une à une chaque clone que l on veut séquencer en cliquant dans le menu Sequence sur Lane definition. Double-cliquer sur chaque base et délimiter sur l image de séquence la piste pour les ddatp. Faire de même pour les autres nucléotides. A la fin, cliquer sur OK, puis cliquer dans le menu Sequence sur Auto single sample. Entrer le nombre de bases à séquencer et cliquer sur Start. - Si besoin, après la lecture automatique, vérifier chaque échantillon en ouvrant dans la grande fenêtre le fichier correspondant en cliquant sur File > Open Sample et en sélectrionnant l échantillon correspondant. Cliquer sur les bases en rouges qui indiquent une erreur de lecture et les corriger si nécessaire. A la fin cliquer sur File > Save sequence. - Pour vérifier les séquences obtenues sur son ordinateur, il faut d abord les télécharger en se connectant par protocole ftp sur l ordinateur licor qui contrôle le séquenceur (login : labo mot de passe : ura240). Aller dans le bon dossier et rapatrier les séquences désirées. - Et voilà c est fini pour la partie séquençage!