33-Dosage des composés phénoliques

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1 33-Dosage des composés phénoliques Attention : cette manip a été utilisée et mise au point pour un diplôme (Kayumba A., 2001) et n a plus été utilisée depuis au sein du labo. I. Principes Les composés phénoliques solubles dans du méthanol (CPFS) sont extraits par un mélange méthanol eau. Ils sont ensuite mélangés avec le réactif de Folin-Ciocalteus en milieu basique. Les oxydes de tungstène et de molybdène contenus dans le réactif de Folin réagissent avec les phénols extraits et donnent une coloration bleue dont on mesure l intensité au spectrophotomètre. Le résidu récalcitrant à l extraction de la solution méthanolique, contient le groupe des composés phénoliques insolubles dans le méthanol (CPFI). Pour extraire ces composés insolubles, le résidu est mélangé à une solution d hydroxyde de sodium, et le tout est agité pendant vingt heures à l obscurité. Après extraction, les composés insolubles sont traités de la même façon que les composés solubles. Les composés phénoliques solubles dans le méthanol et les composés phénoliques insolubles dans ce solvant sont donc dosés distinctement. Les premiers regroupent la plupart des composés phénoliques simples, ainsi que les tanins hydrolysables. Les composés phénoliques insolubles ne contiennent que les acides phénoliques des parois cellulaires et constituent des noyaux d humification qui servent à la formation des acides humiques (Kayumba, 2001). II. Méthode 1) Matériel Balance analytique, précision g. Bain chauffant à sec avec ses colonnes réfrigérantes et ses allonges de 500 ml à col rodé avec leurs bouchons. Cylindre gradué de 100 et 50 ml. Bain de glace. Chronomètre. Erlenmeyers de 250 ml. Entonnoirs. Filtres plissés 14 1/2 ø 150 mm. Pisettes de 250 ml et 500 ml. Ballons jaugés de 100 ml. Pipettes automatiques et embouts. Flacons PE de 250 ml. Agitateur rotatif (sous-sol). Spectrophotomètre et cuves 10 mm. 1

2 2) Réactifs a) Extraction Solution-mère d acide gallique p.a. : dissoudre 1 gramme d acide gallique dans H2O désionisée et jauger à 1 litre. Solution de carbonate de sodium à 20 % (p/v) : dissoudre 20 g de Na2CO3 dans 100 ml d H2O désionisée. Réactif de Folin Ciocalteus. Solution d extraction : méthanol/h2o 2 : 1 acidifié avec HCl : dans un ballon de 1 litre, mettre ml de méthanol p.a. puis 300 ml d eau. Ajouter avec précaution 27 ml d HCL conc. 37 % et ajuster à la jauge lorsque le mélange est revenu à température ambiante. NaOH 1M (Titrisol). Méthanol technique Acétone technique b) Gamme etalon Pour la courbe étalon, préparer à partir de la solution- mère une gamme de solutions d acide gallique allant de 0 à 1 g/l. Table de correspondance pour la fabrication de la gamme étalon d acide gallique, à partir d une solutionmère concentrée à 1 g/l. Concentration en g/l Volume de la solution mère en ml Volume d eau (ml) ) Mode opératoire a) Echantillon de départ On utilise de la litière broyée à la pulvérisette (env. 50 m). Peser exactement une quantité de litière broyée voisine de 1 g. b) Blancs Remplacer la prise d essai par de l eau désionisée et suivre la procédure. 2

3 c) Procédure Composés phénoliques - fraction soluble dans le méthanol (CPFS) 1. Peser une prise d essai 2. Noter la masse m, en g. 3. Introduire l échantillon dans une allonge (tube à fond plat). 4. Ajouter 50 ml de solution d extraction petit à petit en essayant de mouiller toute la matière et en lavant les parois de l allonge. 5. Faire bouillir sous reflux au bain à sec (thermochem, type CHL, préchauffé à 150 C) pendant exactement une heure. Eviter une forte ébullition en baissant la température de consigne à 120 C dès que l ébullition est atteinte. 6. Après une heure, fermer les allonges et laisser refroidir dans la glace pendant 3 minutes environ. 7. Séparer l extrait du résidu en filtrant à travers un filtre plissé rapide LS 14 1/2 sur erlenmeyers de 250 ml. 8. Récupérer suffisamment d extrait pour l analyse des CPFS (10 ml) et les mettre de côté. Remettre un erlenmeyer de 250 ml propre sous l entonnoir. 9. Le résidu quantitativement collecté dans le filtre est alors lavé 4 fois au méthanol technique et 2 fois à l acétone technique. Au cours de cette opération, utiliser des pissettes remplies des différents solvants et rincer les résidus qui seraient restés dans l allonge avant de verser dans le filtre. Petit à petit, le filtrat se décolore. 10. Ainsi dépigmenté (c est le filtrat et non le résidu dans le filtre qui se dépigmente), le résidu est séché dans son filtre à l étuve à 60 0 C pendant quelques heures à une nuit. Ce résidu sera ensuite utilisé pour l analyse de la fraction insoluble des phénols. Dosage de la fraction soluble dans le méthanol (CPFS) 1. Réaliser une courbe étalon en parallèle 2. Verser 70 ml de H2O distillée dans un ballon jaugé de 100 ml. 3. Pipeter 1 ml de l extrait de CPFS, ajouter dans le ballon. 4. Ajouter 3 ml de réactif de Folin Ciocalteus, laisser réagir 3 minutes et ajouter 10 ml de Na2CO3 20 %. La solution se colore en bleu foncé. 5. Laisser réagir exactement une heure et mesurer la (cuve 10 mm) à 675 nm. Attention, pour le dosage, commencer toujours par la courbe étalon. Lorsque l absorbance se rapproche de la valeur de 1 (> 0.9) il est indispensable de diluer l échantillon afin de le doser correctement. En effet, une distorsion trop grande affecte les valeurs proches de l unité. Pour les dilutions, procéder au demi (5 ml d échantillon + 5 ml d eau désionisée) ou au cinquième (2 ml d échantillon + 8 ml d eau désionisée) et ne pas oublier de tenir compte des facteurs de dilution dans le calcul des résultats. Le dosage au spectrophotomètre se fait en utilisant la concentration 0 g/l comme référence. Commencer donc toujours par celle-ci lors des dosages (y compris pour les CPFI, refaire un échantillon à 0 g/l). Dosage de la fraction insoluble dans le méthanol (CPFI) 1. Introduire le résidu séché avec son filtre dans un flacon P.E. de 250 ml et ajouter 100 ml de NaOH 1M. Fermer le flacon. 2. Agiter à l agitateur rotatif, à l obscurité et à température ambiante, pendant 20 heures. 3

4 3. Filtrer l extrait à travers un filtre plissé rapide (LS 14 1/2). 4. Pour la suite, procéder de la même façon que pour les CPFS mais avec une quantité d hydrolysat de 2 ml. Ne pas oublier de refaire un ballon correspondant à la valeur de 0 g/l de la gamme-étalon pour faire le blanc. Lorsque l absorbance se rapproche de la valeur de 1 (> 0.9) il est indispensable de diluer l échantillon afin de le doser correctement. En effet, une distorsion trop grande affecte les valeurs proches de l unité. Pour les dilutions, procéder au demi (5 ml d échantillon + 5 ml d eau désionisée) ou au cinquième (2 ml d échantillon + 8 ml d eau désionisée) et ne pas oublier de tenir compte des facteurs de dilution dans le calcul des résultats. 4) Récupération Récupérer le reste des CPFS (mélange méthanol et eau) ainsi que les solutions de lavage des CPFI (mélange méthanol et acétone) dans les solvants organiques. Les solutions contenant du réactif de Folin-Ciocalteus quand à elle sont à récupérer dans les solvants organiques hallogénés. 5) Calculs Calcul global Soient : a [g/l] = concentration de l échantillon obtenue grâce à la courbe étalon P [g] = poids exact de l échantillon (corrigée par l humiditérésiduelle). Alors : a * 50 *1 CPFS en g par g de matière sèche 1000* P CPFI en g par g de matière sèche a *100 *1 2 *1000* P Calculs détaillés pour les CPFS 4

5 1 ml solution mère d'acide gallique ballon jaugé 1 à une concentration connue en mg/l ballon jaugé 2 1 ml échantillon de poids P allonge avec 50 ml de solution d'extraction ballon jaugé 3 Figure 33.1 : Détail des étapes du dosage des CPFS et des étalons d acide gallique. Pour trouver a quantité de phénols présents dans les 50 ml de l allonge (voir fig.33.1) : 1000 ml a grammes 50 ml a * grammes Cette valeur est la quantité de tous les phénols de l échantillon de poids P. a * 50 Si dans P en g 1000 grammes de phénols Alors dans 1 g a * 50 * * P Cette valeur représente la quantité en g de phénols solubles par g d échantillon. Calculs détaillés pour les CPFI La correspond à 2 ml d hydrolysat, alors que pour la gamme étalon l hydrolysat est de 1 ml. a La lue correspond donc à 2 avec a en g/l. Ceci représente la concentration des phénols dans le ballon 4 (fig. F. 3). a Si : 1000 ml 2 grammes Alors : 100 ml a *100 2 *1000 grammes Cette masse représente la quantité des phénols insolubles présents dans le ballon 4 (voir fig. 33.2), et qui est la quantité de phénols insolubles dans l échantillon de poids P. 5

6 Si dans P en g a *100 2 *1000 grammes de phénols insolubles Alors dans1 g a *100 *1 2 *1000* P grammes Cette quantité correspond à la quantité de phénols insolubles en grammes par gramme d échantillon. 1 ml solution mère d'acide gallique ballon jaugé 1 à une concentration connue en mg/l ballon jaugé 2 tous les CPFI 2 ml échantillon de poids P allonge avec 50 ml de solution d'extraction Flacon P.E. ballon jaugé 4 Figure 33.2 : détail des étapes du dosage des CPFI et des étalons d acide gallique. 6) Références Allen S. E. (ed.)., 1974 "Chemical analysis of ecological materials", Blackwell, Oxford. Gobat J.-M., Aragno M. & Matthey W., Le sol vivant. PPUR, Lausanne. Kayumba A., 2001 Suivi de la décomposition des litières des zones alluviales de la Sarine. Travail de diplôme, laboratoire d Ecologie végétale, Université de Neuchâtel. Lunt H. A., 1931 "The carbon-organic matter factor in forest soil humus", Soil Sc., 32 : Scehovic J., 1994 Dosage des composés phénoliques dans les fourrages. Station fédérale de recherches en production végétale de Changins, Suisse. Steubing L., 1965 «Pflanzenökologisches praktikum» Pour les autres références, voir les parties concernées du chapitre B du manuel des méthodes. 6

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