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2 A quoi sert l Anatomie Pathologique? Faire le diagnostic de pathologies à partir de cellules et de tissus humains 80% des diagnostics: pathologie tumorale (tumorothèques) Le reste: pathologie inflammatoire (digestive, cutanée), immunologique (greffes), dégénératives (Alzheimer..)

3 Intérêt des cellules souches: classification des tumeurs Autrefois: classifications morphologiques des tumeurs Classifications des tumeurs en fonction du stade de différenciation de la cellule à l origine du clone tumoral Tumeurs hématopoïétiques et lymphomes: oui Tumeurs épithéliales? Tumeurs mésenchymateuses?

4 Cellules souches et réparation tissulaire Pas d implication en routine Toutes nos techniques sont applicables à l étude des cellules souches dans le cadre de la recherche

5 Moyens d étude morphologiques des tissus et des cellules Techniques d inclusion + coupes histologiques = microscopie optique Immunofluorescence, Immuno(cyto)histochimie Hybridation in situ

6 I- Techniques de fixation-inclusion standards 1- Choix et identification des prélèvements 2- Fixation 3- Inclusion 4- Coupe

7 Techniques de fixation-inclusion standards I.1- Choix et identification des prélèvements

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10 Techniques de fixation-inclusion standards I.2- La fixation

11 La fixation des tissus: Principes théoriques - Etat aussi proche que possible du vivant - S opposer à l autolyse - Insolubiliser les constituants cellulaires, - S opposer aux distorsions et rétractions = durcir le tissu - Préparer les structures tissulaires aux traitements ultérieurs

12 I.2.1- Fixation physique : congélation Tissu plongé dans un liquide refroidissant et caloporteur : Utilisation courante : - N2 liquide C - iso pentane 130 C - Fréon, Butane-Propane Enrobage dans substance protectrice (OCT)

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14 Fixation physique : congélation Avantages - maintien de la réactivité de l Ag (fixation idéale) - état proche du vivant (résurrection) - fixation rapide d états transitoires - maintien en place des constituants solubles ou dépolymérisables - préservation d organites sensibles à la pression osmotique

15 Fixation physique : congélation Inconvénients : - lourd, peu pratique (sauf si N2 liquide) - structures détruites (cristaux) - moins bonne morphologie

16 I.2.2- Fixation chimique

17 Fixation chimique: les agents précipitants Précipitation Modification structure III aire des protéines : effet dénaturant Agents Alcool éthylique, acétone Avantage Préserve l antigénicité Inconvénients Effet souvent réversible Déshydratation simultanée altérations morphologiques

18 Fixation chimique : Les agents pontants Effet pontant Immobilisation par des liens intra et intermoléculaires Agent Formol, liquides de Bouin Avantages : - Structures mieux préservées: bonne morphologie - Meilleure immobilisation des protéines Inconvénients -Dénaturation + sévère des Ag - Masquage des Ag

19 Techniques de fixation-inclusion standards I.3- L inclusion

20 I.3- Inclusion Imprégnation d un tissu /milieu, capable de le durcir de manière homogène maintenir les éléments en place coupe fine

21 I.3.1- Inclusion en paraffine Déshydratation (EtOH) Solvant intermédiaire (Benzène, Toluène, Xylène) Imprégnation en paraffine (56-58 C) Inclusion en paraffine bloc

22 I.3.2- Autres types d inclusions - en gélatine - en résines polymères -objets durs - pour microscopie électronique

23 Techniques de fixation-inclusion standards I.4- La coupe

24 Confection des coupes: la microtomie - Microtome à congélation : 7 à 10 µm - Microtome à paraffine : 2 à 5 µm - Ultra microtome : 500 à 1500 A

25 Coloration et lecture Coloreuse: hématéine - éosine Lecture

26 Macro coupes Souris

27 Tissue array Carottes de 0,6 à 2 mm

28 II. Examens cytologiques 1- Matériels cytologiques 2- Techniques cytologiques

29 II.1 Matériels cytologique - Liquides physiologiques : LCR, sang, urines - Liquides d épanchements : pleural, ascite - Produits de lavage : bronchiolo-alvéolaire - Ponctions d organes pleins à l aiguille - Produits de brossage, de grattage - Cellules isolées provenant de culture - Suspension de cellules après broyat tissulaire

30 II.2 Techniques cytologiques Etalement sur lame : Etalement direct, empreinte, frottis Cytocentrifugation Culture de cellules sur lamelles Enrobage (culot) inclusion Agarose 3% Gélatine 2-10% Paraffine

31 III. Immunofluorescence Immunohisto (cyto)chimie 1- Intérêts 2- Principes 3- Accès des Ac à l Ag 4- Les anticorps 5- Système révélateur 6- Amplification de signal 7- Analyse de la technique 8- Contrôle du marquage

32 III.1 Intérêts - Détection spécifique de protéines sur matériel cytologique ou sur coupes tissulaires - localisation (+/- quantification) d'une protéine dans une cellule ou un tissu

33 III.2 Principes Le système révélateur L anticorps Lumineux (fluorescent) Coloré (enzyme) opaque (Or, Argent) Polyclonal Monoclonal L antigène Tissu Présentation de l Ag

34 III.3 Accès des Ac à l Ag 1) Démasquage antigénique - Enzymatique Trypsine 0,1% TA Pronase 0,1% 37 C Pepsine 0,4% 37 C -A la chaleur tampon citrate four à micro-ondes tampon EDTA autocuiseur bain-marie ++ étuve

35 III.3 Accès des Ac à l Ag 2) Perméabilisation des membranes Cellules entières Détergents non ioniques : Triton 0,1% Saponine 0,1-0,01%

36 III.3 Les anticorps 1) Anticorps polyclonaux : Avantages : - plusieurs Ac contre un seul Ag - plus «sensible» - fixation moins critique - mise en œuvre rapide Inconvénients : - spécificité moindre : reconnaît différents déterminants d un même Ag - affinité et spécificité variables suivant le lot

37 III.3 Les anticorps 2) Anticorps monoclonaux : Avantages : - mono spécifiques (un épitope) - affinité homogène - production régulière, sans variabilité Inconvénients - réalisation plus difficile - plus grande sensibilité à la qualité de la fixation

38 III.3 Les anticorps 3) Fragments Fab ou F(ab ) 2 : Obtention : digestion ménagée, purification Avantages : - taille moindre : meilleure pénétration - pas de fixation Fc non spécifique

39 III.5 Système révélateur 1) Fluorescence Principe : absorption - émission FITC (isothiocyanate fluorescéine) RITC (isothiocyanate rhodamine) TRITC (isothiocyanate tétraméthylrhodamine) Absorption Emission couleur (nm) (nm) vert orangerouge orangerouge DAPI bleu

40 III.5 Système révélateur Avantages : -protocoles rapides - grande sensibilité (fond noir) Ag avec faible [ ] - colocalisations possibles -confocal Inconvénients : - montage aqueux : disparaît au cours du temps - sensibilité à la lumière : stockage à 4 C, ombre - extinction du signal sous UV - microscope spécialement équipé, chambre noire -marche mal en paraffine

41 III.5 Système révélateur 2) Marquage à l or Microscopie électronique Inhibiteur de la cystéine protéase dans une feuille de tomate

42 III.5 Système révélateur 3) Marqueur enzymatique - Enzymes : HRP: peroxydase du raifort Phosphatase alcaline Glucose oxydase β-galactosidase -Substrats = chromogènes

43 III.5 Système révélateur Chromogène (incolore et soluble) Composé coloré insoluble Enzyme Chromogène coloration Compatib. enzyme HRP : DAB (3.3 brun H2O, EtOH Diaminobenzydine) AEC (3 Amino 9 Ethyl rouge H2O Carbazole) 4 Chloro 1 Naphtol bleu H2O AP : Fast blue bleu H2O, EtOH Fast red rouge H2O

44 III.5 Système révélateur Avantages : Visualisation aisée, microscopie optique Grande sensibilité Différentes couleurs et contres colorations Stables si déshydratées Double marquage avec vision simultanée (sauf si [Ag1] >> [Ag2] ou si colocalisation)

45 III.5 Système révélateur Inconvénients : Protocoles longs Pas de colocalisation Contraste insuffisant si [Ag] faible Substrats potentiellement carcinogènes Diffusion du précipité (précision)

46 III.6 Amplification du signal 1) Technique directe non amplifiée Avantages : peu d étapes peu de bruit de fond Inconvénient : peu sensible

47 III.6 Amplification du signal 2) Technique indirecte non amplifiée Avantages : Utilisable pour des Ac Iaire différents Inconvénients :peu sensible

48 III.6 Amplification du signal 2) Technique indirecte amplifiée Biotine - streptavidine (avidine) Complexe streptavidine (avidine) - biotine - peroxydase préformé PAP et APAAP

49 Système complexe streptavidine (avidine) - biotine - peroxydase préformé

50 III.6 Amplification du signal Avantages : Peu de gène stérique Liaison biotine - streptavidine irréversible (covalente) Amplification considérable possible Inconvénients : bruit de fond Biotines endogènes

51 III.7 Analyse de la technique

52 III.7 Analyse de la technique La technique a-t-elle marchée? Importance des témoins positifs

53 Glandes non tumorales : +++ Tumeur : 0%

54 III.7 Analyse de la technique Le marquage obtenu est il spécifique? = Bruit de fond

55 1 2 Fixation non spécifique de l Ac Iaire: rare

56 Fixation non spécifique de l AC IIaire

57 Solution: pré incubation avec sérum isotypique à l AC IIaire 3 2 1

58 Chromogène = substrat d enzymes endogènes: peroxydases (cellules myéloides, PN +++)

59 Solution: pré incubation avec un inhibiteur des péroxydases endogènes: eau oxygénée

60 Liaison de l avidine aux biotines endogènes: foie ++

61 III.8 Contrôles du marquage 1) Contrôle positif - témoins externes - témoins internes 2) Contrôle négatif - sans incubation avec Ac spécifique: omission - incubation avec un Ac Iaire de même isotype à la même [ ] dirigé contre un Ag absent du tissu (mab) - incubation avec sérum correspondant à l AC IIaire (pab) - incubation de l Ac sur un tissu ne renfermant pas l Ag 3) Extinction - Pré incubation avec l Ag en excès (x 50 à 100)

62 anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

63 anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

64 anti Fib1 anti Fib1 + protéine IgG1a

65 anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

66 anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

67 anti REβ anti REβ + protéine Ig non specif.

68 IV Analyses des résultats 1- Analyse qualitative

69 IV.1 Analyses qualitative La protéine est elle présente? Quelle est sa topographie?

70 Marquage cellulaire Quelles cellules sont positives? Quelle partie de la cellule est positive?

71 Matrice extracellulaire

72 Possibilité de doubles marquages Pas de colocalisation

73 IV.2 Analyses quantitative DOSAGE BIOCHIMIQUE IMMUNOHISTOCHIMIE QUANTITATIVE Avantages et inconvénients - beaucoup de matériel - topographie non précisable - réputé facile et reproductible - peu de matériel - dosage dans un compartiment tissulaire précis - quantitatif?

74 Préalable: déterminer les conditions d un marquage optimum Concernant le conditionnement des échantillons: - conditions de conservation de l'ag - détermination des conditions de fixation Concernant la technique d'immunomarquage: -démasquage - concentration de l'ac I aire - concentration des Ac II aire Marquage spécifique maximum Marquage non spécifique minimum Reproductibilité

75 Durée de démasquage : 0 min

76 Durée de démasquage : 5 min

77 Durée de démasquage : 10 min

78 Durée de démasquage : 15 min

79 Durée de démasquage : 20 min

80

81 Durée de démasquage optimisée Score c 0 0min 5min 10min 15min 20min 25min 30min Durée de démasquage

82 Méthodes Méthodes semi quantitatives : visuelle Comptage de structures marquées par unité de surface, appréciation de l intensité de marquage Méthode analytique Méthode globale Méthodes quantitatives : analyseur d'images Le choix de la méthode dépend : - du type de marquages - des moyens disponibles

83 1) Méthode analytique : Compteur + grille (quadrillage): comptage cellule/cellule - sur zone préalablement choisie (zone la plus marquées, ) - sur l'ensemble de la préparation Long et fastidieux

84 2) Méthode globale

85 V. Hybridation in situ 1- Sur quel matériel 2- Choix du fixateur 3- Prétraitement 4- Les différentes étapes 5- Révélation 6- FISH 7- Quantitatif 8- Qualitatif

86 V. Hybridation in situ Détection spécifique d une séquence d acides nucléiques dans un tissu par hybridation d une sonde de séquence connue

87 V.1 Les sondes Plusieurs types Cosmides: séquence courte d ADN 10 à 40 Kb Sondes alpha satellites: séquences répétitives proche des centromères, spécifiques d un chromosome le plus souvent Marqueurs: Radioactifs Non radioactifs: fluorescent, biotine, digoxigénine

88 V.2 Sur quel matériel? Frais ou congelé > paraffine Si paraffine: prétraitement, ne pas utiliser des fluorochromes Appositions ou cytocentrifugation > coupes (superpositions nucléaire)

89 V.3 Choix du fixateur Fixateurs compatibles avec l ISH: Formol tamponné 10%, paraformaldehyde, Fixateur de Karnovsky (16% paraformaldehyde, 50% glutaraldehyde) Fixateurs non compatibles avec l ISH: Fixateurs à base d acides (acide picrique, etc.) Alcools si utilisés seuls..

90 V.3 Prétraitement ADN: entouré de protéines hydrolyse et/ou digestion enzymatique préalables surtout si coupes en paraffine ARN: travailler en milieu RNAse free

91 V.4 Différentes étapes Dénaturation sonde par chauffage (70 C) avec formamide 50 à 70% Dénaturation de l ADN cible / plaque chauffante (72 C) Hybridation: une nuit à 37 C-42 C Lavages dans une solution stringente (SSC) pour éliminer les hybridations non spécifiques

92 72 C HER2 Chr 17 Chr 17

93

94 HER2 A T A G C T A T A T C G A T P

95 V.5 Révélation Si sonde marquée avec un fluorochrome: lecture directe possible Si signal trop faible ou sonde marquée par une molécule non fluorescente: méthode indirecte Anticorps secondaire fluorescent IHC secondaire

96 HER2 F

97 Exemple d amplification: 3 ADN cible Sonde 1 2

98 V.6 Fish: lecture, interprétation Excitation : lumière UV + filtre Émission dans le visible Photo-oxydation : extinction du fluorophore

99 V.7 Quantitatif: difficile Délétion, microchimérisme - Appositions > coupes -Compter de très nombreux éléments (2000) Seuil à partir d un tissu témoin++

100 V.8 Qualitatif: plus facile Translocation: selon les sondes, point de fusion par colocalisation ou au contraire «split» t(14;18) IgHC, Bcl2

101 Ex Cish: amplification génique Amplification de HER-2 dans un carcinome mammaire

102 Ex CISH: détection d ARN viral Sondes EBER dans un lymphome T/NK nasal

103 VI Combinaisons de techniques Hybridation in situ fluorescente (Fish) et immunofluorescence.

104 VII. Place de ces techniques pour l étude des cellules souches?

105 Identification des cellules souches en culture Non, CMF plus performante

106 Suivi de la différenciation des cellules souches (cellules souches adultes, ES et MAPC) in vitro? Oui, car ébauche de structures pluricellulaires

107 VII.1 Différenciation in vitro de mmapcs Insert retroviral: expression d un gène codant pour une protéine fluorescente : cellules egfp+ Expression d un gène marqueur codant pour une β galactosidase: cellules Gal+ Culture avec cytokines spécifiques Jiang Y et al: Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow, Nature 20 June, 2002

108 egfp+ Anti vwf-cy3 egfp+ Anti vwf Cy3 + VEGF: phenotype endothélial egfp+ Anti albumine-cy3 egfp + albumine-cy3 + FGF4 + HGF: phénotype épithélial hépatocytaire egfp +Anti GFAP-Cy5 egfp + Anti-NF-Cy3 + bfgf: phénotype astrocytaire et neuronale mmapcs egfp+

109 VII.2 Devenir somatique des MAPCs chez la souris? MAPCs porteuses d un gène marqueur codant pour une β galactosidase Injection de MAPCs dans des blastocytes de souris puis transplantation dans utérus de souris mères Coupes de souris entières colorées par le X- gal: β galactosidase entraîne l hydrolyse du X- Gal conduisant à la production d un précipité bleu

110 Pas de chimérisme Chimérisme à 45%

111 Cerveau Peau Muscle strié Myocarde Foie Grêle Rein Rate

112 Coupes de cerveau: Cortex avec un chimérisme = à 45% Anti-β-gal-Cy3, anti-gfap-cy5 et anti-neun-fitc

113 Grêle Anti-β-gal-FITC anti-cd45-pe et anti-panck-cy-5 Poumon Anti-β-gal-FITC anti-cd45-pe et anti-panck-cy-5

114 VII.3 Différenciation des mmapcc en cellules tissulaires spécifiques chez la souris adulte? Injection intraveineuse de mmapcs chez des souris SCID Sacrifice après 4 semaines Destination des cellules gal+ determinées par immunofluorescence (AC anti Gal) Doubles immunomarquages pour identifier les cellules

115 Coupes de foie contrôle L, m, n: Anti-β-gal-FITC anti-ck18-cy-5, anti-cd45-pe O: Anti-β-gal-FITC anti-albumine- Cy-5

116 VII.4 Microchimérisme et HIS Après greffe de moelle, donneur masculin, receveur féminin: suivi des cellules souches hématopoïétiques du donneur: foie, coeur, cerveau Microchimèrisme foeto-maternel

117 Syndrome du lupus néonatal: NLS Pathologie auto-immune de développement intra utérin Bloc cardiaque souvent létal, myocardite, hépatite Prélèvements autopsiques de 4 nouveaux nés NLS masculins + prélèvements autopsiques de nouveaux nés masculins contrôles Stevens A et al: Myocardial-tissue-specific phenotype of maternal microcherism in neonaral lupus congenital heart block, Lancet, 362: , 2003

118 Coupes de myocarde d un nouveau-né NLS Coupes du noeux atrioventriculaire d un nouveau-né NLS Sonde anti-x sonde anti-y 0,03 à 2,2% de cellules maternelles (/2000 cel) pour 0 à 0,1% dans le cœur contrôle: que sont ces cellules?

119 Sur la même coupe de myocarde Microscope à fluorescence Microscope optique Sonde anti-x sonde anti-y cellules CD45+, cellules actine sarcomérique + 2/661 cellules CD45+: XX

120 Sur la même coupe de myocarde Microscope à fluorescence Sonde anti-x sonde anti-y Microscope optique cellules CD45+, cellules actine sarcomérique + Plus de 80% des cellules maternelles sont des myocytes

121 Sur la même coupe de myocarde Microscope optique Microscope confocal sonde anti-x Anti-CD45 Anti-actine α sarcomérique: vector red, rouge en MO

122 Différenciation en myocytes de cellules souches maternelles Réaction auto-immune contre ces cellules semiallogéniques responsable de la maladie

123 FIN

124 Solution: Préincubation avec un inhibiteurs des biotines endogènes

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