Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle IBiSA. «Anexplo» Service Transgenèse. Catalogue des prestations

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1 Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle IBiSA «Anexplo» Service Transgenèse Catalogue des prestations 04/01/12 - Page 1 sur 8

2 Présentation du service de Transgenèse Le service de Transgenèse est un service de la Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle «Anexplo», labellisée IBiSA (Toulouse, Midi-Pyrénées). En plus des prestations purement techniques, le service assure différentes activités de formation (étudiants des diverses écoles doctorales, stagiaires, chercheurs et clients du service). Prestations de service proposées transgenèse additive transgenèse ciblée Modèles murins La création de souris transgéniques est majoritairement réalisée soit par transgenèse additive par injection de fragments d origines diverses (ADN nus ou viraux) dans l embryon au stade unicellulaire, soit par transgenèse ciblée par injection de cellules souches embryonnaires génétiquement modifiées via la recombinaison homologue dans des embryons au stade blastocyste. Les fonds génétiques les plus couramment employés sont les souches consanguines C57Bl/6J, FVB, Balb/c mais aussi les fonds hybrides tels que B6D2/F1 et B6CBA/F1. Sites de transgenèse Localisation et compétences spécifiques Le service de transgenèse est localisé sur plusieurs sites géographiques, le site UMS US006/Anexplo-CREFRE (Langlade) propose la création de modèles murins par transgenèse additive ou ciblée (seulement injection des cellules ES modifiées), le site IPBS (Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale - Rangueil) propose la culture et l injection de cellules ES recombinantes produites par des équipes locales ou par des consortiums internationaux (banque ES gene Trap ou Knock-in, cf. site web). Les développements technologiques tels que la dérivation de cellules ES à partir de blastocystes KO font également partie des attributions de ce site. Présentation des sites le site UMS US006/Anexplo-CREFRE, trois pièces sont réservées à la création d animaux transgéniques : la première permet l hébergement des animaux nécessaires aux prestations et accueille les animaux nouveau-nés jusqu au moment de leur sevrage ou de leur libération auprès du client, c est dans les deux autres pièces ou laboratoires que se font les diverses manipulations d embryons (récupération, micro-injection et réimplantation). le site IPBS occupe environ 100 m² de la zootechnie. Il est composé, d une zone animalerie répondant aux normes actuelles et aux exigences de la transgenèse (zone protégée appelée «zone transgénique»), qui comporte deux pièces pour l hébergement des souris nécessaires aux expérimentations et, des fondateurs transgéniques ou chimères, placées sous la responsabilité d'un animalier, ainsi que deux pièces d'élevage des lignées établies, et d'observation de souris transgéniques (F1 et descendants) ouvertes aux utilisateurs, 04/01/12 - Page 2 sur 8

3 d un laboratoire équipé pour la micro-injection, la réimplantation, la manipulation des embryons et des souris, d une pièce pour réaliser les génotypages des souris (extraction d ADN, PCR), d un plateau d histologie mis à disposition des personnes formées, comprenant cryostat, microtome, robot d inclusion et de traitement de lames, pour l analyse phénotypique des modèles transgéniques. Personnel Formé et compétent, présent à temps plein ou en alternance dans des équipes de recherche, le personnel peut répondre aux diverses sollicitations. Le personnel du service participe au travail du réseau national ROCAD par sa présence et ses interventions dans différents groupes (réseau pour la standardisation et l optimisation des ressources et des compétences existantes au bénéfice de la communauté scientifique). Accès aux prestations du service de Transgenèse Le client doit prendre contact avec le service afin de présenter son projet, de choisir l approche technologique la mieux adaptée, de voir si sa mise en œuvre nécessite des mises au point particulières et d évaluer les coûts et les délais de réalisation. Une fois la prise de contact effectuée, le client doit remplir une fiche de demande de prestation ainsi que les fiches de prestations spécifiques. Il s engage alors à respecter les conditions de prestation émises par le service pour le bon déroulement de celles-ci. Sur le site web Anexplo, une page «intranet» est accessible aux clients du service de Transgenèse. Elle permet d accéder aux fiches de demande de prestation ainsi qu aux fiches de prestations spécifiques, dans le cas où celles-ci n ont pas été délivrées directement par le service. Contacts Site web : Pour une meilleure gestion des dossiers, il est recommandé d adresser les fiches complétées par aux contacts suivants, disponibles sur le site web de la plateforme : UMS US006/Anexplo CREFRE : us006-transgenese-crefre@inserm.fr IPBS : gtransgenes@ipbs.fr Engagements du service Equipements Le service possède tout le matériel et les équipements nécessaires à la manipulation d embryons, à la réalisation de lignées transgéniques murines ainsi qu à leur élevage. Les équipements sont surveillés et vérifiés par le personnel et/ou par des sociétés extérieures compétentes par l intermédiaire de contrats de maintenance ou de veille personnelle pour les matériels les moins critiques. 04/01/12 - Page 3 sur 8

4 Hygiène & Sécurité et éthique Les utilisateurs doivent respecter les règles d hygiène et sécurité. En cas d urgence ou simplement de problème, l utilisateur doit contacter le personnel du service. Stockage des données Les données et dossiers clients sont sauvegardés et archivés à la fois sur support papier et par informatique. Les résultats Les résultats sont retranscrits sur la partie «bilan & résultats» des fiches de prestation. Une fois complétées, ces fiches de prestation sont retournées au client et les résultats validés par celui-ci. Nous nous engageons à tout mettre en œuvre pour fournir aux clients les produits souhaités et ce dans un délai raisonnable, cependant, travaillant avec du «vivant», nous ne pouvons garantir 100% de succès. Tarifs Les prestations réalisées en routine font l objet d une tarification précise (sous forme de devis pour la transgenèse ciblée à l IPBS), réévaluée et validée chaque année par les administrations des tutelles. Des demandes plus particulières peuvent être étudiées et faire l objet de l établissement de propositions plus spécifiques. Une fois les modalités de la prestation approuvée par le client, la moitié du coût de celle-ci est dû quelque soit le résultat des expérimentations. Publications Les clients s engagent à citer le service dans le paragraphe «remerciements» ou «matériel et méthodes» des publications émanant de résultats obtenus avec ses équipements ou/et l intervention du personnel du service, ainsi que dans tout type de communication (posters et présentations orales). Un exemple est proposé ci-dessous : L équipe X a bénéficié des compétences du service de transgenèse de la plateforme Anexplo de Toulouse pour la création des animaux transgéniques suivants... Team X is very grateful to platform Anexplo from Toulouse for creating the following transgenic models... 04/01/12 - Page 4 sur 8

5 Prestations de service Transgenèse additive Principe et méthode L objectif de cette technologie est de permettre l intégration et l expression d un ADN exogène dans le génome de la souris, ADN qui sera transmis à la descendance comme un nouveau caractère héréditaire. Par cette méthodologie peuvent être créés des modèles animaux permettant l analyse des séquences régulatrices d un gène d intérêt ou mimant des pathologies décrites chez l Homme. Les champs d application sont très vastes car touchent de nombreux domaines de la Biologie. L ADN purifié linéaire ou sous forme de vecteur est injecté sous microscope dans un des pronuclei ou dans la zone périvitelline de l embryon au stade unicellulaire. Trois fondateurs sont fournis au minimum par construction microinjectée. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f02 Fiche TG additive Validation de la demande de prestation par le service Réception et contrôle des produits(fournis par le client) transgène photo transgène contrôle du transgène (rapport de contrôle) Engagements du client La qualité de la solution d ADN est un facteur primordial à la réussite de la transgenèse. Le client doit donc s engager à fournir un fragment de microinjection purifié selon les protocoles en cours validés ou les protocoles fournis par le service, à une concentration «stock» déterminée en accord avec le service de Transgenèse de la plateforme Anexplo. Les microinjections ne seront débutées qu une fois les diverses fiches remplies et documents associés joints. Réalisation de la prestation commande des souris campagne d injection obtention des F0 génotypage, par le service ou le client Bilan envoyé (anexplo/tg/f04 Fiche suivi TG additive) «bilan et résultats» de la fiche Tg additive F02 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des fondateurs TG/MO12 Validation de la prestation par le client 04/01/12 - Page 5 sur 8

6 Transgenèse ciblée Principe et méthode La transgenèse ciblée consiste à introduire la modification génétique (via un vecteur de remplacement) dans des cellules embryonnaires souches (ES), et de sélectionner les cellules dans lesquelles l'adn s'est intégré par recombinaison homologue. Plus la taille de la région d'homologie entre l'adn exogène et l'adn génomique des cellules ES est grande et plus la fréquence de l événement de recombinaison homologue sera élevée. Pour sélectionner les cellules ayant intégré par recombinaison homologue l ADN étranger, des marqueurs de sélection positive (ex: gènes de résistance aux antibiotiques) doivent être inclus. De plus, pour différentier les événements de recombinaison homologue d une insertion aléatoire du fragment d intérêt, des marqueurs de sélection négative (ex: gènes "toxiques") sont souvent utilisés. Une des utilisations les plus connues de l'insertion ciblée de l'adn est la réalisation de souris "knock-out". En résumé, dans ce cas, la recombinaison homologue est utilisée pour interrompre le cadre de lecture du gène que l'on souhaite inactiver en insérant, par exemple, le gène néo qui confère une résistance à la néomycine (ou G418) et dont l'expression est dirigée par un promoteur constitutif (par ex PGK). Pour accomplir ceci, un vecteur de recombinaison est utilisé qui contient en plus de la cassette néo (promoteur + néo + site de polyadénylation), de larges séquences génomiques qui seront choisies pour s'apparier exactement aux séquences génomiques entourant le point d'insertion désirée. Une fois que cette construction est «électroporée» dans les cellules ES, la machinerie propre à la cellule réalisera la recombinaison homologue. Cet événement est peu fréquent et par conséquent le marqueur de sélection négative placé en dehors de la région où se fait la recombinaison (habituellement ce gène est adjacent à la plus petite des deux régions d'homologie génomique) aidera à la sélection des bons clones. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f09 Fiche TG ciblée Validation de la demande de prestation par le service Réception des produits (fournis par le client) cellules ES test mycoplasme numération chromosomique Southern Réalisation de la prestation (anexplo/tg/f05 Fiche suivi injection c ES) commande des souris campagne d injection obtention des chimères Optionnel : accouplement des chimères pour analyse de la transmission analyse des F1 (PCR/Southern) par le client Bilan envoyé «bilan et résultats» de la fiche Tg ciblée F09 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des chimères ou F1 Validation de la prestation par le client Malgré cette contre sélection, il est nécessaire d identifier, par PCR et Southern blots, les clones de cellules ES qui ont intégré la construction par recombinaison homologue de ceux, beaucoup plus nombreux, qui l ont intégrée de manière aléatoire. Les cellules ES qui sont utilisées pour l insertion ciblée, dérivent de la masse cellulaire interne des blastocystes. Ces cellules sont pluripotentes, ce qui signifie qu elles peuvent donner tous types de tissus. Les cellules ES doivent être cultivées sur une couche de cellules nourricières, habituellement des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui ont été irradiés ou traités à la mitomycine pour arrêter leur division. Les cellules ES doivent être passées tous les 2 à 3 jours pour éviter leur différenciation et donc perdre leur pluripotentialité. 04/01/12 - Page 6 sur 8

7 Pour une construction donnée, la réussite du projet (obtention de bonnes chimères et GLT : Germ Line Transmission) dépend à la fois de la qualité intrinsèque des clones de cellules ES (caryotype, pluripotentialité, pureté), de leurs conditions de culture mais aussi de leur état de division le jour de l injection dans les embryons receveurs. Il est conseillé d injecter au moins deux clones différents pour une construction donnée. Les cellules ES sont injectées sous microscope, à l aide de micromanipulateurs, dans les blastocystes au nombre de 8 à 15 cellules ES / blastocyste selon la lignée de ES utilisée et les recommandations du client. Les chimères mâles principalement à taux de chimérisme élevé (venant donc majoritairement du fond génétique des ES) sont accouplées à des souris WT pour l obtention des F1 hétérozygotes. Engagements La prestation va de la microinjection des ES au sevrage des potentiels chimères. Elle ne sera lancée qu après obtention des fiches de renseignements fournies par le service et dûment complétées par le client. L étape d injection des ES dans les blastocystes doit être précédée d une expertise afin de s assurer du bon profil des clones à injecter (aspect morphologique, densité, euploïdie, état de pluripotence des ES*). Il est conseillé au client de vérifier ces paramètres s il veut augmenter les chances de réussite. Le client s engage à rechercher la présence de mycoplasmes dans le lysat cellulaire des ES et des MEF (par PCR et colorimétrie, après culture sans antibiotiques) ainsi que des cellules COS productrices de LIF si utilisées afin de garantir les conditions de culture optimales pour tout échantillon incubé en même temps et éviter une contamination via l incubateur. * l aspect morphologique reste un très bon indicateur à condition de connaître l aspect «normal» de vos cellules. Par exemple la culture en présence ou en absence de MEF change la morphologie des cellules ES. la densité en culture au jour d injection doit être sub-confluente (autour de 80% de la surface de la boîte de diamètre 6 cm). La mesure de la prolifération peut être un marqueur de l état cellulaire et conditionner la colonisation des ES dans les blastocystes. la numération chromosomique : l analyse quantitative, mais aussi qualitative (caryotype), des chromosomes est importante surtout sur de nouvelles cellules ou après un nombre de passage important. Une anomalie chromosomique (en nombre et/ou de réarrangement) n empêchera pas les cellules ES de bien proliférer mais la transmission de la mutation sera compromise. Attention cependant, une numération chromosomique normale (80% d euploïdie) ne garantit pas une bonne transmission! l état de différenciation du/des clones ES : celui-ci se fait principalement «à l œil» mais il est également possible de regarder sur un échantillon l expression de la protéine oct-4 ou nanog, marqueurs de pluripotence. La présence et l activité de la phosphatase alcaline reste un bon marqueur mais le test de coloration est souvent difficile à interpréter. si le clone est fortement différencié, il est fortement recommandé de revoir les conditions de culture et de remettre l injection à plus tard. Réalisation de la prestation Le jour fixé de l injection, le client apportera dans de la glace fondante les cellules ES fraîchement dissociées et débarrassées des fibroblastes (cf. protocole fourni par le service). Le service s engage à injecter les clones sur une période de 2 mois (2 injections successives puis la/les suivantes un mois plus tard au vu des premiers résultats). En théorie, après injection de 50 blastocystes, le service devrait si tous les contrôles sont bons, obtenir au moins 3 chimères dont au moins une transmettra à la lignée germinale. En pratique, l obtention de souris chimères n est pas garantie puisque dépendante des conditions de culture des cellules ES et de leur profil. 04/01/12 - Page 7 sur 8

8 La prestation sera donc systématiquement facturée dès 50 blastocystes injectés pour une construction donnée quelque soit le nombre de chimères obtenues. La facturation prend en compte le nombre de femelles donneuses de blastocystes, de femelles porteuses, l hébergement des souris nécessaires, les consommables et réactifs, l amortissement et la maintenance des gros appareils et le nombre de jours d injection effectivement réalisés. S il n y a pas de chimères obtenues, le projet est revu pour évaluer les causes de cet échec. La poursuite ou non du projet sera décidée ensemble. Eventuellement une nouvelle prestation sera possible avec un 2 ème clone pour la même construction. En cas d obtention de chimères, celles-ci seront remises au client ou feront l objet d une autre prestation à la demande du client : accouplement avec des souris WT pour l obtention de souris hétérozygotes pour la modification génétique. 04/01/12 - Page 8 sur 8