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1 Parvo B19 IgG-ELISA medac Immunoessai enzymatique pour la détection des anticorps IgG anti Parvovirus B19 Français VP-F

2 FABRICANT medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D Hamburg DISTRIBUTION medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D Wedel Phone: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / ADRESSE DE COMMANDE Phone: ++49/ 4103 / Fax: ++49/ 4103 / Littérature: p.11 VP-F

3 Parvo B19 IgG-ELISA medac Immunoessai enzymatique pour la détection des anticorps IgG anti Parvovirus B19 Réf.: 195 DESTINEE UNIQUEMENT AU DIAGNOSTIC IN VITRO INTRODUCTION Parvovirus B19 est membre de la famille des parvoviridae. Le virus est très petit et contient un seul brin de DNA, la protéine non structurelle NS1 et un capside contenant les protéines structurelles VP1 et VP2. Les infections à parvovirus sont communes. Le plus haut taux d infection atteint 10% chez les enfants et jusqu à 50% à l âge de 30 ans. Elles apparaissent le plus souvent dans la dernière partie de l hiver et au printemps, accompagnées par des éruptions épidémiques dans les écoles et écoles maternelles. L infection est généralement transmise par voie respiratoire. Puisque le virus est présent dans le sérum des patients, il peut être transmis par le sang et les transplants. L incidence de B19 dans les banques de sang est entre 0,03 et 0,125%. Les manifestations cliniques des infections à B19 sont semblables à la plupart des infections virales systémiques. L évolution clinique des infections postnatales est relativement anodine, souvent asymptomatique chez les individus immunocompétents. Dans de nombreux cas, les patients développent un exanthème typique, appellé erythema infectiosum(fifth disease). L exanthème est décrit avec la fréquente apparition de polyarthralgies/polyarthrites comme réaction immunologique. A cause du tropisme important du B19 à infecter et détruire les cellules précurseurs sanguines, une anémie se développe qui disparaît après production des anticorps. Chez les patients ayant des désordres hémolytiques sous jacents, une immunosuppression ou des infections fétales intra-utérines pendant le second ou le troisième trimestre, l anémie peut mener à des dommages importants comme l hydrops fetalis. Habituellement, la virémie dure quatre à six jours. Pendant cette période, le patient est contagieux. Avec le kit Parvo B19 elisa IgG medac, les anticorps spécifiques Parvovirus B19 IgG peuvent être détectés au plus tard trois semaines après l infection. VP-F

4 Dans la plupart des cas les anticorps IgG persistent pour la vie et sont protecteurs contre les réinfections. Une augmentation significative du titre des anticorps IgG mesurée dans une paire de sera entre le début de l infection et au moins trois semaines plus tard est une preuve d une infection aigüe. Avantages du test Micropuits sécables permettant l'utilisation efficace du test. Pas de réactions croisées avec les virus de la rubéole et de la rougeole. L utilisation de VP1 et VP2 rend possible la reconnaissance des réponses immunes précoces et protectrices. Même des anticorps dirigés contre VP1 peuvent être détectés. Utilisable sur automate ouvert. L utilisation des antigènes recombinants VP1 et VP2 produits par le système d expression baculovirus rendent l essai hautement spécifique et sensible. En plus de la trousse Parvo B19 IgG-ELISA medac Réf.: 195 pour 96 déterminations nous livrons également Parvo B19 IgM-ELISA medac Réf.: 190 pour 96 déterminations VP-F

5 PRINCIPE DU DOSAGE Les puits sont revêtus avec des antigènes B19. Les anticorps Parvovirus B19-spécifiques se lient aux antigènes. Les anticorps anti-igg humains conjugués à la peroxidase se lient aux anticorps IgG (E = Peroxidase). Incubation avec TMB-Substrat (*). La réaction est arrêtée par l addition d acide sulfurique. L absorption est lue avec un spectrophotomètre. VP-F

6 CONTENU DE LA TROUSSE Ref.: Microplaque: 6 x 2 barrettes de 8 puits, protégées dans un sachet en aluminium (avec dessicant), sécables, recouverts d antigène de Parvovirus B19 humain recombinant, prêts à l emploi. 2. Contrôle Négatif: 1 flacon de 2 ml, sérum humain, Xn, nocif, R22, S36, contenant d azide de sodium (0,1%), prêt à l emploi. 3. Contrôle Faiblement Positif: 1 flacon de 2 ml, sérum humain, Xn, nocif, R22, S36, contenant d azide de sodium (0,1%), prêt à l emploi. 4. Contrôle Positif: 1 flacon de 2 ml, sérum humain, Xn, nocif, R22, S36, contenant d azide de sodium (0,1%), prêt à l emploi. 5. Tampon de Lavage: 1 flacon de 100 ml, PBS/Tween (10X), ph 6,9 7,3. 6. Diluant pour Échantillon: 1 flacon de 250 ml, PBS/Tween/BSA, coloré en vert, ph 6,6 7,0, prêt à l emploi. 7. Conjugué: 1 flacon de 1 ml (20X), anticorps de chèvre anti humain IgG, conjugué à HRP. 8. TMB-Substrat: 1 flacon de 20 ml, prêt à l emploi. 9. Solution d arrêt: 1 flacon de 20 ml, acide sulfurique 0,3M (H 2 SO 4 ), prêt à l emploi. 10. Support. 1. CONSERVATION ET STABILITÉ Matériel/Reactifs Etat Conservation Stabilité Trousse Non ouvert C Jusqu à la date de péremption Microplaque Ouvert C 3 mois dans le sachet avec dessicant Diluant Échantillon Ouvert C Jusqu à la date de péremption Contrôles Ouvert C Jusqu à la date de péremption Tampon de lavage Non dilué C Jusqu à la date de péremption Conjugué Dilué C 1 semaine TMB-Substrat Ouvert C Jusqu à la date de péremption Solution d arrêt Ouvert C Jusqu à la date de péremption Ne pas utiliser les réactifs après la date de péremption. VP-F

7 2. RÉACTIFS ET MATÉRIEL NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS 2.1. Eau pour injection ou bidistillée. L'utilisation d'eau désionisée n'est pas conseillée Micropipettes ajustables Récipients propres en verre ou en plastique pour la dilution du conjugué, tampon de lavage et échantillon Dispositif de lavage des microplaques (par exemple multistepper ou laveur ELISA) Lecteur de microplaque avec des filtres de 450 nm et nm. 3. PRÉPARATION DES RÉACTIFS Avant de commencer la procédure de dosage, tous les composants du kit doivent être amenés à température ambiante. Calculer le nombre de puits nécessaire. 3.1 Microplaque Le sachet d aluminium doit être refermé soigneusement avec le dessicant dès que l on a retiré les puits. La conservation et la stabilité des puits sont indiqués dans le tableau Tampon de lavage Mélanger un volume de Tampon de Lavage (10x) avec 9 volumes d eau pour injection (par ex. 50 ml de Tampon de Lavage (10x) avec 450 ml d eau). 20 ml de Tampon de Lavage dilué sont nécessaires pour 8 puits. Les cristaux dans le Tampon de Lavage doivent être dissous par chauffage( max.37 C) et/ou par agitation à température ambiante Conjugué Mélanger un volume de Conjugué (20X) avec 19 volumes de diluant pour échantillon (par ex. 40 µl de Conjugué avec 760 µl de Diluant pour Échantillon). 800 µl de Conjugué, prêts à l emploi, sont nécessaires pour 8 puits. Après dilution le conjugué est coloré en vert et prêt à l emploi. Ne pas mélanger des réactifs de différents lots ou fabricants. Des résultats valides et reproductibles sont seulement obtenus si la procédure de test est suivie avec précision et si les réactifs spécifiques du kit sont utilisés. VP-F

8 4. ECHANTILLONS 4.1. Le test convient pour des échantillons sériques ou de plasma Le pré-traitement du sérum ou du plasma, par ex. inactivation, n est pas nécessaire. Cependant, ils ne doivent jamais être contaminés avec des microorganismes ou contenir des globules rouges Les échantillons de sérum ou de plasma doivent être dilués 1:200 avec le diluant pour échantillon. Pour la détermination du titre, les échantillons peuvent être dilués davantage. 5.A. PROCÉDURE DE DOSAGE 5.1. Couper le sachet aluminium et extraire le nombre de puits nécessaire( voir 3.1.). Les puits sont prêts à l emploi et ne doivent pas être prélavés Laisser le puit A1 vide comme blanc (voir 6.A.). Distribuer 100µl de chaque échantillon dilué. Distribuer 100 µl de Contrôle Négatif, Faiblement Positif (en double) et Positif dans les puits Incuber les puits pendant 60 min (± 2 min) de 18 C à 25 C dans une chambre humide ou recouverts d un film pour incubation Diluer le conjugué( voir 3.3.) Après incubation, laver les puits trois fois avec 200 µl de Tampon de Lavage par puit. Vérifier que tous les puits soient remplis. Après lavage tapoter les puits sur du papier absorbant. Ne pas laisser sècher les puits! Poursuivre immédiatement la procédure! 5.6. Ajouter 100 µl de conjugué à chaque puit (excepté A1) Incuber à nouveau pendant 60 min (± 2 min) entre 18 C et 25 C dans une chambre humide ou recouvrir avec un film pour incubation Après incubation, laver les puits 5 fois (voir 5.5.) Ajouter 100 µl de TMB-Substrat à tous les puits (également A1) et incuber pendant 30 min (± 2 min) entre 18 C et 25 C dans l obscurité. Les échantillons positifs deviennent bleus. VP-F

9 5.10. Stopper la réaction en ajoutant 100 µl de Solution d arrêt (acide sulfurique 0,3M) à tous les puits(également A1). Les échantillons positifs deviennent jaunes. Bien nettoyer le dessous des puits avant la lecture photométrique et prendre soin à ce qu il n y ait pas de bulles dans les puits. La lecture doit être faite endéant les 15 minutes après avoir ajouté la solution d arrêt! 5.B. TABLEAU DE DISTRIBUTION DES RÉACTIFS Parvo B19 IgG-ELISA medac Blanc (A1) Contrôle Négatif Contrôle Faiblem. Positif Contrôle Positif Echantillon Contrôle Négatif µl Contrôle Faiblement Positif µl - - Contrôle Positif µl - Echantillon µl Incuber pendant 60 minutes entre 18 C et 25 C, laver 3X avec 200 µl de tampon de lavage. Conjugué µl 100 µl 100 µl 100 µl Incuber pendant 60 minutes entre 18 C et 25 C, laver 5X avec 200µl de tampon de lavage. TMB-Substrat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incuber pendant 30 minutes entre 18 C et 25 C dans l obscurité. Solution d arrêt 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Lecture photométrique à 450 nm (Réf nm) VP-F

10 6.A. CALCUL DES RÉSULTATS (VALIDITÉ) * Lire les valeurs de D.O. à 450 nm (longueur d onde de référence nm). * Soustraire la valeur moyenne de D.O. du blanc (puit A1) de toutes les autres valeurs de D.O. * Calculer la valeur moyenne de D.O. du Contrôle Faiblement Positif. Les valeurs individuelles de D.O. ne doivent pas différer de plus de 20% de la valeur moyenne. La valeur moyenne de D.O. du Contrôle Faiblement Positif doit être supérieure à 0,15 et inférieure à 0,6. Le rapport D.O.Contrôle Négatif doit être < 0,6. D.O.Contrôle Faiblement Positif Le rapport D.O. Contrôle Positif doit être > 1,5. D.O.Contrôle Faiblement Positif * Index d anticorps IgG = D.O.échantillon de patient D.O.Contrôle Faiblement Positif 6.B. INTERPRETATION DES RESULTATS IgG Index d anticorps Interprétation 1,00 positif < 0,80 négatif 0,80 et < 1,00 equivoque Les échantillons ayant un résultat équivoque doivent être retestés avec un spécimen prélevé 14 jours plus tard de manière à déterminer un changement de titre. Les résultats doivent toujours être interprétés en relation avec les données cliniques et des paramètres cliniques complémentaires. VP-F

11 7. CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES Les performances du dosage ont été déterminées pendant l évaluation de la trousse. 7.A. SENSIBILITÉ ET SPÉCIFICITÉ 88 sera de patients ont été mesurés avec le kit Parvo B19 IgG- ELISA medac en comparaison avec une technique interne à très haute spécificité dans un institut de référence. Test de référence negatifs positifs Parvo B19 IgG-ELISA medac négatifs 38 0 positifs 0 50 Sensibilité = 100 % Spécificité = 100 % Valeur prédictive positive = 100 % Valeur prédictive négative = 100 % 191 sera de patients infectés ou non par Parvovirus B19 ont été mesurés dans une seconde étude clinique. Les résultats obtenus sont montrés sur le tableau ci-dessous. Maladie Echantillons Positifs Négatifs Erythema Infectiosum Crise Aplastic Non infectés Sensibilité = 99,1 % Spécificité = 100 % Valeur prédictive positive = 100 % Valeur prédictive négative = 98,9 % VP-F

12 7.B. PRECISION Echantillotillon Variation Intra-essai Echan- Variation Inter-essai D.O. SD CV(%) n D.O. SD CV(%) n CN 0,039 0,004 10,5 60 CN 0,033 0,001 3,8 3 CFP 0,241 0,011 4,7 60 CFP 0,224 0,017 7,7 3 CP 1,845 0,021 1,2 60 CP 1,496 0,039 2, ,515 0,020 3, ,448 0,053 11, ,084 0,044 4, ,124 0,063 5, ,783 0,047 2, ,789 0,065 3,7 15 CN = Contrôle Négatif; CFP = Contrôle Faiblement Positif; CP = Contrôle Positif. INDICATIONS GÉNÉRALES * Ne pas échanger les flacons et leurs bouchons pour éviter les contaminations croisées. * Les flacons des réactifs doivent être refermés immédiatement après leur utilisation pour éviter l'évaporation et la contamination microbienne. * Après emploi, les réactifs doivent être conservés comme indiqué pour garantir leur durée de vie. * Après leur utilisation, conserver tous les composants de la trousse dans leur emballage d'origine, afin d'éviter le mélange des réactifs concernant d'autres techniques de dosage ou d'autres lots (voir aussi 3.). PRECAUTIONS D'EMPLOI * Il faut appliquer la réglementation en vigueur en matière de sécurité et de santé. * Les réactifs d'origine humaine ont été dosés et trouvés négatifs en AgHBs, en anticorps anti-hiv-1/2 et anti-vhc. Néanmoins, il est fortement conseillé de manipuler ces produits, ainsi que ceux d'origine animale (voir contenu de la trousse), comme étant potentiellement infectieux et de les utiliser avec les précautions nécessaires. R 22: Nocif en cas d ingestion. S 36: Porter un vêtement de protection approprié. VP-F

13 CONSEIL D'ELIMINATION Les résidus des produits chimiques et des préparations sont considérés en général comme des déchets dangereux. L'élimination de ce type de déchets doit se faire selon la réglementation en vigueur. Il faut consulter les organismes agréés pour connaître le moyen de se débarrasser des déchets. LITTÉRATURE/RÉFÉRENCES Brown, K.E.: Human Parvovirus B19 Epidemiology and Clinical Manifestations, in: Human Parvovirus B19. Monogr. Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Brown, K.E. und Young, N.S.: Human Parvovirus B19: Pathogenesis of Disease, in: Human Parvovirus B19. Monogr. Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Erdman, D.D.: Human Parvovirus B19: Laboratory Diagnosis, in: Human Parvovirus B19. Monogr.Virol. Basel, Karger Verlag, 20, (1997). Frickhofen N., Abkowitz J.L., Safford M., et al. Persistent B19 Parvovirus infection in patients infected with Human Immuno-deficiency Virus type 1 (HIV-1): a treatable cause of anemia in AIDS. Ann. Int. Med. 113, (1990). Jäger, G.R. und Schwarz, T.F.: Hämatologische Bedeutung der Parvovirus B19-Infektion. Die gelben Hefte 34, (1994). Kurtzmann, G.J., Cohen B., Meyers P., Amunullah A., Young NS. Persistent B19 parvovirus infection as a cause of severe chronic anaemia in children with acute lymphocytic leukaemia. Lancet 2, (1988). Modrow, S., Hemauer, A., Gigler, A. Die Parvovirus B19-Infektion, Die gelben Hefte 38 (26), (1998). Prowse, C., Ludlam, C.A. und Yap, P.L.: Human Parvovirus B19 and Blood Products. Vox. Sang. 72, 1-10 (1997). Roggendorf, H. und Roggendorf, M.: Humanes Parvovirus B19, in: Diagnostische Bibliothek, Bd. 1, Virusdiagnostik, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschafts-Verlag, (1996). VP-F

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